Name: O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a isolar endosporos bacterianos de amostras ambientais por lise seletiva de células vegetativas. Este método não destrutivo permite estudos de cultivo, quantificação e testes metabólicos subsequentes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem o Swiss National Science Foundation para Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 e nº 151948, e Fundação Pierre Mercier pour la Science.

1. Preparação de produtos químicos e equipamentos <ol><li> Adicione 500 ml de um 1% de hexametafosfato de sódio (SHMP) (NaPO3) n solução e esterilizar em autoclave. </li><li> Esterilizar de nitrocelulose (NC) (filtros de tamanho de poro de 0,22 um, 47 mm diâmetro) em autoclave de vidro em placas de Petri fechada. </li><li> Esterilizar filtros NC (dimensão do poro de 0,22 um, 25 mm de diâmetro) em autoclave de vidro em placas de Petri fechada. </li><li> Pesar e anotar o peso vazio da estéreis tubos de 50 ml (com tampa em) (um tubo por amostra). </li><li> Prepare de Tris-EDTA-tampão (tampão TE) 1x: preparar uma solução de Tris 10 mM (tris (hidroximetil) aminometano) e tampão de EDTA 1 mM. Ajustar o pH para 8 e esterilizar em autoclave. </li><li> Preparar solução de lisozima (20 mg / ml) por dissolução de 0,02 g de lisozima em 1 ml de tampão TE. Idealmente, fazer fresco o tempo todo. Armazenar a 4 ° C durante não mais de uma semana. </li><li> Preparar solução fisiológica por dissolução de cloreto de sódio 8 g / L(NaCl) em água destilada. Esterilizar em autoclave. </li></ol> 2. Separação de Biomassa de Sedimentos <ol><li> Adicionar 3 g de amostra de sedimento para pré-pesado estéril tubos de 50 ml usando colheres de metal inflamado a etanol. Execute isso em um, UV esterilizado gabinete de biossegurança limpo para evitar a contaminação. </li><li> Adicionar 15 ml de uma solução estéril (autoclavada) solução SHMP 1% para a amostra usando uma bureta graduada estéril. O SHMP solução também pode ser filtrada para evitar a contaminação. </li><li> Homogeneizar o sedimento e SHMP solução com um dispersor líquido / homogeneizador (por exemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). 70% de etanol em autoclave ou esterilizar o rotor dispersão antes da utilização. Executar a homogeneização durante 1 minuto a 17.500 rpm. Deixe o resto da amostra durante 2 minutos e repetir a homogeneização durante 1 min à mesma velocidade do rotor. </li><li> Deixe a amostra repousar durante 10 min. Neste passo, as partículas mais pesadas (minerais) vai assentar. As células e os componentes orgânicos da amostra no entanto Wdoentes permanecem em solução. Em seguida, transferir a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) para um tubo limpo 50 ml, enquanto tomando cuidado para não perturbar o pellet sedimento. </li><li> Para o sedimento sedimentos adicionar novamente 15 ml de uma (autoclavada) solução SHMP 1% estéril usando um estéril bureta graduada. Em seguida, repita os passos 2.3 e 2.4. Esta repetição assegura a separação da quantidade máxima de células e partículas orgânicas do componente mineral do sedimento. O sobrenadante desta segunda separação pode ser mesclado com o sobrenadante da primeira separação. Nota: Todos os passos seguintes são feitas no sobrenadante (contendo biomassa celular). O componente mineral (sedimento sedimento) pode ser descartado. </li><li> Centrifugar a amostra a 20 xg durante 1 min. Esta etapa aumenta o g-força suficiente para resolver partículas minerais pequenas enquanto o material biológico celular ainda permanece em solução. Após centrifugação, transferir a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) numlimpo tubo de 50 ml. Descartar o sedimento mineral. </li><li> Determinar o volume final da solução contendo biomassa por pesagem da amostra. A determinação do peso evita a necessidade de transferir a amostra para um cilindro graduado e reduz o risco de contaminação. </li></ol> 3. Cobrança de Biomassa no filtro de membrana <ol><li> Prepare unidade de filtração (por 47 mm de diâmetro membranas) e bomba de vácuo. Esterilizar a unidade de filtração quer por autoclavagem ou (se vidro Pyrex) por aspersão com etanol a 70% e em chamas com um bico de Bunsen. Deixe-o esfriar antes de continuar com o protocolo. </li><li> Adicionar membrana NC estéril para a unidade de filtração usando uma pinça esterilizados inflamado a etanol. </li><li> Adicionar metade da amostra de sobrenadante (a partir do passo 2.6) para a unidade de filtração por membrana e recolher as células sobre a membrana usando a bomba de vácuo. </li><li> Quando o líquido tiver totalmente passado através do filtro, parar a bomba de vácuo e cuidadosamente remover a membrana utilizando etanol-chama fórceps esterilizado. Colocar a membrana em uma placa de Petri esterilizada. <ol><li> Corte a membrana ao meio com uma tesoura esterilizada inflamado a etanol. Adicionar cada metade da membrana para um tubo separado de 2 ml. Uma metade da membrana vai ser utilizado para a extracção do ADN e análise de toda a comunidade bacteriana. A outra metade do filtro vai ser armazenado a -80 ° C e serve como uma cópia de segurança. </li></ol></li><li> Coloque nova membrana de NC para a unidade de filtração e recolha de biomassa a partir da segunda metade do volume da amostra (a partir do passo 2.6), utilizando a bomba de vácuo. </li><li> Quando o líquido está totalmente passou através do filtro, parar a bomba de vácuo e retire cuidadosamente a membrana com a pinça esterilizados inflamado a etanol. Coloque toda a membrana, para um tubo separado de 2 ml. Este exemplo vai ser utilizada para o tratamento de separar os esporos a partir de células vegetativas. A amostra pode ser armazenada a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 4. Lise de células vegetativas <ol><li> Execute otratamento para separar endosporos de células vegetativas da biomassa previamente recolhidas numa membrana de NC (passo 3.6). <ol><li> Se a membrana foi congelado, deixá-lo à TA durante 10 min para descongelar. Em seguida, coloque a membrana em uma placa de Petri estéril e cortá-la (aproximadamente 4 vezes) em pequenos pedaços com uma tesoura esterilizada inflamado a etanol. Em seguida, coloque todas as peças filtro de membrana em um tubo estéril 2 ml. </li></ol></li><li> Adicionar 900 ul de 1x TE (Tris-EDTA) tampão (ver 1.5) para o tubo contendo a amostra de membrana e homogeneiza-se por vortex. Neste passo, a biomassa é removida a partir da membrana para a solução de tampão TE. </li><li> Colocar o tubo em uma incubadora a 65 ° C durante 10 min e 80 rpm. Depois retire o tubo da incubadora e deixe-o esfriar por 15 min. </li><li> Adiciona-se 100 ul de lisozima preparada de fresco (ver 1.5) para atingir uma concentração final de 2 mg / ml. Não adicione a lisozima antes de a amostra ter arrefecido até 37 ° C, pois isso poderia degRade a enzima. </li><li> Incubar a amostra a 37 ° C durante 60 min e 80 rpm, as condições óptimas para a lisozima para lisar as células vegetativas. </li><li> Após a lise estar completa, adicionar 250 ul de 3 N de hidróxido de sódio (NaOH) e 250 uL de solução a 6% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) para a amostra. Ao adicionar este, o volume da amostra atinge 1,5 ml e há uma concentração final de NaOH 0,5 N e a concentração final de 1% de SDS. </li><li> Incubar esta mistura à TA durante 60 min e 80 rpm. Adicionando a base e detergentes vai ajudar na lise celular final. A concentração destes detergentes foi otimizado para não prejudicar os endospores, enquanto lisar células vegetativas. </li><li> Prepara-se uma unidade de filtração estéril, que contém as membranas 25 mm de diâmetro por autoclavagem, ou (se vidro Pyrex) pulverizando-o com etanol a 70% e em chamas com um bico de Bunsen. Deixe-o esfriar. </li><li> Coloque uma membrana NC 0,2 m (25 mm de diâmetro) na unidade de filtração usando uma pinça etanol chama-esterilizados. &lt;/ li&gt; <li> Adicionar a amostra a partir do passo 4.7 sobre a membrana e filtrar o líquido através da bomba de vácuo. Quando o líquido passou por, desligar a bomba de vácuo. Neste passo, o material de célula vegetativa lisadas é removido, uma vez que não é retida na membrana. Apenas endospores permanecerá na membrana. </li><li> Adicionar 2 ml de solução fisiológica estéril para lavar detergentes residuais e filtrar o líquido através da bomba de vácuo. </li><li> Quando o líquido foi totalmente filtrado, desligar a bomba de vácuo. Deixar a membrana da unidade de filtração. </li></ol> 5. O tratamento DNase Nota: realizar o tratamento com DNase directamente na membrana de filtro. É importante que a unidade de filtração não se escapa e a bomba de vácuo é desligada. <ol><li> Adicionar 450 uL de água estéril, 50 ul de tampão de reacção de ADNase (1x) e 0,5 ul de enzima ADNase directamente sobre a membrana de filtro e deixar repousar durante 15 min. Se possível, fazer isso digestão em uma sala que é ligeiramente guerramer que a média RT, uma vez que a enzima funciona melhor a temperaturas de 25 ° C e acima. Nota: Mantendo o bico de Bunsen de lado da unidade de filtração também aumenta a temperatura e tem o benefício adicional de manter o ambiente estéril, por conseguinte, um risco reduzido de contaminação das amostras. </li><li> Quando a digestão de DNase é acabado, em vez da bomba de vácuo para remover o enzima a partir da amostra. </li><li> Lavar enzimática residual por filtragem e adicionando 1 ml de solução fisiológica. </li><li> Se algum líquido tiver passado completamente, desligar a bomba de vácuo e remover a membrana de filtro endosporulante usando uma pinça estéril e colocá-lo em uma placa de Petri estéril. Nota: A amostra de endospores separados está agora pronto para análise a jusante. Armazenar a -20 ° C quando é usado para a extracção de ADN ou, alternativamente, a 4 ° C quando é usado para a germinação e cultivo. </li></ol>

<ol><li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li>
<li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li>
<li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America%27s+Largest+Hot+Spring%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li>
<li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li>
<li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G%2BC+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+%28Firmicutes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li>
<li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRicca%2C+E+%22Bacterial+spore+formers%3A+probiotics+and+emerging+applications%22">Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications</a>. , Horizon Bioscience. (2004).</li>
<li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li>
<li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil%2C+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li>
<li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281(2011).</li>
<li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiol+J%22%5BJournal%5D)">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li>
<li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li>
<li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li>
<li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li>
<li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li>
<li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li>
<li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene%2C+spo0A.%2C+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li>
<li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li>
<li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils%3A+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A resistência de endósporos a factores físico-químicos agressivos externos (por exemplo, temperatura ou detergentes) foi utilizado para conceber um método para separar os esporos bacterianos a partir de células vegetativas em amostras ambientais. Este é o primeiro método global para isolar os esporos a partir de amostras ambientais de uma maneira não destrutiva. Os métodos anteriores para quantificar, detectar e analisar os esporos foram em amostras com base na medição de proxies específicos para endosporos, ta...

O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a separação de esporos bacterianos, a partir de células bacterianas vegetativas em amostras ambientais. A formação de esporos bacterianos é uma estratégia de sobrevivência, geralmente desencadeado pela inanição, encontrado num número de grupos de bactérias pertencentes ao filo Firmicutes 1. Bactérias formadoras de Endospore são bem estudadas, principalmente porque um número de cepas são agentes patogênicos e, portanto, de importância médica (por exemplo, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Estirpes ambientais de bactérias formadoras de endospore foram isolados a partir de praticamente qualquer ambiente (solo, água, sedimentos, o ar, gelo, intestino humano, animais intestino, e mais) 1-3. Portanto, Firmicutes são a segunda filo mais abundante em coleções de cultura 4. Por causa de suas proteínas córtex externo e do núcleo de protecção resistentes, endospores podem sobreviver a condições ambientais extremas que vão from dessecação à alta radiação, temperaturas extremas e produtos químicos prejudiciais 5. Este notável resistência torna-se um desafio para extrair DNA de endósporos 6-8. Isso provavelmente explica por que eles têm sido negligenciados nos estudos de sequenciamento ambiental 9,10. Outros métodos, tais como a concentração de endósporos em amostras ambientais por anticorpos fluorescentes 11, a quantificação de ácido dipicolínico (DPA) no solo e nos sedimentos 13 12, por citometria de fluxo 14 ou a pasteurização e cultivo subsequente 15,16 têm sido usados ​​para obter ou quantificar em endosporos amostras ambientais. Em anos recentes, os métodos de extracção de ADN optimizada, bem como iniciadores moleculares específicos para sequências alvo específicas do gene endospore foram desenvolvidos 10,17-20. Isto tem ajudado a revelar mais biodiversidade entre este grupo de bactérias e 21 também levou a aplicações na indústria e medicina para a detecção de endospores, Por exemplo, em leite em pó 19. O protocolo aqui apresentado é baseado na diferença em resistência às condições físico-químicas prejudiciais (tais como o calor e detergentes) de endosporos bacterianos relativos a células vegetativas. Para destruir as células vegetativas em uma amostra, consecutivamente aplicar calor, lisozima e baixas concentrações de detergentes. O tempo e a força destes tratamentos foram optimizadas de forma a não destruir os esporos, mas de lisar todas as células vegetativas. Algumas células em uma piscina de células ambiental são mais resistentes do que outros, por isso, a fim de aumentar a probabilidade de destruir todas as células vegetativas, aplicamos três tratamentos diferentes. A novidade e vantagens deste método é que os endosporos após o tratamento ainda estão intactas e podem ser utilizados para outras análises a jusante. Estes incluem a extração de DNA, PCR quantitativo (qPCR) e amplicon ou seqüenciamento metagenomic (visando especificamente o grupo de endospores e, assim, reduzindo diversity, enquanto o aumento da cobertura). Os endosporos também poderia ser utilizada para o cultivo ou a jusante quantificação por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, ou a detecção de DPA. Uma característica importante deste método é que, ao comparar uma amostra não tratada com uma amostra tratada, pode-se deduzir a quantidade e diversidade de endósporos em uma amostra ambiental, além do componente que corresponde a células vegetativas.

<table><tbody><tr><td>Filtros de membrana de nitrocelulose Whatman, 0,2 &#956; m tamanho do poro, diâmetro de 47 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 60-00-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Lisozima de clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 Fluka</td><td>em pó, CAS&nbsp; 12650-88-3&nbsp;</td></tr><tr><td>Homogeneizador Ultra-Turrax T18 básico</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>Suportes de filtro de vidro para 47&nbsp; mm membranas, vidro Pyrex</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo para serviço químico</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 Hz</td></tr><tr><td>Filtração de amostragem em coletor para 25&nbsp; mm membranas</td><td>Millipore</td><td>1225 Coletor de Amostragem</td><td>polipropileno</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>NaOH livre de Rnase</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 1310-73-2&nbsp;</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de membrana de nitrocelulose Whatman, 0,2 &#956; m tamanho do poro, 25 mm de diâmetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182002 Aldrich</td><td></td></tr></tbody></table>

o isolamento físico do endospores de amostras ambientais por alvejado lise de células vegetativas

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

A formação de endósporos é uma estratégia de sobrevivência encontrada entre algumas bactérias do filo Firmicutes. Durante a formação do endósporo, essas bactérias entram em um estado morfofisiológico de repouso que aumenta a sobrevivência em condições ambientais adversas. Embora os Firmicutes formadores de endósporos sejam um dos grupos bacterianos mais frequentemente enriquecidos e isolados em estudos de cultura, eles geralmente estão ausentes dos estudos de diversidade baseados em métodos moleculares. A resistência do núcleo do esporo é considerada um dos fatores que limitam a recuperação do DNA dos endósporos. Desenvolvemos um método que aproveita a maior resistência dos endósporos para separá-los de outras células em uma comunidade microbiana complexa usando métodos de lise física, enzimática e química. A preparação somente de endósporo assim obtida pode ser usada para recultura ou para realizar análises a jusante, como extração de DNA personalizada otimizada para endósporos e sequenciamento de DNA subsequente. Este método, aplicado a amostras de sedimentos, permitiu o enriquecimento de endósporos e, após sequenciamento, revelou uma grande diversidade de formadores de endósporos em sedimentos lacustres de água doce. Esperamos que a aplicação deste método a outras amostras produza um resultado semelhante.

Os resultados aqui apresentados foram publicados anteriormente 10,21. Por favor, consulte os artigos para a interpretação ambiental e discussão dos dados. O processo global está resumida na Figura 1 e corresponde a três passos principais: em primeiro lugar, a separação da biomassa a partir de sedimentos ou qualquer outra matriz ambiental; Em segundo lugar, a destruição de células vegetativas; e em terceiro lugar, a análise a jusante dos endosporos...

Um método para destacar endósporos bacterianos de comunidades microbianas complexas foi desenvolvido para realizar estudos moleculares ou de cultura personalizados desse grupo de bactérias.

O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

O objetivo geral deste procedimento é separar endósporos bacterianos de amostras complexas de comunidades microbianas, como sedimentos. Este método ajuda a responder perguntas fundamentais na área de microbiologia sobre a presença e abundância de endósporos em amostras naturais. Baseia-se na diferença de resistência entre endósporos e células vegetativas frente a produtos químicos e calor. A principal vantagem desta técnica é que o método não é destrutivo para os endósporos, permitindo que sejam utilizados em experimentos subsequentes, como cultivo, quantificação e testes metabólicos.Embora tenhamos desenvolvido este método para funcionar com a ecologia de bactérias formadoras de endósporos, ele também pode ser utilizado em áreas como a exobiologia ou a indústria alimentícia, nas quais esporos podem ser benéficos ou prejudiciais. Após preparar as soluções e o equipamento de acordo com o protocolo descrito, sob uma cabine de segurança biológica esterilizada com UV, utilize colheres metálicas flamejadas com etanol para adicionar três gramas da amostra de sedimento a tubos estéreis de 50 mililitros previamente pesados. Usando uma bureta graduada e estéril, adicione 15 mililitros de uma solução estéril e filtrada de hexametafosfato de sódio a 1%, ou solução SHMP, à amostra.Com um dispersor líquido ou homogeneizador e um rotor de dispersão estéril, homogeneíze a amostra a 17.500 rpm por um minuto. Deixe a amostra repousar por dois minutos e repita a homogeneização. Deixe a amostra repousar por 10 minutos para que as partículas mais pesadas sedimentem.Transfira o sobrenatante contendo a biomassa celular para um tubo limpo de 50 mililitros, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Adicione outro alíquota de 15 mililitros de SHMP ao pellet sedimentado e repita a homogeneização antes de coletar o sobrenatante e combiná-lo com o primeiro alíquota. Centrifugue a amostra a 20 vezes G durante um minuto e transfira o sobrenatante para um tubo fresco de 50 mililitros antes de descartar o pellet.Uma vez que a unidade de filtração e a bomba de vácuo tenham sido preparadas de acordo com o protocolo descrito no texto, use chama de etanol para esterilizar a pinça e adicionar a membrana de nitrocelulose estéril à unidade de filtração. Adicione metade da amostra de sobrenadante recém-preparada à unidade de filtração por membrana e use a bomba de vácuo para recolher as células na membrana. Quando o líquido tiver passado completamente através do filtro, pare a bomba de vácuo.Use pin&ccedil;as esterilizadas para remover cuidadosamente a membrana e coloc&aacute;-la em uma placa de Petri est&eacute;ril. Com um novo peda&ccedil;o de membrana est&eacute;ril, repita a filtra&ccedil;&atilde;o com a metade restante da solu&ccedil;&atilde;o. Para separar end&oacute;sporos de c&eacute;lulas vegetativas na biomassa rec&eacute;m-coletada, descongele a membrana caso tenha sido congelada e use tesoura esterilizada em chama de etanol para cort&aacute;-la em peda&ccedil;os menores.Transfira os pedaços da membrana para um tubo estéril de dois mililitros e adicione 900 microlitros de tampão TE 1X. Misture bem por vortexagem para liberar a biomassa da membrana. Incube o tubo a 65 graus Celsius e 80 RPM por 10 minutos.Em seguida, retire o tubo do incubador e deixe esfriar por 15 minutos. Adicione 100 microlitros de lisozima recém-preparada para uma concentração final de dois miligramas por mililitro e incube a amostra a 37 graus Celsius e 80 RPM por 60 minutos para lisar as células vegetativas. Após a conclusão da lise, adicione 250 microlitros de hidróxido de sódio 3 normal e 250 microlitros de solução de SDS a 6% à amostra.Incube em temperatura ambiente e 80 RPM por 60 minutos. Em seguida, prepare uma unidade de filtração estéril que acomode membranas de 25 milímetros de diâmetro por autoclavagem. Após o resfriamento da unidade de filtração, coloque uma membrana de nitrocelulose de 0,2 micrômetro e 25 milímetros de diâmetro sobre ela.Adicione a amostra à membrana e use a bomba de vácuo para filtrar o líquido, retendo as endósporas na membrana, enquanto o material das células vegetativas passa através dela. Para remover detergentes residuais, adicione dois mililitros de solução fisiológica estéril à membrana e aplique a bomba de vácuo. Quando o líquido for completamente filtrado, desligue a bomba e deixe a membrana na unidade de filtração.Para realizar o tratamento com DNase diretamente na membrana, adicione 450 microlitros de água estéril, 50 microlitros de tampão de reação de DNase 1X e 0,5 microlitros de enzima DNase sobre a membrana e deixe em repouso a aproximadamente 25 graus Celsius por 15 minutos. O DNA extracelular previamente liberado de células lisadas é digerido enzimaticamente e depois removido por lavagem. Isso garante que a preparação final de endósporos esteja livre de DNA externo, o que é essencial para análises posteriores, como análises moleculares.É importante lembrar que não deve haver vazamentos no aparelho de filtração e que a amostra não deve secar. Após a incubação, adicione um mililitro de solução fisiológica e ligue a bomba para remover o enzima residual da amostra. Use pinças estéreis para transferir a membrana contendo esporos para uma placa de Petri estéril.Analisar a amostra de acordo com o protocolo descrito no texto. O protocolo demonstrado neste vídeo de lise direcionada de células vegetativas resulta em uma amostra purificada de endósporos e um aumento significativo na fração de firmicutes formadores de endósporos. Em sequenciamento de amplicons do gene do RNA ribossomal 16S, as firmicutes em amostras não tratadas correspondem a apenas 8% a 19% das sequências.Em contraste, após o tratamento, firmicutes representaram 90,6% e 83,9% da amostra rica em endósporos. As duas principais ordens de firmicutes formadoras de endósporos, bacillales e clostridiales, foram enriquecidas, enquanto firmicutes não formadoras de endósporos, como lactobacillales, estavam ausentes. A eficiência do tratamento também foi demonstrada utilizando culturas puras.Uma preparação de endósporos e um cultivo de células vegetativas foram tratados, todas as células foram incubadas e o crescimento foi medido por densidade óptica em 600 nanômetros. Como mostrado aqui, observou-se crescimento nos cultivos de endósporos, enquanto nenhum crescimento foi observado no cultivo tratado de E. coli, indicando que as células vegetativas foram irreversivelmente danificadas. Uma vez dominada, e se as soluções e equipamentos já tiverem sido preparados previamente, esta técnica deve ser realizada em cerca de cinco horas.É importante lembrar de evitar toda contaminação trabalhando em condições estéreis e garantindo a esterilidade das soluções e de todo o equipamento. Após este procedimento, outros métodos como cultivo, isolamento e testes metabólicos podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a identificação da linhagem e o potencial metabólico de endósporos. Além disso, pode-se realizar extração de DNA e sequenciamento metagenômico para analisar a diversidade de espécies e a presença de genes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como separar endósporos de amostras ambientais. Não se esqueça de que trabalhar com detergentes como o SDS pode ser extremamente perigoso. Lembre-se de usar equipamentos de proteção individual.

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Fonte: Schlimpert, S., et al. Imagem de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida completo de S. venezuelae usando um dispositivo microfluídico. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o cultivo e isolamento de esporos de Streptomyces venezuelae. Os esporos, células dormentes que ajudam as bactérias a sobreviver ao estresse, são produzidos durante a limitação de nutrientes e coletados por centrifugação. O método garante uma suspensão de esporos pura e armazenada a frio para aplicações a...

 Preparação e isolamento de esporos de Streptomyces venezuelae de uma cultura líquida 

Fonte: Wunderlin, T., et al. Isolamento físico de endosporos de amostras ambientais por lise direcionada de células vegetativas. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um método para isolar endosporos de uma amostra ambiental contendo tanto células vegetativas quanto várias bactérias. O procedimento envolve filtração, perturbação mecânica e tratamento químico seletivo para enfraquecer e lisar células vegetativas enquanto preserva os endósporos. A etapa final isola os endosporos resilientes por...

Isolamento de Endosporos de uma Amostra Ambiental por Lise Direcionada de Células Vegetativas 

Aqui, descrevemos um ensaio colorimétrico para detectar a presença de açúcares redutores durante a germinação de esporos bacterianos.

Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

Este protocolo ilustra as etapas consecutivas importantes, necessárias para avaliar a pertinência de monitoramento parâmetro de vitalidade e os processos de reparação do DNA em reviving esporos de Bacillus subtilis após o tratamento com plasma de baixa pressão de tracking proteínas através do tempo-resolvido microscopia confocal e microscopia eletrônica de reparo de DNA marcado com fluorescência.

Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

Fungos causam muitas doenças agrícolas devastadores. Eles estão dispersos como teliospores latentes que germinam em resposta aos sinais ambientais. Nós esboçamos dois métodos para investigar mudanças moleculares durante a germinação: aumento da respiração para detectar ativação metabólica de medição e avaliar alterar eventos moleculares isolando teliospores em fases morfológicas distintas.

Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

Cluster de proteínas do receptor germinant em 'germinosomes' na membrana interna dos esporos de Bacillus subtilis . Descreveremos um protocolo usando proteínas de repórter de microscopia e fluorescente super resolução para visualizar germinosomes. O protocolo também identifica domínios de membrana interna de esporo que preferencialmente são corados com o corante de membrana FM4-64.

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

O método EPA 1615 usa um filtro eletropositivo para concentrar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. Este manuscrito descreve o procedimento de coleta de amostras para análises do Método 1615.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

Aprenda a isolar endosporos bacterianos de amostras ambientais por lise seletiva de células vegetativas. Este método não destrutivo permite estudos de cultivo, quantificação e testes metabólicos subsequentes.

O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

Explorar mais vídeos