Name: Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a preparar fatias de cérebro saudáveis usando o método de recuperação protetora com NMDG otimizado. Esta técnica preserva neurônios para eletrofisiologia de patch clamp em animais adultos.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Allen para a ciência do cérebro. Os autores desejam agradecer os fundadores de Instituto de Allen, Paul G. Allen e Jody Allen, por sua visão, encorajamento e apoio. Agradecemos também a equipe de suporte técnico do Instituto Allen para realização de genotipagem, criação e cuidados com animais.

Os autores não têm nada para divulgar.

At + Spike-em melhora formação Gigaohm selo e Patch Clamp gravação de sucesso A versão inicial do método NMDG protetora de recuperação foi projetada especificamente para animais adultos e envelhecimento2,5. Alguns pioneiros também têm procurado aplicar esta metodologia a corte juvenil cérebro animal (ou seja, ratos < 30 dias de idade). No entanto, tem-se observado que em contraste com proeminente visualmente-confirmado neuronal preservação com o método de recuperação protetora de NMDG nesta faixa de idade, formação de selo gigaohm pode frequentemente empata, levando a braçadeira do remendo falha tentativas de gravação. Uma hipótese é que NMDG cações são mais prontamente preso em fatias de cérebro juvenil em relação as fatias do cérebro de um adulto e podem impedir a formação de selo; no entanto, selos gigaohm prontamente podem formar enquanto fatias do cérebro juvenil são totalmente submerso em NMDG aCSF (dados não mostrados), assim indicando que NMDG aCSF por si é não impedir gigaohm selo formação.
A transição rápida de solução de baixo-para-alto at+ após a conclusão da etapa de recuperação inicial cérebro fatia provoca danos nas membranas neuronais e perturba o processo de formação do selo. Isso é intuitivo, dado que a transição de baixo-para-alto at+, frio-quente a temperatura e elevação dramática do Ca2 + para2 + relação Mg coletivamente levam a um forte ressurgimento do espontânea atividade sináptica. Esta fase de rebote inibitório no cérebro procedimento de corte é provável espelhar a lesão de reperfusão após um insulto isquêmico. Assim, ainda mais mitigar danos de membrana neuronal na fase inicial de recuperação que incorporou-se um gradual nd+ espiga-em procedimento em que a elevação da concentração do at+ na câmara de incubação NMDG protetora de recuperação é lentamente e reproducibly elevados com timing preciso. Como o procedimento de recuperação proteção original, a dissociação temporal de at+ elevação de temperatura e elevação de Ca2 +/ mg2 + relação é benéfica. Mas além disso, o at+ pico-no procedimento leva a pequenos aumentos incrementais na concentração extracelular de at+ sobre os primeiros pontos de tempo e grandes aumentos para os pontos de tempo final, proporcionando, assim, o tecido cerebral um oportunidade para melhor acomodar para o aumento dos níveis de at+ . Este procedimento é que uma alternativa ao exchange solução gradual controlada por uma bomba de perfusão ou gravidade linhas de gotejamento que levam a constantes aumentos nos níveis de at+ e exigem atenção para tanto a entrada e a saída para evitar o estouro da câmara de fatia. Notavelmente, neste at+ espiga-em procedimento a osmolalidade da solução na câmara de fatia gradualmente sobe ao longo de vários minutos antes das fatias são retornadas à solução osmolalidade normal, mas isso não afetou negativamente a saúde de fatia ou braçadeira do remendo gravação de sucesso. Uma solução de corte de alta pressão osmótica anteriormente foi usada para preparações de fatia do mesencéfalo para melhor preservar os neurônios de dopamina para remendo braçadeira gravações57,58, demonstrando assim que este temporário hiperosmolaridade pode ser benéfica em alguns contextos.
Implementando um processo otimizado, combinando o método de recuperação proteção NMDG e gradual at+ pico-no passo a utilidade desta metodologia de fatia do cérebro foi estendido para cobrir juvenil com idades animais adultas maduras. Este protocolo atualizado agora é adequado para uma vasta gama de idades animais usando uma única formulação ideal de aCSF NMDG e procedimento. Se necessário, o at+ pico-no procedimento pode ser aplicado com um atraso progressivamente mais longo e/ou curso de tempo mais lento para melhorar a viabilidade das fatias de cérebro de animais mais velhos, e nós fornecemos um guia básico de horários de pico-no recomendado de acordo a animal idade (ver tabela 2). Enquanto nós fornecemos uma estrutura básica apropriada para uma ampla gama de aplicações, etapas avançadas adicionais podem ser exploradas para realçar ainda mais a viabilidade e a longevidade de fatias de cérebro de animais adultos e do envelhecimento. Por exemplo, estratégias de restauração de glutationa são particularmente eficazes neste sentido e podem ser implementadas conforme descrito em outro lugar2,6.
Melhorar o Throughput para desafiar as experiências A análise da conectividade sináptica por gravação de braçadeira do remendo é uma aplicação exigente que requer excelente preservação da estrutura neuronal e função a fim de alcançar uma alta confiabilidade de sucesso. Como o número de neurônios para ser gravado simultaneamente aumenta linearmente, o nível de dificuldade técnica sobe supralinearmente. Existem numerosos modos de falha, e uma das causas mais frequentes de falhas é a incapacidade de selos de forma adequada gigaohm em uma ou mais das células alvo. Isto pode dramaticamente lento progresso, particularmente quando três ou mais neurônios devem ser registrados simultaneamente. Consistente com o achado de mais rápido gigaohm selo tempo de formação com o método de recuperação proteção otimizado NMDG, houve uma melhora acentuada na taxa de sucesso e taxa de transferência de gravação de braçadeira do remendo do neurônio multi experimentos com ambos os adultos transgênicos fatias de cérebro de rato e fatias de cérebro neurocirúrgicos humano adulto. A maior eficiência é quase certamente atribuível a ambos gigaohm selo formação mais rápida e confiável e a preservação neuronal melhorada das fatias com este protocolo. Embora este protocolo enfoca os benefícios explicitamente para braçadeira de remendo, aplicações de gravação, ganhos semelhantes são antecipados para outras aplicações desafiadoras experimentais onde a viabilidade de fatia do cérebro é primordial.

A preparação de fatia cerebral aguda é um sistema de modelo experimental essencial em neurociência. Para cerca de metade de um século, esta plataforma permitiu dinâmicos estudos funcionais do cérebro vivo em uma ampla variedade de espécies animais e regiões anatômicas do cérebro. Se o aplicativo pretendido é bioquímica, morfologia, imagem latente funcional ou eletrofisiologia, é de extrema importância para garantir a integridade ideal e a viabilidade do tecido cortado. É por este motivo que a preparação de fatia do cérebro de roedor juvenil altamente resiliente (i.e., mais jovem do que o pós-Natal dia 30 para ratos) tem sido a mais preferida para a data. A dificuldade na obtenção de cérebro suficientemente saudável fatias do adulto maduro e envelhecimento animais provou para ser um desafio formidável para a maioria e impôs severas limitações para estudar a arquitetura funcional do cérebro maduro. Isto é particularmente verdadeiro para braçadeira do remendo de gravação, uma técnica que exige excelente preservação morfológica e funcional e é indispensável para a caracterização detalhadas propriedades intrínsecas e sinápticas dos neurônios único identificados. Há várias décadas, a grande maioria dos electrophysiologists de braçadeira do remendo têm contado com um método de 'corte de proteção' usando sacarose-substituídos baixa at+ aCSF1 fatias de cérebro saudável de juvenil e para um bem menor na preparação extensão, animais jovens e adultos. Este método é baseado na premissa de que a passivo influxo at+ e entrada de água posterior e célula inchaço durante a etapa de corte fatia é o insulto predominante que leva a pobre sobrevivência dos neurônios, particularmente para aqueles neurônios localizado na camadas superficiais que são mais propensos a sustentar o trauma direto do movimento da lâmina. No entanto, o método de proteção de corte ainda deixa muito a desejar para a preparação de fatia de cérebro de animais adultos maduros independentemente a formulação particular aCSF implementado.
Uma solução simples mas eficaz para este problema tem sido descrito2,3,4,5,6 e denominou o método de fatia do cérebro 'proteção recuperação'. A versão original deste método usa um aCSF NMDG-substituídos, como NMDG foi identificado como o mais versátil e eficaz, entre vários outros candidatos de sódio íon substitutos (incluindo a sacarose, glicerol, colina e Tris). A formulação de mídia foi reforçada pela adição de HEPES resistir edema de fatia do cérebro e fornecer mais forte pH buffer7, bem como a adição de suplementos para neutralizar os efeitos nocivos do estresse oxidativo (tabela 1). Determinou-se empiricamente que uma incubação de recuperação inicial intervir Na baixa+, baixa Ca2 +, e alta Mg2 + NMDG aCSF imediatamente após o corte de tecido do cérebro de um adulto foi necessária e suficiente para melhorado neuronal preservação sob uma grande variedade de regiões do cérebro, tipos de células e animais idades3,5,6.
Notavelmente, encarnações anteriores de que agora é chamado o método de proteção de recuperação podem ser encontradas na literatura1,8,9,10,11,12, 13, apesar de todo o potencial para amadurecer adulto e envelhecimento do cérebro animal fatia e patch braçadeira gravação não foi reconhecido ou demonstrado nestas obras anteriores. Além disso, variações processuais matizadas continuam a surgir para apoiar aplicações específicas experimental4,14,15,16. O corpo coletivo de trabalho desses numerosos grupos de investigação transmite confiança elevada na robustez do método recuperação protetora para preservação de tecido melhorada. O método de recuperação protetora NMDG agora foi amplamente adotado e implementado em inúmeros estudos publicados utilizando preparações de fatia do cérebro de um animal adulto. Estes estudos de fatia aguda abrangem neocortical3,17,18, hipocampo15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, mesencéfalo25,26,,27,28,29e rombencéfalo30,31,32, 33 , regiões de 34 e uma variedade de tipos de neurotransmissor e neuromodelador incluindo glutamatérgico4,30, gabaérgica18,20,31,35 ,36, dopaminergic24,29,37,38, colinérgicos14,37,38, 39, noradrenérgico40e serotoninérgico27,28 neurotransmissão. O método também é apropriado para controle de optogenetic de atividade neuronal em fatias derivados animais transgénicos3,39 ou seguindo na vivo injeções viral17,27, 28,40,41,42,43, como bem como Ca2 + imagem latente funcional da atividade neuronal2,44 ,,45,46. Análises de curto prazo plasticidade4,,47,48 e diversas formas de plasticidade a longo prazo16,35,48 foram relatou. Um estudo recente aplicado o método de recuperação proteção NMDG para facilitar a extensa e sistemática de sondagem de conectividade sináptica no córtex visual em fatias de cérebro de rato adulto maduro usando o octopatch gravar configuração49 — um poderoso demonstração da utilidade e robustez deste método. O método de recuperação proteção nem tem sido aplicado com sucesso em contextos experimentais anteriormente imprevistos, tais como, melhor preservação da vasculatura e pericitos em adultos cérebro cortical fatias50, braçadeira do remendo de gravação de transplantadas as populações interneurônio 1 – 1,5 ano de idade a doença de Alzheimer do mouse modelos20e um cérebro de um adulto fatia do receptor de tráfico ensaio51.
O protocolo seguinte descreve procedimentos passo a passo para implementar um método de recuperação protetora NMDG otimizado de preparação de fatia do cérebro para melhorar a viabilidade das fatias cerebral aguda. Os princípios para melhor preservação neuronal são discutidos, bem como demonstração dos benefícios claros desta metodologia para braçadeira de remendo de neurônio multi complexo gravação experimentos em fatias de cérebro de rato transgénico adulto jovem e adulto maduro fatias de cérebro humano neurocirúrgicos. O protocolo seguinte foi validado para ratos de 21 dias de idade para mais de um anos de idade, bem como quanto a espécimes humanos neurocirúrgicos, derivados de pacientes adultos.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Instrumentos de Precisão</td><td>VF-200</td><td>Fatiador de tecido vibratório (recomendado)</td></tr> <tr><td>N-metil-D-glucamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio di-hidrato monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G7021</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Ascorbato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF constituinte</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Componente anestésico 1</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Componente anestésico 2</td></tr><tr><td>Pinça curva sem corte</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>11065-07 Ferramentas de</td><td>dissecção cerebral</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação fina (supercut)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09 Ferramentas de</td><td>dissecção cerebral</td></tr><tr><td>Tesouras grandes e pesadas 7''Fine</td> <td>Science Tools</td><td>14000-18 Ferramentas de</td><td>dissecção cerebral</td></tr><tr><td>Espátula de metal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Ferramentas de dissecção cerebral</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Ferramentas de dissecção cerebral</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td><td>câmara de retenção de fatia cerebral</td></tr><tr><td>rede de nylon&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Para a construção de câmaras de recuperação de pequenas fatias</td></tr><tr><td>Copos de vidro Pyrex (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Para a construção de câmaras de recuperação de pequenas fatias</td></tr><tr><td>Prato de plástico de 35 mm, redondo</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Para a construção de câmaras de recuperação de pequenas fatias</td></tr><tr><td>Pedras difusoras de gás (10 &micro; m)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Para carbogenação constante (bolhas finas)</td></tr> <tr><td>Agarose Tipo I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Para incorporar espécimes cerebrais</td></tr><tr><td>Micro pontas de carregador</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Para encher eletrodos de patch clamp</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td></td><td>VWR 102092-312</td><td>Para fazer uma plataforma de dissecação personalizada</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Para ajuste de pH de mídia</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Para ajuste de pH de meios</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Para ajuste de pH de meios</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de plástico 3 mL graduadas</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Para transferência de</td></tr><tr><td>fatias Lâminas injetoras de cerâmica de zircônio</td><td>Lâminas especiais de cadência</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 vidro de borossilicato capilar com filamento</td> ID <td>de cotação personalizada</td><td>da King Glass Company</td><td>: 0,87 mm, OD 1,50 mm</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Solução de pipeta interna</td></tr><tr><td>Fosfocreatina dissódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Solução de pipeta interna</td></tr><tr><td>Gluconato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Solução de pipeta interna</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Solução de pipeta interna</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Solução de pipeta interna</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Solução de pipeta interna</td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Solução interna de pipeta</td></tr><tr><td>Banho-maria aquecido (2,5 L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>Papel</td></tr><tr><td>de filtro diverso redondos</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td></td></tr><tr><td>Diversos Cola de cianoacrilato</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Diversos</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Diversos</td></tr><tr><td>10X Fosfato tamponado com solução salina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Diversos</td></tr><tr><td>Seringas de 30 mL</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Diversos</td></tr><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Agulhas diversas</td></tr> de <tr><td>calibre 25 5/8</td><td>VWR</td><td>89219-292</td> Termomixer <td>diverso</td></tr><tr><td>(com bloco de tubo de 1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Para manter a agarose derretida&nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado n-metil-d-método de proteção de recuperação glucamine

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Este protocolo é um guia prático para o N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Numerosos estudos recentes têm validado a utilidade desse método para melhorar a preservação neuronal e viabilidade de fatia de cérebro global. A implementação desta técnica por adotantes tem facilitado investigações detalhadas sobre funções cerebrais usando diversas aplicações experimentais e abrangendo uma vasta gama de idades animais, regiões do cérebro e tipos de células. Passos são descritos para a realização da técnica de fatia de cérebro protetora de recuperação usando um otimizado NMDG artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) formulação de mídia e melhorado procedimento confiantemente obter fatias de cérebro saudável para eletrofisiologia de braçadeira do remendo. Com esta abordagem atualizada, observa-se uma melhoria substancial na velocidade e confiabilidade de gigaohm selar formação durante a braçadeira de remendo alvo gravação experiências, mantendo excelente preservação neuronal, facilitando, assim, um desafio aplicações experimentais. Resultados representativos são fornecidos de grampo multi neurônio remendo gravação experimentos a ensaiar conectividade sináptica em fatias de cérebro neocortical preparados a partir de ratos transgênicos adultos jovens e maduros espécimes adultos de neurocirurgia humanos. Além disso, o método de recuperação protetora NMDG otimizado de corte de cérebro é compatível com animais jovens e adultos, portanto, resolvendo uma limitação da metodologia original. Em resumo, uma formulação única mídia e cérebro procedimento de corte podem ser implementados através de diversas espécies e idades para alcançar excelente preservação viabilidade e tecido.

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias de cérebro saudáveis de animais adultos maduros que são adequados para experimentos de eletrofisiologia de patch clamp. Portanto, este Método de Recuperação Protetora NMDG otimizado para preparação de fatias cerebrais permite que os pesquisadores explorem as propriedades intrínsecas e sinápticas dos tipos de células cerebrais em muitas regiões cerebrais diferentes e para animais de praticamente qualquer idade. Portanto, a principal vantagem dessa técnica em particular é que ela permite preparar fatias de cérebro com maior grau de preservação neuronal em comparação com as metodologias anteriores.E também que essas fatias cerebrais são mais adequadas para gravação de patch clamp. Este método foi otimizado para tecido cerebral de camundongos adultos. Pode ser utilizado para uma variedade de outras espécies, incluindo tecido cerebral humano ressecado neurocirurgicamente.Para iniciar este procedimento, configure a estação de fatiamento com a máquina de corte de tecidos e instrumentos cirúrgicos. Prenda uma lâmina injetora de cerâmica de zircônio ao braço da lâmina usando cola adesiva rápida. Em seguida, insira o suporte da amostra e alinhe a borda dianteira da lâmina com a borda do suporte da amostra.Deixando uma pequena lacuna para garantir que a lâmina não raspe o metal. Encha um copo de 250 mililitros com 200 mililitros de NMDG HEPES aCSF. E pré-resfrie no gelo com carbogenação constante por mais de 10 minutos.Em seguida, configure a câmara inicial de recuperação da fatia do cérebro, enchendo-a com 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF. E coloque a câmara em banho-maria a 32 a 34 graus Celsius. Para configurar uma câmara de retenção de fatias de cérebro, encha o reservatório com 450 mililitros de HEPES aCSF e deixe-o aquecer à temperatura ambiente sob carbogenação constante até o uso.Em seguida, prepare a agarose derretida para a incorporação de tecidos, cortando um bloco de 2% de agarose do prato previamente preparado usando a extremidade aberta de um frasco cônico de 50 mililitros. Tampe frouxamente o frasco cônico e leve ao microondas por 10 a 30 segundos até que a agarose comece a derreter. Não superaqueça.Despeje a agarose derretida em tubos de 1,5 mililitro. Mantenha a agarose no estado fundido usando um termomixer ajustado para 42 graus Celsius com uma agitação vigorosa. E certifique-se cuidadosamente de que a agarose derretida não solidifique prematuramente.Pré-resfrie o bloco de resfriamento acessório para o fatiador no gelo neste momento. Neste procedimento, faça um corte na pele da cabeça para expor a calota craniana. Em seguida, use uma tesoura fina super cortada para cortar a pele sobre a calota craniana.E faça pequenas incisões lateralmente em ambos os lados da base ventral caudal do crânio. Faça cortes rasos adicionais começando no aspecto dorsal caudal do crânio, movendo-se na direção rostral até a linha média dorsal. Tomando cuidado para não danificar o cérebro subjacente.Depois disso, faça um corte final em T perpendicular à linha média ao nível dos bulbos olfatórios. Em seguida, use a pinça de ponta redonda para agarrar o crânio começando no aspecto medial rostral e descasque em direção à direção lateral caudal de um lado. Repita este procedimento para que o outro lado se abra.E remova as metades dorsais da calota craniana para expor o cérebro. Retire suavemente o cérebro intacto no copo de NMDG HEPES aCSF pré-resfriado. E permita que o cérebro esfrie uniformemente por cerca de um minuto.Agora, use uma espátula grande para transferir o cérebro do béquer para a placa de Petri coberta com papel de filtro. Apare e monte o cérebro de acordo com o ângulo preferido de corte e a região cerebral desejada de interesse. Trabalhe rapidamente para evitar a privação prolongada de oxigênio durante o manuseio.Em seguida, fixe o bloco cerebral no suporte da amostra usando cola adesiva. Retraia a peça interna do porta-amostras para retirar totalmente o bloco cerebral para dentro. Em seguida, despeje a agarose derretida diretamente no suporte até que o bloco cerebral esteja totalmente coberto de agarose.Em seguida, prenda o bloco de resfriamento acessório pré-resfriado ao redor do suporte da amostra por dez segundos até que a agarose solidifique. Insira o porta-amostras no receptáculo da máquina fatiadora e verifique o alinhamento adequado. Em seguida, encha o reservatório com o restante NMDG HEPES aCSF oxigenado pré-resfriado do béquer de 250 mililitros e coloque a pedra de bolha no reservatório durante o corte, para garantir a oxigenação adequada.Em seguida, ajuste o micrômetro para começar a avançar a amostra cerebral embebida em agarose. Inicie o fatiador e ajuste empiricamente a velocidade de avanço e a frequência de oscilação para o nível desejado. Continue avançando e cortando o tecido em incrementos de 300 micrômetros até que a região do cérebro de interesse esteja totalmente seccionada.O tempo total para o procedimento de fatiamento deve ser inferior a 15 minutos. Para recuperação inicial de NMDG. Após a conclusão do procedimento de seccionamento, colete todas as fatias usando uma pipeta de pastagem de plástico cortada e transfira-as para uma câmara de recuperação de 34 graus Celsius preenchida com 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF.O momento da etapa aguda de recuperação do corte cerebral é muito importante para poder encontrar um equilíbrio entre a preservação morfológica e a recuperação funcional das propriedades eletrofisiológicas de cada neurônio. Depois de determinar o esquema ideal de pico de sódio, de acordo com a idade do camundongo, execute o procedimento de pico de sódio da Etapa Y adicionando os volumes indicados de solução de pico de sódio nos horários indicados. Adicione a solução de pico de sódio diretamente na chaminé borbulhadora da câmara de recuperação inicial para facilitar a mistura rápida.O cronograma de pico de sódio que foi fornecido com uma variedade de faixas etárias diferentes é um bom ponto de partida. Mas deve ser otimizado e utilizado para seu próprio projeto experimental específico. Em seguida, transfira todas as fatias para a câmara de retenção de longo prazo HEPES aCSF mantida em temperatura ambiente.Deixe as fatias se recuperarem por mais uma hora na câmara de retenção HEPES antes dos experimentos de registro do grampo de conexão. Aqui são mostradas as imagens representativas de IR DIC que foram adquiridas de diversas regiões do cérebro e fatias agudas de um camundongo de três meses para a avaliação da preservação morfológica dos neurônios. Os resultados mostrados aqui são do uso do método de corte de proteção NMDG de controle sem uma etapa de recuperação protetora.Considerando que esses resultados são do método otimizado de recuperação protetora NMDG. No geral, a preservação neuronal aprimorada é observada com o método otimizado de recuperação protetora NMDG. O método otimizado de recuperação protetora NMDG com um procedimento gradual de pico de sódio foi comparado com o método original de recuperação protetora NMDG.O tempo médio para a formação do selo GigaOhm e o registro do patch clamp foi drasticamente e significativamente reduzido quando o procedimento gradual de pico de sódio foi aplicado junto com a etapa de recuperação protetora NMDG. A preservação aprimorada dos neurônios alcançada com este método de fatia de cérebro facilita aplicações experimentais desafiadoras, incluindo, mas não se limitando a, eletrofisiologia de grampo de remendo multi-eletrodo para sondar a conectividade sináptica local. Como demonstrado aqui, usando fatias de cérebro neocorticais ex vevo humanas adultas derivadas de neurocirurgia.Os cientistas devem ter uma boa compreensão ao assistir a este vídeo sobre como implementar nosso método otimizado de recuperação protetora NMDG, incluindo o novo procedimento de pico de sódio que descrevemos, para preparar fatias de cérebro adequadas para gravações de grampos de remendo. Portanto, depois de dominar este protocolo, deve ser possível concluir o procedimento de fatia de cérebro em menos de uma hora por dia. E deve produzir fatias de cérebro reproduzíveis de alta qualidade e funcionará para animais de praticamente qualquer idade.Portanto, este procedimento, este método pode ajudar a preparar fatias cerebrais adequadas para abordar questões sobre a função cerebral usando técnicas como eletrofisiologia, imagens ópticas ao vivo e optogenética, ensaios de tráfego de receptores e outros tipos de ensaios funcionais para explorar a função dos tipos de células cerebrais. Portanto, essa técnica também é útil porque ajudará os pesquisadores a sondar funcionalmente diferentes regiões do cérebro, incluindo regiões do cérebro que não são tradicionalmente passíveis de registro de patch clamp de animais adultos em fatias de cérebro.

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve um protocolo para obter fatias de cérebro usando um método de recuperação protetora baseado em N-metil-D-glucamina (NMDG). Um cérebro dissecado é incubado em um aCSF com NMDG e HEPES para minimizar a morte e os danos das células neuronais durante a secção. A seção pode se recuperar no aCSF para restaurar as atividades...

Preparação de seções cerebrais usando um método de recuperação protetora baseado em NMDG

Descrevemos dois métodos para visualização e quantificação da arborização dendrítica no hipocampo de modelos de camundongos: imagens em tempo real e de profundidade de campo estendida. Enquanto o primeiro método permite um rastreamento topográfico sofisticado e a quantificação da extensão da ramificação, o último permite a visualização rápida da árvore dendrítica.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Este protocolo descreve a estabilização do nível de oxigênio em um pequeno volume de tampão reciclado e aspectos metodológicos da plasticidade sináptica dependente de atividade de gravação em fatias hippocampal agudas submersas.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Este é um protocolo para preparação aguda de fatias de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos que se aproveita da perfusão transcárrica e corte de fatias com NMDG-aCSF gelado para reduzir danos hipóxicos ao tecido. As fatias resultantes permanecem saudáveis durante muitas horas, e são adequadas para grampos de remendo de longo prazo e gravações de campo.

Minimizando a hipóxia em fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos

Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Apresentamos um protocolo para preparar fatias agudas do hipocampo dorsal-intermediário de camundongos. Comparamos esta preparação transversal com o corte coronal em termos de qualidade de gravações e preservação de características morfológicas de neurônios registrados.

Preparação de fatias agudas do hipocampo dorsal para gravação de células inteiras e reconstrução neuronal no giro dentado de camundongos adultos

A Microscopia eletrônica de varredura de blocos de blocos serial (SBEM) é aplicada à imagem e análise de colunas dendríticas no hipocampo murino.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBEM) para o estudo de espinhas dendríticas

Aqui, é demonstrado como um modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado pode ser usado para examinar os efeitos do traumatismo cranioencefálico leve repetido (r-mTBI) na plasticidade sináptica no hipocampo. O modelo replica características importantes do r-mTBI em pacientes e é usado em conjunto com a eletrofisiologia in vitro .

Avaliação das Alterações na Plasticidade Sináptica Utilizando um Modelo de Traumatismo Cranioencefálico Leve

Este estudo apresenta um protocolo para o estabelecimento de um modelo animal altamente reprodutível de transformação hemorrágica (TH) usando oclusão/reperfusão da artéria cerebral média (MCAO/R) em camundongos C57BL/6 com hiperglicemia aguda.

Um modelo de camundongo de transformação hemorrágica induzida por hiperglicemia aguda combinada com isquemia focal transitória

Aprenda a preparar fatias de cérebro saudáveis usando o método de recuperação protetora com NMDG otimizado. Esta técnica preserva neurônios para eletrofisiologia de patch clamp em animais adultos.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

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