Precauções de segurança e Procedimentos Operacionais em um (A) de laboratório BSL-4: 2. Práticas Gerais

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar práticas seguras ao trabalhar em um laboratório de trajes de nível 4 de biossegurança usando o ensaio de placa como exemplo. Este procedimento demonstra as modificações necessárias para realizar um ensaio de placa padrão em um ambiente de nível de biossegurança 4. Demonstrando o procedimento comigo com Tracey Burdette, uma técnica do Centro de Pesquisa Integrada.

Ao preencher a lista de verificação diária dos sistemas internos, limpe o gabinete de segurança biológica classe II pulverizando o interior, incluindo o caixilho, com solução desinfetante de amônio quaternário duplo 5%. Em seguida, limpe o gabinete com toalhas de papel, certificando-se de deixar o borrifador contendo a solução desinfetante dentro do gabinete para borrifar as mãos enluvadas durante e após a conclusão do ensaio. Pulverize a solução de etanol a 70% dentro do gabinete e do caixilho para remover a solução desinfetante pegajosa.

Prepare um recipiente de resíduos para o gabinete de biossegurança. Certifique-se de que a concentração final da solução desinfetante de amônio quaternário duplo no recipiente de resíduos não seja inferior a 5%, levando em consideração qualquer líquido adicional adicionado. Coloque o recipiente de resíduos contendo solução desinfetante de amônio quaternário duplo 5% dentro do gabinete de biossegurança classe II.

Execute todo o trabalho o mais próximo possível do centro interno do gabinete de biossegurança classe II. O centro interno é projetado para ser a posição mais afetiva para se proteger. Remova 50 microlitros de amostra de vírus e controle o vírus e coloque-os em 450 microlitros de meio de Dulbecco Modified Eagle com 2% de soro bovino fetal em poços de diluição.

Prossiga com a realização de diluições em série até onde for necessário. Misture as amostras de vírus pelo menos cinco vezes com uma ponta de pipeta, trocando as pontas da pipeta após cada diluição. Misture lentamente para minimizar a geração de bolhas de ar nas amostras.

Após a conclusão, retirar os alvéolos de diluição. Ao descartar as pontas, enxágue cada ponta com solução desinfetante do balde de resíduos para descontaminar o interior e o exterior da ponta antes de expeli-la para o balde de resíduos. Remova a maior parte do meio dos poços de seis placas de cultura de células de poço.

Adicione 100 microlitros da amostra correta no poço adequado das placas pré-rotuladas em duplicata. Após a conclusão, borrife as mãos enluvadas com a solução desinfetante. Use uma toalha de papel embebida em solução desinfetante para limpar a parte externa de todas as placas antes de colocá-las na incubadora manualmente.

Balance as placas em um movimento de figura 8 para garantir a dispersão adequada da amostra sobre as células a cada 15 minutos durante uma hora. Adicione dois mililitros da mistura de sobreposição a cada poço e balance mais uma vez em um movimento de figura 8 para distribuição igual da sobreposição por toda a superfície do poço. Mergulhe completamente todos os resíduos em solução desinfetante a 5% no balde de resíduos por um tempo de contato de pelo menos 10 minutos.

Pulverize o interior e o exterior do balde de resíduos, o interior do gabinete de biossegurança classe II, o exterior do equipamento e as mãos enluvadas com solução desinfetante a 5%. Deixe a solução permanecer no balde de resíduos e em outras superfícies por um tempo de contato de 10 minutos. Em seguida, retire os itens do armário de biossegurança e leve-os para a pia.

Coloque a pipeta usada em uma bandeja de pipeta para autoclavagem. Coloque o conteúdo do balde de lixo em uma peneira na pia. Em seguida, traga um recipiente de resíduos de risco biológico forrado com um saco vermelho de risco biológico para a pia e despeje o conteúdo do filtro no saco vermelho de risco biológico.

Coloque o saco de risco biológico em uma bandeja de autoclave em um carrinho. Feche frouxamente os sacos de autoclave com fita adesiva permitindo que o vapor entre no saco. E rotule uma das fitas de autoclave com as iniciais e a data.

Remova a haste de metal perfurada da autoclave e abra a parte superior. Coloque um frasco indicador biológico contendo esporos de Geobacillus stearothermophilus na haste de metal para servir como uma verificação de que o ciclo de esterilização da autoclave foi concluído com sucesso. Coloque a bandeja da autoclave cheia de resíduos na autoclave.

Inicie a autoclave e verifique se o ciclo foi iniciado. A tela de operação da autoclave indicará o tempo restante para essa execução. Após a conclusão do período de incubação necessário, remova cuidadosamente as placas de ensaio de placa da incubadora e coloque-as manualmente no gabinete de biossegurança classe II limpo

Aspire o meio e o material de revestimento com uma pipeta e dispense no recipiente da solução desinfetante. Substitua o meio por uma mistura de formalina tamponada a 10% neutra e 0,8% de violeta de cristal para inativar o vírus por um tempo de contato de 30 minutos. Após a inativação, remova cuidadosamente a mistura neutra de formalina tamponada / cristal violeta e coloque-a em um recipiente de lixo separado para ser neutralizado antes do descarte.

Na pia, enxágue os pratos para remover o excesso de manchas e coloque os pratos em uma bandeja para secar completamente. Use uma caixa de luz para contar as placas. Registre todas as contagens e calcule os títulos de vírus a partir da equação padrão.

Para remoção de amostras inativadas do laboratório BSL-4, coloque os tubos ou placas em um saco de vedação térmica. Pulverize o interior do saco com 5% de desinfetante ou solução fixadora, para desinfetar o interior do saco e o exterior dos tubos de amostra. E então selar o saco a quente.

Coloque esta bolsa em outra bolsa seguindo o mesmo procedimento. Sele a segunda bolsa e coloque as bolsas duplamente seladas em um tanque de imersão contendo 5% de solução desinfetante por pelo menos 10 minutos, para desinfetar a parte externa das bolsas. Preencha um livro de registro do tanque de imersão dentro do laboratório, delineando o número e o tamanho dos tubos, o volume nos tubos, o agente usado, o método de inativação usado e a sala para onde as amostras serão transferidas.

Seguir os procedimentos adequados dentro do laboratório de nível 4 de biossegurança é fundamental para garantir a conclusão segura e eficaz dos ensaios. Ao consultar a lista de verificação interna interna preenchida, a equipe do laboratório garante que o equipamento esteja totalmente operacional. A amostra de vírus é diluída em série para obter placas com 30 a 300 placas por poço e para determinar o título do vírus.

Vários fatores afetam a formação de placas, incluindo tropismo de vírus para linhagens de células hospedeiras, técnica de inoculação, condições para o crescimento do vírus, faixa de diluição apropriada e seleção de sobreposição. Os resíduos gerados no gabinete de biossegurança durante o procedimento são desinfetados duas vezes. Os resíduos são devidamente desinfetados uma vez antes da remoção do gabinete de biossegurança.

Posteriormente, os resíduos são autoclavados antes de deixar o ambiente de nível 4 de biossegurança animal. Seguindo esses procedimentos, nenhuma infecção adquirida em laboratório foi registrada durante a pesquisa de nível 4 de biossegurança animal no Centro de Pesquisa Integrada em Frederick. Esta técnica pode ser feita em três a quatro horas, dependendo do número de amostras, se a técnica for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, lembre-se de realizar diluições corretamente, contar as placas de acordo e cumprir todas as precauções de segurança, para garantir um experimento seguro e bem-sucedido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das limitações físicas impostas pelos trajes de pressão positiva e do tempo adicional necessário para concluir um ensaio de placa padrão.