Name: Multi-exão Ignorando usando oligonucleotídeos antisense Cocktail na distrofia muscular canina ligada ao X (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a técnica de skipping de múltiplos exons usando oligonucleotídeos antisense em cães com distrofia muscular de Duchenne. Este método demonstra resgate sistêmico da distrofina sem toxicidade significativa.

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Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Medicina e Odontologia da Universidade de Alberta, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, e o Instituto de Pesquisa em Saúde da Mulher e da Criança (WCHRI).

As taxas de acesso aberto para este artigo foram fornecidas pela Gene Tools, LLC.

Exon skipping é uma técnica terapêutica promissora para o tratamento da DMD. Tanto in vitro e in vivo demonstraram que a multi-exon skipping é viável. Aqui, é discutida a utilização do modelo de cão CXMD. Em primeiro lugar, AONs foram projetados usando os-ESE de resgate programas e ESEfinder para direcionar exons distrofina 6 - 8. A química 2&#39;OMePS AON foi usado para CXMD transfecção de mioblastos ea espinha dorsal química morfolino AON foi escolhido para os experimentos in vivo. vPMOs são mais eficientes do que os PMOs não modificados, mas devido à sua toxicidade mais elevada que eles não são adequados para injecções sistémicas. extracção de ARN, a RT-PCR, e sequenciação de ADNc foram realizadas sobre os mioblastos CXMD. Cães injetados com o coquetel de PMO foram clinicamente classificados para avaliar qualquer melhoria nos sintomas clínicos. Após os cães foram humanamente eutanasiados, amostras do músculo foram tomadas e preparados para crio-seccionamento. A meia-vida da proteína distrofina induzida por AONs acredita-se ser cerca de 1-2 meses. cães adultos jovens foram utilizados neste estudo, embora estas experiências podem ser feitas com cães neonatais e cães idosos (&gt; 5 anos). Secções musculares preparados foram usados ​​para avaliar a histopatologia e avaliar salvamento proteína distrofina através de transferência de Western e imuno-histoquímica 48. É importante assegurar que o volume da solução de PMO está correcta antes de injecções; não fazê-lo terão efeitos significativos sobre os resultados. Durante injecções intramusculares, uma pressão suficiente é necessária para inserir as fibras musculares. Monitoramento da saúde e da inspeção do local da cirurgia cão são importantes para a solução de problemas. Para monitorar a saúde animal, exames de sangue semanais e pesagem deve ser realizada. Após a eutanásia do animal e a preparação de amostras de músculo, um passo crítico para garantir sensibilidade na detecção de proteína distrofina consiste em utilizar tanto o gel Tris-acetato e método de transferência semi-secodurante o procedimento de transferência Western. Tal como mostrado nos resultados representativos, mioblastos tratados com Ex6A, Ex6B, Ex8A, e o cocktail (contendo Ex6A, Ex6B, Ex8A, e Ex8B) produzido em grelha produtos DMD. Desde Ex8B produzidos sem produtos Exon-ignorado, não foi utilizado na subsequente in vivo. sequenciamento de cDNA mostrou que exons 6-9 skipping ocorreu e imunocitoquímica com DYS-2 coloração mostrou restaurado expressão de distrofina em amostras tratadas. cães tratados com AON mostrou um aumento significativo em fibras distrofina-positiva. Isto indica que os exões 6-8 foram sendo ignorados e uma proteína encurtado foi produzido. A quantidade de fibras distrofina-positivas aumentou quando foi utilizado um cocktail de AONs e foi proporcional à dose AON. Imunotransferï¿½cias mostraram aumento da expressão de distrofina em cães tratados com morfolino sistémicos. músculo esquelético tinham níveis variáveis ​​de fibras de distrofina; No entanto, o tecido do coração tratado com morfolino mostrou poucamelhoria na expressão de distrofina. Desde distrofina tem um elevado peso molecular (427 kDa), a detecção de pequenas quantidades de distrofina pode ser difícil. Para obter os melhores resultados, foram usadas em gel Tris-acetato e o método de transferência semi-seca. Coloração HE mostrou melhorou histopatologia nos cães tratados com morfolino. fibras centralmente nucleadas (CNFs) são um sinal de músculo saudável e representam ciclos de degeneração e regeneração muscular. CXMD cães tratados com morfolino mostrou uma diminuição na percentagem de CNFs em comparação com os cães CXMD não tratados. classificação clínica revelou uma melhoria nos sintomas, tais como o aumento da capacidade de andar e correr, nos animais tratados com morfolino. A dureza dos músculos se acredita reflectir a atrofia muscular, assim, foi incluído no sistema de classificação 59. A dureza dos músculos da coxa (hind-membro) foi avaliada; No entanto, foram excluídos músculo sartório cranianos porque eles tendem a apresentar hipertrofia em vez de atrofia em CXMD. cães tratados mostrared pontuação de classificação mais baixos e tinha vezes mais rápido no teste de corrida de 15 m. Melhoradas vezes no 15 m de teste são indicativos de melhora da função muscular 40. escores mais altos de classificação globais indicam problemas de saúde e aumento da atrofia muscular. Embora estes resultados são promissores, multi-exon skipping ainda apresenta muitos desafios que precisam ser superados antes que a técnica tem aplicabilidade clínica. tecido cardíaco ainda exibe absorção reduzida de AONs, provavelmente devido à diferença no tráfico de celular entre o tecido cardíaco e esquelético. Nenhuns efeitos tóxicos foram observados em animais sob os regimes de dosagem actuais; no entanto, mais trabalho precisa ser feito para avaliar a toxicidade de longo prazo antes do uso de cocktails AON pode passar para ensaios clínicos. É difícil conseguir a aprovação de drogas cocktail AON porque as agências reguladoras definir cada sequência de AON como uma droga única. Isto significa que cada sequência em um cocktail teriam de ser testados individualmente para safety, exigindo mais tempo e mais dinheiro. Uma outra barreira para a utilização de skipping de multi-exão num ambiente clínico é uma grande quantidade de produtos de proteína intermediários produzidos com funções desconhecidas. Estas proteínas podem potencialmente levar a efeitos colaterais imprevisíveis, dependendo do indivíduo a mutação 22. Além disso, os padrões de mutação disponíveis dentro de modelos de cão distróficos atuais são limitadas. Existem poucas mutações que ocorrem naturalmente, e nem todas as mutações são úteis para o estudo de multi-exon skipping. O modelo distrófica porco promete ser uma boa alternativa para o futuro DMD salto de exon estudos 33, 34. Os modelos de cão de DMD têm algumas vantagens sobre outros modelos de DMD. Sendo um maior modelo animal, classificação clínico e ressonância magnética são possíveis, permitindo uma análise mais detalhada. Desde que os cães são animais de grande porte são também mais adequados para estudos toxicológicos e representam mais de perto a doença humana em comparação com o modelo de ratinho. Dog modelos também têm sequências de genes de DMD que são mais semelhantes aos seres humanos 23, 34, 45. Embora tecnicamente desafiador, a abordagem skipping multi-exão poderia vir a beneficiar&gt; 90% dos pacientes com DMD 24. Isso o torna uma alternativa muito melhor para pular-exão única, as-exão único salto só é aplicável a um pequeno subgrupo de pacientes. Além disso, multi-exon skipping nos permitirá selecionar os padrões de exclusão que otimizam a funcionalidade das proteínas distrofina encurtada. Por exemplo, a exclusão de DMD exons 45 - 55 está associada a sintomas excepcionalmente leves ou assintomáticos 14,19,60-63. O salto multi-exão de exons 45 - 55 já foi demonstrado em um modelo de rato com DMD com uma deleção do exão 52 (mdx52), usando injeções sistêmicas de vPMOs 22,26. O uso de vPMOs cocktail também foi demonstrada em outras formas de distrofia muscular, taiscomo Fukuyama distrofia muscular congênita (FCMD). FCMD é causada por aprisionamento de exões, em que o splicing de mRNA aberrante é causada pela inserção de retrotransposões. vPMOs foram mostrados para resgatar o padrão de splicing em ambos FCMD um modelo de rato e em linhas de células humanas 64. Próxima geração de químicos AON expositoras maior eficácia e menor toxicidade iria facilitar a tradução efectiva da abordagem de salto multi-exão para a aplicação clínica. Além disso, saltando multi-exão poderia potencialmente ser aplicada a outras doenças genéticas, tais como a dysferlinopathies 24, 65.

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença muscular recessiva ligada ao X caracterizada por fraqueza muscular progressiva, descrita pela primeira vez pelo Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD é uma doença genética comum que afeta cerca de 1 em cada 3.500 meninos em todo o mundo, com cerca de 20.000 crianças afetadas nascidas a cada ano 2,3. O desenvolvimento motor é atrasada e distúrbios da marcha são vistos na primeira infância 4, seguido por dependência de cadeira de rodas por volta dos primeiros anos da adolescência. A morte geralmente ocorre entre as idades de 20 e 30, devido a insuficiência respiratória ou cardíaca 5-8. Atualmente, não há cura para a DMD. O tratamento com glicocorticóides pode retardar a progressão da degeneração muscular em algum grau, mas está associada a efeitos colaterais significativos, incluindo a obesidade e diabetes mellitus 2,7,8. DMD resulta de mutações no gene da distrofina (DMD), levando a uma perda de protei distrofina funcionaln. DMD é um gene extremamente grande com mais de 2 milhões de pares de bases e 79 exões 9,10. Deleção, absurdo, e duplicação mutações que conduzem a mutações fora do quadro são a causa mais comum do fenótipo DMD. As regiões de exões 3 - 9 exões e 45 - 55 são denominados &quot;pontos quentes&quot; de mutação como a maioria dos pacientes têm mutações de deleção dentro destas porções do gene, conduzindo a distrofina não funcional em pacientes com DMD 3,9,11-16. distrofina funções dentro do complexo da glicoproteína distrofina (DGC), que tem um papel importante na estabilização da membrana muscular. A N- e C-terminais são os domínios mais importantes para a função, enquanto que o domínio da haste central desempenha um papel menos importante 3,9,17. A observância de um fenótipo leve associado com distrofia muscular de Becker (BMD), que em sua maioria resulta de mutações em-frame dentro do gene DMD, inspirou a aplicação do exão pular para o tratamento da DMD. pacientes BMD têm um reduzido, mas functional, a proteína distrofina que mantém ambos os terminais 3,6,18. Exon skipping, em teoria, pode restaurar a grelha de leitura, resultando em proteínas funcionais distrofina encurtados-but-semelhantes aos observados na DMO 3,19. Vários tipos de oligonucleótidos anti-sentido (AONs) foram testadas em ensaios clínicos, incluindo fosforotioatos 2&#39;-metilados (2&#39;OMePS) e oligómeros fosforodiamidato morfolino (PMOs). Ignorando exons 51 e 53 usando estes AONs foi examinado e enquanto os resultados são promissores,-exão única skipping tem aplicabilidade limitada, uma vez que é de 3, 19, 20,21, 22-26 específicos de mutação. Perguntas também permanecem sobre a estabilidade das proteínas encurtadas distrofina resultantes produzidos a partir de um único salto de exon 22,23. Além disso, alguns pacientes necessitam de mais do que um único exão deve ser omitido, a fim de restaurar a grelha de leitura 3. Embora tecnicamente mais difícil, multi-exon skipping é um método quepoderia resolver esses problemas 3,19. Multi-exon skipping foi anteriormente demonstrada em cães distrófica e linhas de células humanas in vitro. Além disso, mdx52 modelos de ratinho e de cão canino ligados ao X distrofia muscular (CXMD) foram utilizados para estudos in vivo em 22, 24-27. Canine distrofia muscular ligada ao X Japan (CXMD J) beagles foram usados ​​aqui, como o quadro de leitura CXMD J pode ser restaurado por skipping multi-exão de exons 6 e 8, ou exons adicionais (por exemplo, exons 3-9) (Figura 1). Baseado no Beagle CXMD compartilha o mesmo padrão de mutação como o modelo Golden Retriever distrofia muscular (GRMD), mas beagles são menores e mais barato de manter devido ao seu tamanho corporal, proporcionando assim um modelo útil para DMD 28,29. Cães CXMD imitar mais de perto o fenótipo DMD humana do que modelos animais menores, como roedores, e são mais confiáveis ​​para as avaliações toxicológicas 3,22,30,31 </saté&gt; (Figura 2). cães CXMD apresentar deterioração progressiva do músculo, distúrbios da marcha, e problemas respiratórios e cardíacos semelhantes aos observados em DMD. Comparado com saltar-exão única, multi-exon skipping é aplicável a uma proporção muito maior de pacientes. Entre os três tipos de mutação mais comum (deleções, absurdo, e duplicações), 80-98% dos pacientes poderiam ser tratados através de multi-salto de exon 14,32,33, enquanto que 45% de todos os pacientes com DMD pode se beneficiar de especificamente pular exons 45 - 55 3,19,22,34. Com o desenvolvimento de morfolinos modificados, a eficiência de cocktails AON a facilitar exon melhorou. Arginina-ricos PMOs peptídeo conjugado de penetração celulares (PPMOs), e in vivo-morpholinos (vPMOs) são produtos químicos AON que melhoraram significativamente a capacidade e estabilidade 3,35-38 de penetração celular. Subsistem as preocupações de longo prazo toxicidade AON; no entanto, progressos significativostem sido feito. Modificações químicas feitas morpholinos diminuir consideravelmente efeitos fora do alvo e estudos pré-clínicos têm relatado nenhum efeito tóxico significativas 3,22,39,40. Um desafio restante para pular de multi-exão é o requisito de corrente para cada um dos AON para ser testado quanto à toxicidade sozinho, como uma única droga, em vez de juntos como um cocktail 3,19,22,41,42. Em estudos envolvendo DMD single e multi-salto de exon voltado para o coração, tem havido pouca melhoria no tecido cardíaco distrófica. A eficácia de morfolinos no coração é pensado para ser baixa devido à capacidade de penetração celular pobre. PPMOs péptido conjugado melhorou a capacidade de AONs para penetrar nas células cardíacas, aumento da quantidade de proteína distrofina funcional resgatado no coração 3,19,38. Aqui, a nossa abordagem cocktail AON é discutido em detalhe, incluindo a concepção de sequências de AON usando software ESEfinder 43. PROTOCols para experiências do cão com skipping multi-exão também são descritas. Beagles CXMD J foram utilizados para exons 6 e 8 experiências pular. Multi-exão pular no modelo de cão CXMD mostra resultados promissores, mas os desafios permanecem que precisam ser superados antes que eles são clinicamente aplicável.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Transfecção de Mioblastos de Cães&nbsp; </forte></td></tr><tr><td>3 ml Placas de 6 poços</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectina&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Volume total de 100 ml em meio opti-MEM na proporção de 2:1 para lipofectina.&nbsp; 10 ml de lipofectina para 5 mg de RNA.</td></tr><tr><td>2' OMePS</td><td>Eurogentec&nbsp;</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) e Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro para Cavalos</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr><tr><td>estreptomicina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>de albumina sérica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfecção de morfolino de mioblastos caninos 
Todo o material da Transfecção MePS de Mioblastos de Cães para cultura</td></tr><tr><td>de morfolinos Antisense&nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Diluir até um volume final de 100 L em meio opti-MEM.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg de morfolinos a 32 mg/ml em solução salina</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidinium tiocianato-fenol-clorofórmio</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/plate</td></tr><tr><td colspan="4">RNA Extraction and Reverse Transtranscription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</td></tr><tr><td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/placa</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &#956; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml&nbsp;</td><td></td> Centrífuga 22363204 <td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td></td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Etanol&nbsp;</td>Espectrômetro UV <td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer direto no éxon 5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1,5 &#956; l 10 &#956; Primer</td></tr><tr><td>reverso M no éxon 10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTCTGTCAATG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1,5 &#956; l 10 &#956; M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Kit RT-PCR de uma etapa</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><forte>Sequenciamento de DNA Complementar (cDNA)&nbsp; </td></tr><tr><td>Kit de extração de gel&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>Centrífuga 28704</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Sequenciamento de Ciclo Terminator v3.1</td><td>Biossistemas Aplicados&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Injeções intramusculares ou biópsia muscular aberta</td></tr><tr><td>Ferramentas</td><td></td><td></td> Cirúrgicas <td>Tesoura, bisturi, agulha, linha cirúrgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Pomada Veterinária</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodóforos&nbsp;</td><td>webtextiles</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>clorohexidina</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>Campos Cirúrgicos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máscara Facial Scrubs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas Cirúrgicas&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de Cabeça&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiopental sódico&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr>Laboratórios <td>Abbott&nbsp;</td> <td>de Isoflurano</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Morfolinos anti-sentido&nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Diluir até um volume final de 100 L em meio opti-MEM.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg de morfolinos a 32 mg/ml em solução salina</td></tr><tr><td>27&nbsp; Agulhas G</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato</td><td></td><td></td><td></td>de buprenorfina</tr><tr><td>Abaixador de língua&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cefalexina</td><td></td><td>15 a 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cefazolina</td><td></td><td>15 a 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina&nbsp;</td><td></td><td>0,01 mg/kg</td><td></td></tr><tr><td>de cloridrato de buprenorfina&nbsp;</td><td>0,02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Injeções Sistêmicas</td></tr><tr><td>Bomba de infusão de seringa&nbsp;</td><td>Muromachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp; G Agulhas de Demora</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp; Agulhas G</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Clinical Grading of Dogs</td></tr><tr><td>Video Camera&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronômetro&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ressonância magnética (MRI)&nbsp; </forte></td></tr><tr><td>3 Tesla MRI l&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bobina</td><td></td><td></td><td></td> de extremidade humana de 18 cm de diâmetro/18 cm de comprimento</tr><td colspan="4">Amostragem e preparação muscular (necropsia)Thiopental sódico&nbsp;<tr></td></tr><tr><td></td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr>Laboratórios <td>Abbott&nbsp;</td> <td>de Isoflurano</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Goma</td><td></td><td></td> Tragacanto <td>10-20 ml</td></tr><tr><td>Nitrogênio Líquido&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Discos de Cortiça</td><td>Iwai-kagaku&nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Gelo Seco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina&ndash; lâminas revestidas</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Microsystem&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>cm1900&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Imuno-histoquímica&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Diluições 1:150&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS2&nbsp;</td><td>Diluições de 1:150</td></tr><tr><td>Alexa 594 antimouse para cabras IgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:2,500 diluições</td></tr><tr><td>Alexa 594 antimouse para cabras IgG2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1:2,500 diluições</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Contém agente de montagem</td></tr><tr><td>Soro de Cabra</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15%</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Umidade&nbsp;</td><td>Laboratório de Desenvolvimento Científico</td><td>Corrediça de câmara 197-BL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lab-tek&nbsp;</td><td></td><td></td>154453</tr><tr><td>Óculos de Cobertura&nbsp;</td>Caneta de barreira hidrofóbica <td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente&nbsp;</td><td></td><td></td><td>594 nm com ampliação de 20X.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Western Blotting&nbsp; </td></tr><tr><td>Água Distribuída&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de Mão&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 vezes; Buffer de carregamento Laemmli SDS&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris&ndash; HCl (pH 6,6), 2% (p/v) SDS, 2% (0,28&nbsp; M) beta-mercaptoetanol, 20% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol;</td></tr><tr><td>Géis SDS&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-1210</td> Géis SDS <td>de resolução de 5%</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td> membrana <td>de 3-8%</td></tr> <tr><td>PVDF</td><td>Buffer</td><td>de funcionamento de</td> metanol GE 10600021 <td></td></tr> (<tr><td></td>10 vezes;)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM de Tris-Base, 1.920 mM de tampão de funcionamento de glicina</td></tr><tr><td>(1 e vezes;)</td><td></td><td></td><td>10% 10&vezes; tampão, 20% metanol&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05% PBS/Tween 20 (PBST)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2.000 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3&times; 200 ml para lavagem</td></tr><tr><td>de PBST/5% de leite em pó&nbsp;</td><td></td><td></td> Kit de Ensaio de Proteína <td>de 100 ml</td></tr><tr><td></td><td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Beta Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de carregamento/amostra para Western blotting</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr> Inibidor de coquetel de protease <tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr>Amortecedor <td></td><td></td><td>Catódico</td><td>0.025 M Base Tris + 40&nbsp; mM 6-aminocapróico ácido + 20%</td></tr> de <tr><td>tampão</td><td></td><td></td> de ânodo de metanol <td>0,03 M Base de Tris + 20%</td></tr><tr><td>de tampão</td><td></td><td></td> de ânodo concentrado de metanol <td>0,3 M de base de Tris + 20%</td></tr><tr><td>de anticorpo de desmina de metanol&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Diluições 1:150&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td> ImageJ</tr></tbody></table>

multi-exão ignorando usando oligonucleotídeos antisense cocktail na distrofia muscular canina ligada ao x

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma das doenças genéticas letais mais comuns em todo o mundo, causadas por mutações no gene da distrofina (DMD). Exon pular emprega DNA curta moléculas / RNA-like chamados oligonucleotídeos antisense (AONs) que restaurar o quadro de leitura e produzem proteínas mais curtas, mas funcionais. No entanto, a terapia salto de exon enfrenta dois grandes obstáculos: aplicabilidade limitada (até apenas 13% dos pacientes podem ser tratados com uma única droga AON), e função incerta de proteínas truncadas. Estas questões foram abordadas com uma abordagem cocktail AON. Enquanto que cerca de 70% dos pacientes com DMD podem ser tratados por uma única exon (todos os exões combinados), pode-se potencialmente o tratamento de mais do que 90% dos pacientes com DMD se exão múltiplos saltando o uso de drogas anti-sentido cocktail pode ser realizado. A distrofia muscular de canino (CXMD) modelo de cão ligada ao X, cujo fenótipo é mais semelhante aos pacientes de DMD humanos, foi utilizado para testar a effic sistémicaACY e segurança dos skipping multi-exão de exons 6 e 8. modelo de cão O CXMD abriga uma mutação de recomposição no intrão 6, levando a uma falta do exão 7 em mRNA de distrofina. Para restaurar o quadro de leitura CXMD requer pular multi-exão de exons 6 e 8; portanto, CXMD é um bom modelo animal de médio porte para testar a eficácia e segurança de salto multi-exão. No estudo atual, um coquetel de morpholinos antisense alvo exão 6 e exon 8 foi projetado e restaurado a expressão de distrofina nos músculos esqueléticos wide-body. Os métodos para a transfecção / injecção de oligos cocktail e avaliação da eficácia e segurança de skipping de multi-exão no modelo de cão CXMD são apresentados.

As experiências in vitro Os mioblastos foram transfectadas com várias condições de tratamento 2&#39;OMePS, a fim de comparar a eficácia de cada AON. AON tratamentos individuais com 600 nM cada de Ex6A, Ex6B, Ex8A, ou Ex8B foram realizadas, bem como um tratamento de cocktail com 600 nM cada de todas as sequências de AON 4. As amostras de RNA foram colhidos quatro dias após transfecção. Após RT-PCR, as amostras para cada tratamento foram corridos num gel juntamente com amostras não tratadas (NT). Faixas mais altas no gel representam out-of-frame produtos DMD; essas bandas foram vistos em NT, Ex8A e Ex8B mioblastos tratados. Ex6A, Ex6B, Ex8A, e os mioblastos tratados com cocktail mostrou produtos em-frame. O cocktail e Ex6A / B apresentaram 100% de produtos in-quadro, enquanto Ex8A mostrou apenas 30% em-frame produtos (Figura 7). Para confirmar exclusão de exon e restauração dea grelha de leitura, foi realizada sequenciação de ADNc; os resultados indicaram que os exões 6-9 tinha de facto sido ignorado (Figura 7). A imuno-histoquímica mostrou que os cães tratados com AON tinha aumentado fibras distrofina-positiva em comparação com amostras de NT (Figura 8). Em experimentos in vivo Para comparar a eficácia de várias condições de tratamento de AON, cães CXMD (0,5 - 5 anos de idade) foram injectados com 1,2 mg uma vez Ex6A ou um cocktail de Ex6A, Ex6B, e Ex8A para várias dosagens. Duas semanas após a injecção, as amostras de músculo foram recolhidas e coradas com dis-1 para comparar o número de fibras distrofina-positiva. Todas as amostras tratadas com cocktail mostraram um aumento da expressão de distrofina em comparação com amostras NT. Fibras distrofina-positivas aumentou com a dosagem AON (Figura 9). seguinte sistemainjecção ic, do tipo selvagem (WT), NT, e amostras do músculo CXMD tratados com cocktail foram coradas com DYS-1 (Figura 10). cães CXMD tratados com cocktail mostraram aumento da expressão de distrofina em comparação com cães NT CXMD, tanto no CT e amostras do músculo cardíaco. No entanto, músculo esquelético tratados com AON (CT) mostraram muito mais elevados de expressão de distrofina em relação ao músculo cardíaco tratado. Um immunoblot comparando WT, NT, e vários músculos tratados com cocktail morfolino levaram à mesma conclusão. Houve também uma grande variedade de expressão de distrofina nas amostras do músculo esquelético tratadas (Figura 10). Hematoxilina e eosina (HE) revelou que tratados CXMD cães apresentaram melhoria da histopatologia, com uma diminuição significativa nas fibras centralmente-nucleadas (CNF), em comparação com os cães NT CXMD (Figura 11). Isto indica que há mais degeneração / regeneração ocorre no cão NT, um sinal de patologia muscular distrófica. Adicionalmente, os cães tratados tinham mais rápidocorrendo tempos e pontuações melhoradas na escala de classificação clínica. Cães CXMD tratados apresentaram melhores resultados do que os cães NT CXMD em todas as categorias (Figura 12). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figura 1. padrão de mutação do cão CXMD e exões 6 -. 8 Skipping estratégias utilizando um cocktail anti-sentido CXMD cães têm uma mutação pontual no exão 6 originando uma perda do exão 7 em ARNm cão distrófica. Isto resulta no ARNm estar fora de grelha e a produção de proteína distrofina é perdida. sequências de AON curtos são concebidos para se ligarem ao exão 6 e 8, que resulta em splicing do mRNA pular eficazmente exões 6 - 8. A barra cinza nos cães tratados com cocktail AON representa sequências de AON curtos. Exon 9 codifica um domínio dobradiça e é por vezes espontaneamente emendados com AONs contra o exão 6 e 8. Os códigos de mRNA resultante da distrofina proteínas que são mais curtos, mas a funçãoal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Figura 2. Principais sintomas clínicos de uma animal de 1 ano de idade canina ligada ao X Muscular de Duchenne (CXMD). A 1-year-old de tipo selvagem beagle e um cão CXMD são mostrados. O envolvimento de proximal, membro, e os músculos temporais são tipicamente observado a partir de 2 meses de idade. Contratura conjunta e um deslocamento da pélvis são ostensiva a partir de 4 meses de idade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figura 3. Anestesia Geral para um cão. A) Intramusculinjecções AR e biópsias musculares são realizadas sob anestesia geral com isoflurano. B) exploração do animal para injeções sistêmicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem por Ressonância Magnética (MRI) do tipo selvagem, não-tratados CXMD, e tratado CXMD. Exames de ressonância magnética do membro posterior em 3 meses e 5 meses em cães WT e NT CXMD. Dois exemplos de imagens de tratados posteriores CXMD membros ressonâncias magnéticas pré-(1 semana antes da primeira injecção) e pós-injeção de AON são mostrados. 2703MA foi tratada semanalmente 7x com 200 mg / kg morpholinos cocktail. 2001MA foi tratada com injecção IV semanalmente 5x de 120 mg / kg morpholinos cocktail. Controle e cães tratados foram pareados por idade. cães tratados apresentam diminuição sinais T2. As imagens são adap<html> ted com a permissão de Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figura 5. biópsia muscular Procedimento para um cão. A) Um membro inferior é fixado para biópsia muscular. B) Com a ajuda de fórceps, o membro inferior é realizada. C) O músculo CT é exposto. técnica de biópsia aberta é utilizado para obter amostras do músculo de sítios injectados. Tópicos são usados ​​para armazenar amostras de biópsia. Amostras D) do músculo no goma adragante após a dissecação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Método de transferência semi-seco. Uma representação do método de transferência semi-seca por transferência de Western são apresentados. Três papéis embebidos em tampão ânodo concentrado está previsto no terminal negativo; 3 papéis embebido em tampão de ânodo são empilhados em cima deste. O papel Mb PVDF é embebida em metanol e em seguida tampão de ânodo antes de ser colocada no topo das 6 papéis. O gel, que foi embebido em tampão de cátodo, é colocada delicadamente sobre o papel PVDF. Finalmente, 3 papéis embebidos em tampão de cátodo são colocados no topo do gel. O terminal positivo está situado no topo. Durante 1 hora, 400 mA é executado através do sistema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figura 7. Exon Skipping em CXMD mioblastos. </strong&gt; mioblastos CXMD foram transfectadas com Ex6A, Ex6B, Ex8A ou Ex8B sozinho, ou uma mistura de todos os quatro. Um total de 600 nm foi utilizado para as sequências individuais e para o cocktail foram utilizados 600 nM de cada sequência. A) 2&#39;OMePS tratamento em mioblastos cão CXMD. Ex6A, Ex6B, e as amostras tratadas com cocktail mostram fortes bandas na posição esperada de transcritos de exão-ignorados em-quadro. Ex8A mostra uma banda intermediária, Ex8B mostra uma banda fraca, e NT não mostram uma banda na posição em grelha. B) sequenciação de cDNA a partir sozinho Ex6A, 4 dias após a transfecção. As imagens são adaptadas com permissão de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Figura 8. O aumento Dystrophin Expressão em 2&#39;-metilados fosforotioato (2&#39;OMePS) transfectadas CXMD mioblastos. mioblastos CXMD foram transfectadas apenas com Ex6A ou com 2&#39;OMePS cocktail. DYS-2 (vermelho) e DAPI (azul) coloração são mostrados. Os mioblastos tratados são comparados com o tipo selvagem (WT) e mioblastos não tratadas (NT). As imagens são adaptadas com permissão de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figura 9. Resgate de distrofina Expression com intramuscular injeções de Morpholinos só em CXMD Dogs. Ou Ex6A ou um coquetel de Ex6A, Ex6B e Ex8A foram injetados nos músculos CT de cães CXMD. A distrofina (DSY-1) coloração de tipo selvagem(WT), não-tratado (NT), e os cães CXMD tratados são mostrados. Os cães ou foram tratados com 1,2 mg Ex6A sozinho ou 1,2 mg de cocktail. As imagens são adaptadas com permissão de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figura 10. Aumento da expressão de distrofina Após Cocktail Systemic Morpholino tratamento em CXMD Dogs. Distrofina (DYS-1) coloração foi utilizado para comparar a expressão de distrofina no tipo selvagem (WT) (controle positivo), não-tratado (NT) (controle negativo), e cães CXMD tratados com 120 mg / kg de cocktail morfolino (40 mg / kg de cada AON). O cocktail morfolino contido Ex6A, Ex6B e Ex8A. Os cães foram injectados por via intravenosa 5 vezes nósekly com este cocktail. A) Uma comparação entre a expressão de distrofina em tibial cranial (CT) músculos do WT, NT, e cães tratados. B) A comparação da expressão de distrofina em tecido cardíaco entre NT e os cães tratados com cocktail morfolino. C) Immunoblot para distrofina com desmina como um controle de carga é mostrado para WT, NT, e os cães tratados com cocktail morfolino. Os seguintes músculos são mostradas para os cães tratados: tríceps braquial (TB), bíceps braquial (BB), o diafragma (DIA), esôfago (ESO), CT, adutora (ADD), extensor longo dos dedos (EDL), masseter (MAS), e no coração. As imagens são adaptadas com permissão de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figura11. Melhoria da histopatologia em CXMD cães tratados durante 7 semanas com 240 mg / kg Morpholino Cocktail. Cães CXMD que variam de metade de um ano a cinco anos de idade foram injectados por via intravenosa com 240 mg / kg morfolino cocktail (Ex6A, Ex6B e Ex8A) uma vez por semana durante 7 semanas. Catorze dias após a última injecção, os músculos do esófago foram tomadas e hematoxilina e eosina (HE) foi feito. Coloração HE dos músculos do esôfago de não-tratadas (NT) e morfolino cocktail-tratada (tratado) cães CXMD (40X lente objetiva). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figura 12. Índices de Melhoria na classificação clínica e 15 m Tempo corrente Depois de cães tratados com Morpholino Morpholino tratamento. Foram comparados aos não tratados com (NT) littermates. As barras de erro no gráfico indicam SEM. A) pontuação total no exame de classificação clínica foi calculada antes e após o tratamento e os animais tratados foram comparados com ninhadas NT. B) Uma comparação de 15 m tempos de execução de cães tratados e NT. C) Semelhante a B; No entanto, foram utilizados cães mais novos. As imagens são adaptadas com permissão de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligonucleótido anti-sentido </td><td> sequência nucleotídica </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabela 1. oligonucleótido de estrutura.

Exon pular é atualmente uma opção terapêutica mais promissora para a distrofia muscular de Duchenne (DMD). Para alargar a aplicabilidade para pacientes com DMD e para optimizar a estabilidade / função das proteínas distrofina truncados resultantes, um multi-exão abordagem pular utilizando oligonucleótidos anti-sentido de cocktail foi desenvolvido e demonstramos salvamento distrofina sistémico num modelo de cão.

Multi-exão Ignorando usando oligonucleotídeos antisense Cocktail na distrofia muscular canina ligada ao X

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

O objetivo geral deste experimento é examinar a eficácia e a toxicidade da múltipla salto de éxons utilizando coquetéis de oligonucleotídeos antissenso ou AONs em um modelo canino de distrofia muscular de Duchenne ou DMD. Este método pode ajudar a responder questões-chave na pesquisa translacional da terapia de salto de éxons por oligonucleotídeos antissenso, como por exemplo se os oligonucleotídeos antissenso podem induzir múltiplos saltos de éxons e interromper a expressão da distrofina em um modelo animal de grande porte. A principal vantagem do uso do modelo canino em um estudo é que os resultados terapêuticos em animais maiores podem ser extrapolados de forma mais confiável para pacientes com DMD.Embora a exclusão de éxons seja uma terapia muito promissora para a DMD, ela também pode ser aplicada a outras doenças genéticas, como a distrofia muscular congênita e a distrofia muscular cinturada. A demonstração dos experimentos in vitro será realizada pelo Dr. Yoshitsugu Aoki, chefe do nosso laboratório, e a demonstração dos experimentos in vivo será realizada pela Dra. Mutsuki Kuraoka, pesquisadora pós-doutora do meu departamento. Após o planejamento dos AONs de acordo com o protocolo descrito, utilize placas de 6 poços para semear de um a cinco vezes 10 à terceira por centímetro quadrado de mioblastos CXMD em três mililitros de DMEM com 10% de FBS e 1% de pen-estrep.Incube as células a 37 graus Celsius até atingirem 60 a 80% de confluência. Quando as células atingirem a confluência desejada, utilize meio com soro reduzido para diluir um reagente de transfeção com lipossomos catiônicos até um volume total de 100 microlitros, e deixe a mistura em repouso à temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Em seguida, com meio com soro reduzido, dilua os AONs até um volume final de 100 microlitros.Combine o reagente de transfeção diluído com os AONs diluídos e incube em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Enquanto isso, remova o meio das células e use meio fresco para lavar as células três vezes. Em seguida, adicione 0,8 mililitros de meio à mistura de transfeção e, então, adicione toda a solução às células recém-lavadas.Incube a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, adicione o meio de diferenciação, ou DM, às células e incube por até 10 dias para que ocorra a diferenciação. A partir do terceiro dia, verifique a diferenciação.Para realizar a transfeção com morpholino em mioblastos caninos, cultive os mioblastos CXMD conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Aqueça os morpholinos do coquetel a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione um reagente de entrega peptídica e ajuste o morpholino para uma concentração final de três a seis micromolares.Em seguida, utilize DM para substituir o meio nos mioblastos e adicione o morpholino a cada poço numa concentração final de um micromolar. Incube por 16 a 18 horas. Depois, para coletar as células para extração de RNA, adicione um mililitro de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio às células para destacá-las da placa.Após incubar as células à temperatura ambiente por 10 minutos, transfira as células para tubos de 1,5 mililitro. Adicione 200 microlitros de clorofórmio a cada tubo e incube à temperatura ambiente por dois minutos, até que três camadas separadas possam ser vistas: a camada de RNA, a camada de proteína e a camada de DNA. Centrifugue os tubos a 12.000 × g e 4 °C por 15 minutos.Em seguida, remova a camada superior do sobrenatante e transfira para um tubo contendo 500 microlitros de isopropanol. Gire os tubos de sobrenatante antes de remover o sobrenatante e guardar o pellet de RNA. Use etanol para lavar o pellet e centrifugue a 8.000 × g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Inverta o tubo durante 15 minutos para evaporar o etanol residual antes de adicionar de 15 a 30 microlitros de água livre de RNase. Em seguida, utilize espectroscopia UV-Vis a 260 nanômetros para quantificar o RNA. Para realizar a RT-PCR, misture os seguintes reagentes e adicione água até um volume final de 25 microlitros.Coloque as amostras em um termociclador e execute o seguinte programa. Quando a corrida for concluída, armazene o produto a quatro graus Celsius ou 20 graus Celsius. Para realizar uma injeção intramuscular, após preparar o animal para cirurgia e anestesiá-lo de acordo com o protocolo descrito no texto, use um bisturi para cortar a pele aproximadamente cinco centímetros longitudinalmente sobre a tíbia cranial, ou CT. Para marcar os locais de injeção, use uma agulha cirúrgica e fio cirúrgico para suturar a fáscia profunda, fazendo dois pontos marcadores em intervalos de dois centímetros.É muito importante marcar o local da injeção com fio, pois isso permite uma biópsia mais precisa. Em seguida, utilizando uma agulha de 27 gauge, injete a concentração desejada de AONs no músculo e mantenha a agulha inserida por um minuto. Depois, para realizar uma biópsia muscular aberta, use um bisturi cirúrgico para remover um fragmento de tecido muscular com aproximadamente dois centímetros de comprimento do músculo CT.Coloque a fáscia muscular de volta sobre o músculo e use um fio absorvível 000 para fechar o tecido. Em seguida, use fio de náilon 000 para fechar a pele. Com uma agulha, administre uma injeção intramuscular de 0,02 miligramas por quilograma de cloridrato de buprenorfina.Para injetar uma coquetel contendo quantidades iguais de cada AON em uma veia do membro, enquanto segura o animal de acordo com o protocolo descrito no texto, insira uma agulha venosa permanente em uma veia do membro. Utilizando uma bomba de infusão ou um dispositivo de injeção por seringa, injete um volume total de 50 mililitros a uma taxa de 2,5 mililitros por minuto durante 20 minutos, seguindo as instruções do fabricante. Repita as injeções semanalmente ou quinzenalmente, já que a expressão da distrofina irá se acumular com injeções repetidas.Realize exames sanguíneos semanais para avaliar a toxicidade, utilizando uma agulha para coletar três mililitros de sangue de uma das veias subcutâneas do membro anterior ou posterior. Siga as instruções do fabricante e inclua as seguintes avaliações. Realize análises adicionais de acordo com o protocolo descrito no texto.Os mioblastos foram transfectados com várias condições de tratamento com 2'OMePS para comparar a eficácia de cada AON. O gel mostrado aqui representa amostras de RT-PCR a partir de RNA coletado quatro dias após o tratamento. As bandas mais altas no gel representam produtos DMD fora do quadro de leitura e foram observadas nos mioblastos não tratados Ex8A e Ex8B tratados.Os mioblastos tratados com Ex6A, Ex6B, Ex8A e o coquetel mostraram produtos em quadro de leitura. O sequenciamento de cDNA confirmou que os éxons 6 ao 9 tinham sido pulados. Como visto nesta figura, a imunocitoquímica revelou que as células de cão tratadas com AON apresentaram um aumento nas fibras positivas para distrofina em comparação com as amostras não tratadas.Para comparar a eficácia de várias condições de tratamento com AON, cães CXMD foram injetados com Ex6A, ou um coquetel de Ex6A, Ex6B e Ex8A em diferentes dosagens. Amostras musculares coradas para DYS1 mostram um aumento na expressão de distrofina em amostras tratadas com coquetel, e as fibras positivas para distrofina aumentaram com a dosagem de distrofina. Após injeções sistêmicas, cães CXMD tratados com coquetel exibiram aumento na expressão de distrofina em comparação com cães CXMD não tratados, tanto em amostras de músculo CT quanto cardíaco.No entanto, os músculos esqueléticos tratados com AON apresentaram expressão muito maior de distrofina em comparação com o músculo cardíaco tratado. Além disso, cães CXMD tratados apresentaram melhora na histopatologia, com diminuição significativa de fibras com núcleos centrais em comparação com cães CXMD não tratados. Uma vez dominados, os experimentos in vitro e in vivo podem ser realizados em algumas horas, se realizados corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante monitorar cuidadosamente o estado de saúde do cão. Após seu desenvolvimento, a exonificação sistêmica abriu caminho para que pesquisadores nesta área iniciassem ensaios clínicos em humanos com pacientes com DMD. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como tratar cães com oligonucleotídeos antissenso.

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Medicine

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