Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias de cérebro saudáveis de animais adultos maduros que são adequados para experimentos de eletrofisiologia de patch clamp. Portanto, este Método de Recuperação Protetora NMDG otimizado para preparação de fatias cerebrais permite que os pesquisadores explorem as propriedades intrínsecas e sinápticas dos tipos de células cerebrais em muitas regiões cerebrais diferentes e para animais de praticamente qualquer idade. Portanto, a principal vantagem dessa técnica em particular é que ela permite preparar fatias de cérebro com maior grau de preservação neuronal em comparação com as metodologias anteriores.

E também que essas fatias cerebrais são mais adequadas para gravação de patch clamp. Este método foi otimizado para tecido cerebral de camundongos adultos. Pode ser utilizado para uma variedade de outras espécies, incluindo tecido cerebral humano ressecado neurocirurgicamente.

Para iniciar este procedimento, configure a estação de fatiamento com a máquina de corte de tecidos e instrumentos cirúrgicos. Prenda uma lâmina injetora de cerâmica de zircônio ao braço da lâmina usando cola adesiva rápida. Em seguida, insira o suporte da amostra e alinhe a borda dianteira da lâmina com a borda do suporte da amostra.

Deixando uma pequena lacuna para garantir que a lâmina não raspe o metal. Encha um copo de 250 mililitros com 200 mililitros de NMDG HEPES aCSF. E pré-resfrie no gelo com carbogenação constante por mais de 10 minutos.

Em seguida, configure a câmara inicial de recuperação da fatia do cérebro, enchendo-a com 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF. E coloque a câmara em banho-maria a 32 a 34 graus Celsius. Para configurar uma câmara de retenção de fatias de cérebro, encha o reservatório com 450 mililitros de HEPES aCSF e deixe-o aquecer à temperatura ambiente sob carbogenação constante até o uso.

Em seguida, prepare a agarose derretida para a incorporação de tecidos, cortando um bloco de 2% de agarose do prato previamente preparado usando a extremidade aberta de um frasco cônico de 50 mililitros. Tampe frouxamente o frasco cônico e leve ao microondas por 10 a 30 segundos até que a agarose comece a derreter. Não superaqueça.

Despeje a agarose derretida em tubos de 1,5 mililitro. Mantenha a agarose no estado fundido usando um termomixer ajustado para 42 graus Celsius com uma agitação vigorosa. E certifique-se cuidadosamente de que a agarose derretida não solidifique prematuramente.

Pré-resfrie o bloco de resfriamento acessório para o fatiador no gelo neste momento. Neste procedimento, faça um corte na pele da cabeça para expor a calota craniana. Em seguida, use uma tesoura fina super cortada para cortar a pele sobre a calota craniana.

E faça pequenas incisões lateralmente em ambos os lados da base ventral caudal do crânio. Faça cortes rasos adicionais começando no aspecto dorsal caudal do crânio, movendo-se na direção rostral até a linha média dorsal. Tomando cuidado para não danificar o cérebro subjacente.

Depois disso, faça um corte final em T perpendicular à linha média ao nível dos bulbos olfatórios. Em seguida, use a pinça de ponta redonda para agarrar o crânio começando no aspecto medial rostral e descasque em direção à direção lateral caudal de um lado. Repita este procedimento para que o outro lado se abra.

E remova as metades dorsais da calota craniana para expor o cérebro. Retire suavemente o cérebro intacto no copo de NMDG HEPES aCSF pré-resfriado. E permita que o cérebro esfrie uniformemente por cerca de um minuto.

Agora, use uma espátula grande para transferir o cérebro do béquer para a placa de Petri coberta com papel de filtro. Apare e monte o cérebro de acordo com o ângulo preferido de corte e a região cerebral desejada de interesse. Trabalhe rapidamente para evitar a privação prolongada de oxigênio durante o manuseio.

Em seguida, fixe o bloco cerebral no suporte da amostra usando cola adesiva. Retraia a peça interna do porta-amostras para retirar totalmente o bloco cerebral para dentro. Em seguida, despeje a agarose derretida diretamente no suporte até que o bloco cerebral esteja totalmente coberto de agarose.

Em seguida, prenda o bloco de resfriamento acessório pré-resfriado ao redor do suporte da amostra por dez segundos até que a agarose solidifique. Insira o porta-amostras no receptáculo da máquina fatiadora e verifique o alinhamento adequado. Em seguida, encha o reservatório com o restante NMDG HEPES aCSF oxigenado pré-resfriado do béquer de 250 mililitros e coloque a pedra de bolha no reservatório durante o corte, para garantir a oxigenação adequada.

Em seguida, ajuste o micrômetro para começar a avançar a amostra cerebral embebida em agarose. Inicie o fatiador e ajuste empiricamente a velocidade de avanço e a frequência de oscilação para o nível desejado. Continue avançando e cortando o tecido em incrementos de 300 micrômetros até que a região do cérebro de interesse esteja totalmente seccionada.

O tempo total para o procedimento de fatiamento deve ser inferior a 15 minutos. Para recuperação inicial de NMDG. Após a conclusão do procedimento de seccionamento, colete todas as fatias usando uma pipeta de pastagem de plástico cortada e transfira-as para uma câmara de recuperação de 34 graus Celsius preenchida com 150 mililitros de NMDG HEPES aCSF.

O momento da etapa aguda de recuperação do corte cerebral é muito importante para poder encontrar um equilíbrio entre a preservação morfológica e a recuperação funcional das propriedades eletrofisiológicas de cada neurônio. Depois de determinar o esquema ideal de pico de sódio, de acordo com a idade do camundongo, execute o procedimento de pico de sódio da Etapa Y adicionando os volumes indicados de solução de pico de sódio nos horários indicados. Adicione a solução de pico de sódio diretamente na chaminé borbulhadora da câmara de recuperação inicial para facilitar a mistura rápida.

O cronograma de pico de sódio que foi fornecido com uma variedade de faixas etárias diferentes é um bom ponto de partida. Mas deve ser otimizado e utilizado para seu próprio projeto experimental específico. Em seguida, transfira todas as fatias para a câmara de retenção de longo prazo HEPES aCSF mantida em temperatura ambiente.

Deixe as fatias se recuperarem por mais uma hora na câmara de retenção HEPES antes dos experimentos de registro do grampo de conexão. Aqui são mostradas as imagens representativas de IR DIC que foram adquiridas de diversas regiões do cérebro e fatias agudas de um camundongo de três meses para a avaliação da preservação morfológica dos neurônios. Os resultados mostrados aqui são do uso do método de corte de proteção NMDG de controle sem uma etapa de recuperação protetora.

Considerando que esses resultados são do método otimizado de recuperação protetora NMDG. No geral, a preservação neuronal aprimorada é observada com o método otimizado de recuperação protetora NMDG. O método otimizado de recuperação protetora NMDG com um procedimento gradual de pico de sódio foi comparado com o método original de recuperação protetora NMDG.

O tempo médio para a formação do selo GigaOhm e o registro do patch clamp foi drasticamente e significativamente reduzido quando o procedimento gradual de pico de sódio foi aplicado junto com a etapa de recuperação protetora NMDG. A preservação aprimorada dos neurônios alcançada com este método de fatia de cérebro facilita aplicações experimentais desafiadoras, incluindo, mas não se limitando a, eletrofisiologia de grampo de remendo multi-eletrodo para sondar a conectividade sináptica local. Como demonstrado aqui, usando fatias de cérebro neocorticais ex vevo humanas adultas derivadas de neurocirurgia.

Os cientistas devem ter uma boa compreensão ao assistir a este vídeo sobre como implementar nosso método otimizado de recuperação protetora NMDG, incluindo o novo procedimento de pico de sódio que descrevemos, para preparar fatias de cérebro adequadas para gravações de grampos de remendo. Portanto, depois de dominar este protocolo, deve ser possível concluir o procedimento de fatia de cérebro em menos de uma hora por dia. E deve produzir fatias de cérebro reproduzíveis de alta qualidade e funcionará para animais de praticamente qualquer idade.

Portanto, este procedimento, este método pode ajudar a preparar fatias cerebrais adequadas para abordar questões sobre a função cerebral usando técnicas como eletrofisiologia, imagens ópticas ao vivo e optogenética, ensaios de tráfego de receptores e outros tipos de ensaios funcionais para explorar a função dos tipos de células cerebrais. Portanto, essa técnica também é útil porque ajudará os pesquisadores a sondar funcionalmente diferentes regiões do cérebro, incluindo regiões do cérebro que não são tradicionalmente passíveis de registro de patch clamp de animais adultos em fatias de cérebro.