Usando tomografia Micro-computadas para a avaliação do desenvolvimento do tumor e Acompanhamento da resposta ao tratamento em um modelo do rato do cancro do pulmão

O objetivo geral deste vídeo é identificar as vantagens do uso de Micro CT, para a avaliação do desenvolvimento do tumor, resposta ao tratamento e outros experimentos em modelos de câncer de pulmão em camundongos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de pulmão ao usar o modelo de camundongos, como quando os tumores começam a crescer, a taxa de crescimento e a resposta a intervenções terapêuticas. Essa técnica nos permite identificar quais animais devem ser excluídos de nosso estudo, ao mesmo tempo em que detectamos mudanças em tempo real no tamanho do tumor.

A técnica economiza tempo e esforço e reduz significativamente o número de camundongos por grupo de estudo. No scanner Micro-CT, acesse o controle do computador e abra o pacote de software chamado RMCT2"Em seguida, inicie o ciclo de aquecimento. Em seguida, prepare a cama de amostra do scanner, para o mouse, envolvendo-a em plástico.

Em seguida, anestesiar o camundongo com isoflurano e confirmar se ele está anestesiado, usando uma pitada de pele. Uma pitada suave de uma pequena dobra de pele é suficiente. Em seguida, aplique uma pomada oftálmica para evitar o ressecamento da córnea.

Agora coloque o mouse, com o lado dorsal para cima, no leito de amostra. Segure a cabeça do mouse e puxe o corpo para baixo a partir dos membros inferiores para esticar e endireitar o corpo simetricamente. Em seguida, encaminhe o gás anestésico para a câmara e posicione o tubo de gás próximo ao nariz do animal, para administrar anestésico contínuo.

Em seguida, embrulhe o mouse e a cama de amostra com plástico, para mantê-lo no lugar. Certifique-se de que o mouse esteja seguro, pois qualquer movimento ou torção durante a verificação resultará em imagens nebulosas e inutilizáveis. Agora, feche a câmara, ajuste o sistema para 90 quilovolts e 160 microamperes e defina o tempo de varredura para 4,5 minutos.

Defina o intervalo da imagem para 24 milímetros. Em seguida, defina o sistema no modo síncrono para pulsações. Agora, crie uma nova pasta no banco de dados para as novas imagens e inicie a digitalização.

Depois de concluir a varredura, mova o mouse para uma gaiola vazia e observe-o até que ele recupere a consciência. Não o devolva aos seus companheiros de alojamento até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Abra os arquivos de imagem de micro CT serial na imagem J.Percorra todas as imagens de cada mouse do pescoço ao abdômen ou vice-versa.

Agora, usando varreduras de camundongos ingênuos do tipo selvagem, identifique a densidade de diferentes áreas e estruturas anatômicas normais no tórax. Role até as vísceras abdominais esbranquiçadas e o diafragma e identifique a área através do tórax e até o pescoço. Observe os marcos da caixa torácica óssea, o esterno, as vértebras e as costelas.

Em seguida, identifique o coração na frente do tórax e os principais vasos sanguíneos próximos ao coração e no mediastino. O lúmen traqueal é um pequeno círculo escuro ao nível do pescoço e da parte superior do tórax, que se bifurca nos brônquios principais direito e esquerdo e continua a se ramificar em brônquios cada vez menores. Observe que cada brônquio está intimamente associado a dois ou três vasos sanguíneos.

Agora, comece a examinar as varreduras de camundongos DT não induzidos e identifique a presença de quaisquer anormalidades. Excluir do experimento quaisquer camundongos com sombras pulmonares pré-indução anormais, como nódulos ou bolhas enfisematosas. Para este experimento, use camundongos com varreduras pulmonares normais que podem produzir tumores induzidos por FGF9.

Para induzir os tumores, forneça doxiciclina em sua ração a 200 partes por milhão. Após 10 semanas, realize uma segunda microtomografia computadorizada desses camundongos para confirmar o desenvolvimento de nódulos tumorais em seus pulmões. Em seguida, divida os ratos em dois grupos.

Administre o bloqueador FGFR, AZD4547, a um grupo por meio de um tubo gástrico. Faça isso por 6 dias por semana durante 10 semanas. Dê ao outro grupo um placebo.

Acompanhe as mudanças nas sombras nodulares realizando uma terceira varredura quatro a cinco semanas após o início do tratamento. Mais tarde, no final do tratamento completo de 10 semanas, faça uma quarta varredura. Em seguida, identifique alterações dinâmicas nos nódulos tumorais, em resposta ao tratamento, comparando posições semelhantes dentro das imagens de varredura seriada nos diferentes momentos.

Procure o aparecimento ou desaparecimento de quaisquer sombras anormais. Orientar corretamente para a mesma posição anatômica é fundamental para interpretar os resultados. Use pontos anatômicos facilmente identificados dentro do tórax, como a traqueia, sua bifurcação, os brônquios principais direito e esquerdo, a aorta e os grandes vasos sanguíneos e o diafragma.

Por causa das inclinações do corpo, os ossos são pontos de referência menos úteis. Depois de sacrificar um rato e acessar seu pescoço e pulmões, corte o coração e a glândula timo. Insira uma pinça atrás da traqueia para separá-la do esôfago.

Em seguida, canule a traqueia usando uma cânula G24 e prenda a cânula amarrando uma sutura colocada ao redor da ponta intertraqueal. Agora, infle e fixe o pulmão usando 4%PFA gelado através da cânula com uma coluna de 25cm. Em seguida, retire a cânula e aperte o nó na traqueia para evitar vazamento de PFA.

Agora, corte a traqueia superior, incluindo sua fixação à laringe. E enquanto puxa a traqueia do fio de sutura, disseque a traqueia e os pulmões de todos os anexos. Em seguida, remova a traqueia com os pulmões en blanc.

Coloque os lenços em um tubo de 15ml contendo 5ml de PFA 4% em temperatura ambiente. Deixe os pulmões em PFA durante a noite para penetração e fixação completa do tecido. Em seguida, processe o tecido como de costume.

Na pré-triagem de camundongos DT de 8 a 12 semanas de idade para este estudo, cerca de metade mostrou anormalidades pulmonares na microtomografia computadorizada, tornando-os inadequados para inclusão. Para o estudo, a indução do tumor foi ativada por 10 semanas, seguida de tratamento. Os camundongos que receberam o inibidor de FGFR, AZD4547, por 10 semanas exibiram desaparecimento ou redução no tamanho dos nódulos visíveis nos exames pré-tratamento.

Por outro lado, os camundongos controle que receberam placebo não apresentaram alteração, aumento no tamanho do nódulo e/ou aparecimento de novos nódulos. A avaliação histológica do ponto final dos pulmões confirma a precisão dos achados feitos com a microtomografia computadorizada. Os camundongos considerados como tendo pulmões claros, de fato, tinham histologia pulmonar normal.

Considerando que, os camundongos que apresentaram anormalidades apresentaram várias alterações histológicas, incluindo bolhas e nódulos. Após 10-12 semanas de indução com doxiciclina, múltiplos nódulos de adenocarcinoma, com tamanhos e posições variáveis, foram observados em todos os animais. O tratamento subsequente com 10-12 semanas de um bloqueador de FGFR mostrou menos e menores nódulos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o Micro-CT para avaliar o desenvolvimento de tumor no pulmão de camundongo. E acompanhar quaisquer alterações nesses tumores, em resposta a vários procedimentos experimentais. Uma vez que o mouse inicia, as varreduras podem ser realizadas em menos de 10 minutos por mouse.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o mouse sob anestesia profunda e firmemente preso ao leito de amostra para minimizar o movimento durante os exames. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer de pulmão e células-tronco cancerígenas explorarem a extensão do desenvolvimento do tumor, regressão progressiva e o cenário de diferentes experimentos. Não se esqueça de que trabalhar com raios-X pode ser perigoso.

Na máquina padrão, os procedimentos de execução devem sempre ser realizados durante a execução deste procedimento.