O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

O objetivo geral deste procedimento é separar os endósporos bacterianos de amostras complexas da comunidade microbiana, como sedimentos Este método ajuda a responder a questões-chave no campo da microbiologia sobre a presença e abundância de endósporos em amostras naturais. Baseia-se em uma diferença de resistência entre endósporos e células vegetativas a produtos químicos e calor. A principal vantagem dessa técnica é que o método não é destrutivo para os endósporos, de modo que eles podem ser usados para experimentos a jusante, como cultivo, quantificação e testes metabólicos.

Embora tenhamos projetado este método para trabalhar com a ecologia de bactérias formadoras de endósporos, ele também pode ser usado em campos como exobiologia ou indústria alimentícia, nos quais os esporos podem ser benéficos ou prejudiciais. Depois de preparar as soluções e equipamentos de acordo com o protocolo de texto, sob um gabinete de biossegurança esterilizado por UV, use colheres de metal inflamadas com etanol para adicionar três gramas de amostra de sedimento a tubos pré-pesados e estéreis de 50 mililitros. Usando uma bureta graduada estéril, adicione 15 mililitros de uma solução estéril filtrada de hexametafosfato de sódio a 1% ou SHMP à amostra.

Com um dispersor ou homogeneizador líquido e um rotor de dispersão estéril, homogeneizar a amostra a 17.500 RPM por um minuto. Deixe a amostra descansar por dois minutos e repita a homogeneização. Deixe a amostra descansar por 10 minutos para que as partículas mais pesadas assentem.

Transferir o sobrenadante que contém a biomassa celular para um tubo limpo de 50 mililitros, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento. Adicionar mais 15 mililitros de alíquota de SHMP ao sedimento Centrifugar a amostra a 20 vezes G durante um minuto e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 mililitros antes de rejeitar o sedimento.

Uma vez que a unidade de filtração e a bomba de vácuo tenham sido preparadas de acordo com o protocolo de texto, use chama de etanol para esterilizar a pinça para adicionar membrana de nitrocelulose estéril à unidade de filtração. Adicione metade da amostra sobrenadante recém-preparada na unidade de filtração por membrana e use a bomba de vácuo para coletar as células da membrana. Quando o líquido tiver passado totalmente pelo filtro, pare a bomba de vácuo.

Use uma pinça esterilizada para remover cuidadosamente a membrana e colocá-la em uma placa de Petri estéril. Com um novo pedaço de membrana estéril, repita a filtração com a metade restante da solução. Para separar os endósporos das células vegetativas na biomassa recém-coletada, descongele a membrana se ela estiver congelada e use uma tesoura esterilizada com etanol para cortá-la em pedaços menores.

Transfira as peças da membrana para um tubo estéril de dois mililitros e adicione 900 microlitros de tampão 1X TE. Misture bem por vórtice para liberar a biomassa da membrana. Incube o tubo a 65 graus Celsius e 80 RPM por 10 minutos.

Em seguida, retire o tubo da incubadora e deixe esfriar por 15 minutos. Adicione 100 microlitros de lisozima recém-preparada a uma concentração final de dois miligramas por mililitro e incube a amostra a 37 graus Celsius e 80 RPM por 60 minutos para lisar as células vegetativas. Após a conclusão da lise, adicione 250 microlitros de 3 hidróxido de sódio normal e 250 microlitros de solução 6% SDS à amostra.

Incube em temperatura ambiente e 80 RPM por 60 minutos. Em seguida, prepare uma unidade de filtração estéril que contenha membranas de 25 milímetros de diâmetro em autoclavagem. Depois que a unidade de filtração esfriar, coloque uma membrana de nitrocelulose de 25 milímetros de diâmetro e 0,2 micrômetro.

Adicione a amostra à membrana e use a bomba de vácuo para filtrar o líquido, capturando os endósporos na membrana, enquanto o material da célula vegetativa passa. Para lavar os detergentes residuais, adicione dois mililitros de solução fisiológica estéril à membrana e aplique a bomba de vácuo. Quando o líquido estiver totalmente filtrado, desligue a bomba e deixe a membrana na unidade de filtração.

Para realizar o tratamento DNase diretamente na membrana, adicione 450 microlitros de água estéril, 50 microlitros de tampão de reação 1X DNase e 0,5 microlitros de enzima DNase na membrana e deixe repousar a aproximadamente 25 graus Celsius por 15 minutos. O DNA extracelular previamente liberado das células lisadas é digerido enzimaticamente e depois lavado. Isso garante que a preparação final do endósporo esteja livre de DNA externo, que é fundamental para análises posteriores, como análises moleculares.

É importante lembrar que não deve haver vazamento no aparelho do filtro e a amostra não seca. Após a incubação, adicione um mililitro de solução fisiológica e ligue a bomba para lavar a enzima residual da amostra. Use uma pinça estéril para transferir a membrana contendo endósporos para uma placa de Petri estéril.

Analise a amostra de acordo com o protocolo de texto. O protocolo demonstrado neste vídeo de lise direcionada de células vegetativas resulta em uma amostra de endósporo purificada e um aumento significativo na fração de firmicutes formadores de endósporos. No sequenciamento amplicon do gene do RNA ribossômico 16S, as firmicutes em amostras não tratadas correspondem a apenas 8% a 19% das sequências.

Em contraste, as firmicutes após o tratamento representaram 90,6% e 83,9% da amostra rica em endosporina. As duas principais ordens de firmicutes formadores de endósporos, bacilos e clostridiais foram enriquecidos, enquanto firmicutes não formadores de endósporos como lactobacilos estavam ausentes. A eficiência do tratamento também foi demonstrada usando culturas puras.

Uma preparação de endósporos e uma cultura de células vegetativas foram tratadas, todas as células foram incubadas e o crescimento foi medido com uma densidade óptica de 600 nanômetros. Como mostrado aqui, o crescimento foi observado para as culturas de endósporos, enquanto nenhum crescimento foi observado na cultura de E.Coli tratada, indicando que as células vegetativas estão irreversivelmente danificadas. Uma vez dominada, e se as soluções e equipamentos tiverem sido preparados anteriormente, essa técnica deve ser feita em cerca de cinco horas.

É importante lembrar de evitar toda contaminação, trabalhando em condições estéreis e garantindo a esterilidade das soluções e de todos os equipamentos. Após este procedimento, outros métodos como cultivo, isolamento e testes metabólicos podem ser feitos para responder a perguntas adicionais sobre a identificação da cepa e o potencial metabólico dos endósporos. Além disso, a extração de DNA a jusante e o sequenciamento metagenômico podem ser feitos para analisar a diversidade de espécies e a presença de genes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como separar endósporos de amostras ambientais. Não se esqueça de que trabalhar com detergentes como o SDS pode ser extremamente perigoso. Não se esqueça de usar equipamento de proteção individual.