Multi-exão Ignorando usando oligonucleotídeos antisense Cocktail na distrofia muscular canina ligada ao X

O objetivo geral deste experimento é examinar a eficácia e a toxicidade do salto de múltiplos exons usando oligonucleotídeos antisense de coquetel ou AONs em um modelo canino de distrofia muscular de Duchenne ou DMD. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa translacional da terapia de salto de exon antisense, como se os oligonucleotídeos antisense podem induzir o salto de exon múltiplo e destruir a expressão da distrofia em um modelo animal de grande porte. A principal vantagem de usar o modelo de cão em um estudo é que os resultados terapêuticos em animais maiores podem ser extrapolados de forma mais confiável para pacientes com DMD.

Embora o salto de exon seja uma terapia muito promissora para DMD, ele também pode ser aplicado a outras doenças genéticas, como distrofia muscular congênita e distrofia muscular de cinturas. A demonstração dos experimentos in vitro será feita pelo Dr. Yoshitsugu Aoki, nosso chefe de laboratório, e a demonstração dos experimentos in vivo será feita pelo Dr. Mutsuki Kuraoka, um pós-doutorado do meu departamento. Depois de projetar AONs de acordo com o protocolo de texto, use placas de 6 poços para semear de um a cinco vezes 10 a um terço por centímetro quadrado de mioblastos CXMD em três mililitros de DMEM com 10% de FBS e 1% de caneta-estreptococo.

Incubar as células a 37 graus Celsius até 60 a 80% confluentes. Quando as células atingirem a confluência desejada, use meio de soro reduzido para diluir um reagente de transfecção de lipossomas catiônicos até um volume total de 100 microlitros e deixe a mistura repousar em temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Em seguida, com meio sérico reduzido, diluir as AONs até um volume final de 100 microlitros.

Combine o reagente de transfecção diluído com os AONs diluídos e incube em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Enquanto isso, remova o meio das células e use meio fresco para lavar as células três vezes. Em seguida, adicione 0,8 mililitros de meio à mistura de transfecção e, em seguida, adicione toda a solução às células recém-lavadas.

Incube a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, adicione meio de diferenciação, ou DM, às células e incube por até 10 dias para que a diferenciação ocorra. Começando por volta do terceiro dia, verifique a diferenciação.

Para realizar a transfecção de morfolino de mioblastos de cães, cultive mioblastos CXMD conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Aqueça os morfolinos do coquetel a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione um reagente de entrega de peptídeos e ajuste o morfolino para uma concentração final de três a seis micromolares.

Em seguida, use o DM para substituir o meio nos mioblastos e adicione o morfolino a cada poço na concentração final de um micromolar. Incubar por 16 a 18 horas. Em seguida, para coletar as células para extração de RNA, adicione um mililitro de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio às células para separá-las da placa.

Depois de incubar as células em temperatura ambiente por 10 minutos, transfira as células para tubos de 1,5 mililitro. Adicione 200 microlitros de clorofórmio a cada tubo e incube em temperatura ambiente por dois minutos até que três camadas separadas possam ser vistas, a camada de RNA, a camada de proteína e a camada de DNA. Centrifugue nos tubos a 12.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, remova a camada superior do sobrenadante e transfira para um tubo contendo 500 microlitros de isopropanol. Gire os tubos sobrenadantes antes de remover o sobrenadante e guardar o pellet de RNA. Use etanol para lavar o pellet e centrifugue a 8.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Inverta o tubo por 15 minutos para evaporar o etanol residual antes de adicionar 15 a 30 microlitros de água livre de RNase. Em seguida, use a espectroscopia UV-Vis a 260 nanômetros para quantificar o RNA. Para realizar RT-PCR, misture os seguintes reagentes e adicione água até um volume final de 25 microlitros.

Coloque as amostras em um termociclador e execute o seguinte programa. Quando a tiragem estiver concluída, armazene o produto a quatro graus Celsius ou 20 graus Celsius. Para realizar uma injeção intramuscular, após preparar o animal para a cirurgia e anestesiar de acordo com o protocolo de texto, use um bisturi para cortar a pele aproximadamente cinco centímetros longitudinalmente sobre a tíbia cranial, ou CT.To marcar os locais de injeção, use uma agulha cirúrgica e linha cirúrgica para costurar a fáscia profunda, fazendo dois marcadores de ponto em intervalos de dois centímetros.

É muito importante marcar o local da injeção com rosca, pois isso permite uma biópsia mais precisa. Em seguida, usando uma agulha de calibre 27, injete a concentração desejada de AONs no músculo e deixe a agulha agir por um minuto. Em seguida, para realizar uma biópsia muscular aberta, use um bisturi cirúrgico para remover um pedaço de tecido muscular de aproximadamente dois centímetros de comprimento do músculo da TC.

Coloque a fáscia muscular de volta sobre o músculo e use um fio absorvível 000 para fechar o tecido. Em seguida, use fio de náilon 000 para fechar a pele. Usando uma agulha, administre uma injeção intramuscular de 0,02 miligramas por quilograma de cloridrato de buprenorfina.

Para injetar um coquetel contendo quantidades iguais de cada AON em uma veia do membro, enquanto segura o animal de acordo com o protocolo de texto, insira uma agulha venosa de demora em uma veia do membro. Usando uma bomba de infusão ou chave de seringa, injete 50 mililitros no total a 2,5 mililitros por minuto por 20 minutos, seguindo as instruções do fabricante. Repita as injeções semanalmente ou quinzenalmente, pois a expressão da distrofina se acumulará com injeções repetidas.

Para realizar exames de sangue semanais para examinar a toxicidade, use uma agulha para coletar três mililitros de sangue de uma das veias subcutâneas do membro anterior ou posterior. Seguindo as instruções do fabricante, inclua as seguintes avaliações. Realizar análises adicionais de acordo com o protocolo de texto.

Os mioblastos foram transfectados com várias condições de tratamento com 2'OMePS para comparar a eficácia de cada AON. O gel mostrado aqui representa amostras de RT-PCR de RNA coletadas quatro dias após o tratamento. Bandas mais altas no gel representam produtos DMD fora do quadro e foram observadas nos mioblastos tratados com Ex8A e Ex8B não tratados.

Ex6A, Ex6B, Ex8A e os mioblastos tratados com coquetel mostraram produtos in-frame. O sequenciamento de cDNA verificou que os Exon 6 a 9 foram ignorados. Como visto nesta figura, a imunocitoquímica revelou que as células de cães tratadas com AON aumentaram as fibras positivas para distrofina em comparação com as amostras não tratadas.

Para comparar a eficácia de várias condições de tratamento AON, os cães CXMD foram injetados com Ex6A, ou um coquetel de Ex6A, Ex6B e Ex8A em várias dosagens. As amostras musculares coradas para DYS1 mostram um aumento na expressão de distrofina nas amostras tratadas com coquetel, e as fibras positivas para distrofina aumentaram com a dosagem de distrofina. Após injeções sistêmicas, os cães CXMD tratados com coquetel mostraram aumento da expressão de distrofina em comparação com os cães NT CXMD, tanto na TC quanto nas amostras de músculo cardíaco.

No entanto, os músculos esqueléticos tratados com AON mostraram uma expressão muito maior de distrofina em comparação com o músculo cardíaco tratado. Além disso, os cães CXMD tratados apresentaram melhora histopatológica com uma diminuição significativa nas fibras nucleadas centralmente em comparação com os cães NT CXMD. Uma vez dominados, os experimentos in vitro e in vivo podem ser feitos em algumas horas, se forem realizados corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante monitorar cuidadosamente o estado de saúde do cão. Após seu desenvolvimento, o salto sistêmico de exons abriu caminho para que pesquisadores desse campo iniciassem ensaios clínicos em humanos em pacientes com DMD. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como tratar cães com oligonucleotídeos antisense.