Name: Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a quantificar microRNAs circulantes em plasma ou soro usando PCR digital em gotículas com alta sensibilidade. Este método permite detectar biomarcadores de câncer em estágios iniciais sem necessidade de genes de referência.

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Apoiado pelo financiamento da Associação Italiana de Investigação do Cancro (AIRC) para MF (MFAG 11676) e MN (Oncologia Clínica Programa Especial Molecular -. 5 por mille n 9980, 2010/15) e do Ministério Italiano da Instrução, da Universidade e FIRB Research 2011 para MN (Project RBAPIIBYNP).

Isolamento MicroRNA a partir de plasma ou soro Nota: Plasma e preparação do soro é um passo importante na circulação de miRNA quantificação. Não há nenhum procedimento preferido para o plasma e preparação do soro. A única coisa importante a considerar é que todas as amostras de um mesmo experimento deve ser processado usando exatamente o mesmo fluxo de trabalho. Iniciar a partir de soro ou de plasma de 200 ul. O ARN total pode ser isolado a partir de soro ou plasma, utilizando kits disponíveis comercialmente. 1. Protocolo para RNA total (incluindo miRNA) Isolamento <ol><li> As amostras de soro / plasma descongelamento em gelo. </li><li> Adicionar 1 ml de Reagente de Lise (por ex., QIAzol) a 200 ul de soro / plasma. </li><li> Misturar em vortex e colocar o tubo contendo o homogeneizado no banco à TA durante 5 min. </li><li> Adicionar 3 ml de uma solução 4,16 nM de miARN CEL-miR-39-3p sintético de C. elegans. </li><li> Adicionar 200 ul de clorofórmio. Agitar o tubo vigorosamente durante 15 sec. º lugare tubo no banco à TA, durante 2 min. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 12000 xg, a 4 ° C para se obter a separação fases: a fase aquosa superior contém ARN. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo, cerca de 700 ul, evitar a transferência de qualquer material interfase branca. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol a 100% e misturar por inversão. </li><li> Pipeta-se 700 mL da amostra para uma coluna mini-rotação colocado em um tubo de recolha de 2 ml. Fechar a tampa e centrifugar a 12000 xg durante 15 seg. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Repita este passo usando a amostra restante. </li><li> Adicionar 700 mL de buffer ERP para o mini coluna de rotação, feche a tampa e centrifugar por 15 segundos a 12.000 xg para lavar a coluna. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Pipetar 500 ul de tampão de RPE para o mini coluna de centrifugação. Feche a tampa e centrifugar por 15 segundos a 12.000 rpm. Descartar o fluxo de passagem. Repita este passo novamente. </li><li> Centrifugar o mini coluna de centrifugação à velocidade máxima por 2 minutos para secar a coluna de spinmembrana a partir de etanol residual. </li><li> Transferir o mini coluna de centrifugação para um novo tubo de recolha de 1,5 ml e pipeta 35 ul de água isenta de RNase na membrana da coluna. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto a 12000 xg para eluir o ARN. </li><li> Armazenar o ARN a -80 ° C. Nota: Uma vez que a concentração de RNA não pode ser determinada com precisão, use volumes fixos como uma medida para a quantidade de entrada. </li></ol> 2. MicroRNA Transcrição Reversa <ol><li> Descongelar a transcrição reversa (RT) componentes de mistura de reagente de tampão de reacção: 5x, água isenta de nuclease. Misture suavemente, invertendo os tubos e colocar no gelo. Imediatamente antes da utilização, retire a mistura de enzimas do congelador e colocar no gelo. Spin down todos os reagentes. </li><li> Preparar a mistura de reagente de RT em gelo tal como descrito na Tabela 1. Preparar pelo menos 10% de mistura superior. </li><li> Misture a reacção por pipetagem, e, em seguida girar para baixo. </li><li> Incubar durante 60 min a 42 ° C. </li><li> Calor-inactivar a reverSE transcriptase durante 5 min a 95 ° C. </li><li> Imediatamente fria a 4 ° C. </li><li> Armazenar o cDNA a -20 ° C. </li></ol> 3. cDNA Diluição <ol><li> Diluir a quantidade de modelo de cDNA necessária para as reações ddPCR planejadas em água livre de nuclease. Dilui-se a reacção de ADNc entre 1:50 e 1: 500 em água, dependente da abundância alvo miARN. Armazenar o ADNc diluída a -20 ° C. O cDNA diluído provou ser estável durante pelo menos 3 meses a -20 ° C. </li></ol> 4. gota Geração e PCR Nota: A geração da gota deve ser realizada em 8 amostras de cada vez. Repetições técnicas não são necessárias, devido à elevada reprodutibilidade desta tecnologia 12,15 .A Nenhum modelo de controlo (NTC) amostra deve ser executado em cada placa, e para cada condição ddPCR diferente. <ol><li> Descongelar e equilibrar a mistura principal (por exemplo., EvaGreen Mix Master), microRNA conjunto de primers e cDNA à temperatura ambiente. </li><li> Misturar o th Mistura Principaloroughly invertendo o tubo várias vezes. Spin down todos os reagentes. </li><li> Preparar a mistura de ddPCR como descrito na Tabela 2. Quando várias reacções são realizadas ddPCR, preparar um ddPCR misturar-solução de trabalho. Preparar pelo menos 10% de mistura superior. </li><li> Uma vez montado, misturar cuidadosamente e girar a mistura ddPCR. </li><li> Pipetar 12 ul de ddPCR misturar em uma placa com 96 poços de PCR ou tubos PCR. </li><li> Adicionar 8 mL de modelo de cDNA diluído a cada tubo / poço. </li><li> Insira o cartucho gerador de gotículas no suporte. </li><li> Transferir 20 uL de cada amostra para os poços de amostra (linha do meio) do cartucho gerador de gota cuidadosamente, evitando bolhas de ar na parte inferior do poço. </li><li> Encha cada poço de petróleo (linha de fundo) com 70 l de óleo gerador de gota. </li><li> Gancho a junta sobre o suporte do cartucho e insira no gerador de gota. </li><li> Feche a tampa para iniciar a geração de gotículas de acordo com a pr do fabricanteotocol. Quando a geração de gota tenha terminado, abra a tampa, retire a junta descartável. Os poços superior do cartucho conter as gotículas. </li><li> Pipetar lenta e suavemente 40 ul do conteúdo dos oito poços de topo (as gotas) em uma única coluna de uma placa de 96 poços de PCR. </li><li> Selar a placa PCR com a folha imediatamente após a transferência de gotas para evitar a evaporação. Use selos perfuráveis ​​placa de folha que são compatíveis com as agulhas no leitor de gotícula. </li><li> Comece a ciclos térmicos (PCR) no prazo de 30 min de selagem da placa. </li><li> Execute o protocolo de ciclismo de acordo com a Tabela 3. </li></ol> 5. Gota Reading <ol><li> Ligue o leitor de gota. </li><li> Mover a placa do termociclador para o leitor gota. </li><li> Colocar a placa de PCR de 96 poços contendo as gotículas de pós-PCR para a base de suporte da placa. </li><li> Coloque a parte superior de suporte da placa sobre a placa de PCR. Pressione firmemente ambos os guias de liberaçãopara baixo para fixar a placa de PCR no suporte. </li><li> Inicie o software do PC do sistema. <ol><li> Clique em Configurar para definir o experimento (quantificação absoluta), em seguida, clique em Executar para iniciar a leitura gota. </li><li> Quando leitura gota está completa, clique em &quot;Analisar&quot; botão para abrir e analisar os dados. </li><li> Use o enredo amplitude 2D no software de análise para selecionar as gotículas positivos (Lasso Tool) (Figura 1B). </li><li> Use a guia Eventos para verificar o número de gotículas positivos e totais. Um número total de 18.000 - 21.000 gotículas é geralmente obtida com probeless ddPCR. </li><li> Uma vez que as gotículas positivos são seleccionados, exportar os valores de concentração de miRNA usando a opção de exportação .csv a partir da guia Concentração. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

miARNs circulantes estão presentes no sangue em concentrações extremamente baixas e a quantidade de ARN que pode ser extraída a partir de amostras de plasma e soro é baixa. Por esta razão, eles são difíceis de quantificar com outras técnicas tais como a sequenciação de ARN e micro-arranjo. Além disso, há uma falta generalizada de acordo com a normalização de dados e a presença de miARNs endógenos de &quot;referência&quot; no sangue. Neste contexto, uma tecnologia de PCR sensíveis, como digitais gota, capaz de contar o n...

MicroRNAs (miRNAs) são liberados na circulação sanguínea por potencialmente todas as células do organismo, como consequência da liberação ativa ou processos necróticos e apoptóticos. MiRNAs livres de células foram detectados na corrente sanguínea como moléculas estáveis livres ou ligadas a lipoproteínas ou envoltas dentro de exossomos e microvesículas 1-3. Acredita-se que funcionem como comunicadores célula a célula 4, e sua quantidade muda na presença de câncer, distúrbios cardíacos ou doenças autoimunes 5-7. Sua quantificação precisa e reprodutível é a base para sua avaliação como biomarcadores de doenças. No entanto, por várias razões já descritas em outro artigo 8,9, a quantificação de miRNAs no soro ou plasma, bem como em outros fluidos corporais, pode ser muito desafiadora 10,11. Recentemente, desenvolvemos um método para a quantificação absoluta de miRNAs circulantes, baseado em primers LNA específicos para miRNA e tecnologia de PCR digital de gotículas de corante de ligação ao DNA (ddPCR) 12. Essa metodologia tem sido aplicada à validação de biomarcadores de câncer de mama miRNA 13,14. 
Após o particionamento de cada molécula de miRNA transcrita reversa dentro de uma gota do tamanho de um nanolitro, é possível contar o número de cópias de cada miRNA em cada amostra, basicamente contando o número de gotículas fluorescentes verdes e, portanto, positivas. Assim que ocorre uma reação de PCR, uma contagem positiva é alcançada, sem a necessidade de estabelecer uma curva padrão ou levar em consideração a eficiência da PCR no cálculo da quantidade alvo, como acontece com o RT-PCR quantitativo (RT-qPCR). Além disso, a ddPCR mostrou-se mais sensível e precisa do que a RT-qPCR na quantificação de miRNAs circulantes 15. Neste artigo apresentamos o protocolo detalhado desta metodologia, discutindo as etapas mais relevantes e considerando especificamente amostras clínicas de soro e plasma.

<table><tbody><tr><td>Kit Mini miRNeasy</td> Colunas <td>de 217004</td><td>Qiagen</td><td>para RNA total, incluindo miRNA, extração de soro/plasma</td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>Sequência Personalizada</td><td>: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Kit universal de síntese de cDNA II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>Kit para microRNA transcrição reversa</td></tr><tr><td>MicroRNA LNA PCR primer set&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx e 2100000-21xxxxx</td><td>Primers para amplificação de miRNA dentro de gotículas</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>Instrumento usado para leitura de gotículas</td></tr><tr><td>Leitor de gotículas QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>Instrumento usado para geração de gotículas</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>Software para coleta e análise de dados</td></tr><tr><td>Seladora de placas PCR PX1</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>Seladora de placas</td></tr><tr><td>Cartuchos e juntas geradoras de gotículas DG8</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>Cartuchos usados para misturar amostra e óleo para gerar gotículas</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen supermix</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR supermix</td></tr><tr><td>Óleo gerador de gotículas QX200 para corante EvaGreen</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>Óleo para geração de gotículas</td></tr></tbody></table>

circulando microrna quantificação usando dna de ligação dye química e gota digital pcr

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (da isentos de células) microARNs (miARNs) são libertados a partir de células para a corrente sanguínea. A quantidade de microARNs específicos na circulação tem sido associada a um estado de doença e tem o potencial de ser utilizado como biomarcador da doença. Um método sensível e preciso para a circulação de microARN quantificação usando uma química à base de corantes e gota a tecnologia de PCR digital foi desenvolvido recentemente. Especificamente, utilizando Locked Nucleic Acid (LNA) à base de iniciadores específicos de miARN com um corante de ligação a ADN fluorescente verde num sistema de PCR compatível gota digital, é possível obter a quantificação absoluta de miARNs específicos. Aqui, nós descrevemos como realizar esta técnica para avaliar a quantidade de miARN em fluidos biológicos, tais como plasma e soro, é viável e eficaz.

A quantidade absoluta de miARNs específicos por mililitro de plasma ou soro pode ser determinada utilizando um corante de ligação a ADN fluorescente verde e gota a tecnologia de PCR digital. A Figura 1 apresenta o processo de selecção do gotículas positivo, o qual determina a concentração final de miARN (cópias / ul ) na reacção de amplificação calculada pelo software de análise. A quantidade de cada um miARN no sangue é muito diferente, sendo algumas espécies de miARN m...

Um método sensível e preciso para quantificação de microRNAs livres de células usando uma química baseada em corante e tecnologia de PCR digital de gotículas é descrito.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar microRNAs circulantes em fluidos biológicos, como plasma ou soro, utilizando a tecnologia de PCR digital em gotas. O método pode ajudar a responder perguntas na área de biomarcadores. Ao identificar biomarcadores diagnósticos e prognósticos, é possível avançar no estudo do câncer.A principal vantagem desta técnica reside na alta sensibilidade. Ela pode ser utilizada para quantificar também microRNAs menos abundantes, sem necessidade de um gene de referência andrógeno. As implicações deste método estendem-se para o diagnóstico de câncer, pois ele tem o potencial de identificar pessoas com câncer em estágio inicial.Ele também pode ser aplicado a outras doenças, como distúrbios neurológicos ou cardíacos. Geralmente, os indivíduos precisam prestar atenção na manipulação das gotículas antes da etapa de ciclagem térmica para evitar sua ruptura. Portanto, uma demonstração visual da geração de gotículas é essencial, pois as gotículas podem ser destruídas por manipulação descuidada ou pipetagem muito rápida.Inicie este procedimento isolando microRNAs do plasma ou soro. Em seguida, realize a transcrição reversa e dilua-os conforme descrito no documento complementar. Retire o conjunto de primers do mix mestre EvaGreen e o cDNA do congelador e deixe-os descongelar em temperatura ambiente.Após o descongelamento, inverta o tubo da mistura mestra várias vezes. Em seguida, centrifugue todos os reagentes. Prepare uma solução de trabalho de digital droplet, ou ddPCR, conforme as instruções no documento anexo.Prepare quantidade suficiente para até oito amostras, com um controle sem modelo para cada condição, mais um excesso de 10%. Após a montagem, misture bem e centrifugue a mistura de ddPCR. Observe que réplicas técnicas não são necessárias devido à alta reprodutibilidade desta tecnologia. Após a centrifugação, distribua 12 microlitros da mistura de ddPCR em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços.Adicione oito microlitros do molde de cDNA diluído a cada poço. Em seguida, insira o cartucho do gerador de gotas no suporte do cartucho. Para a fileira central do cartucho do gerador de gotas, transfira cuidadosamente 20 microlitros de cada amostra preparada.Evite introduzir bolhas de ar na parte inferior do poço. Encha cada um dos poços de óleo da linha inferior com 70 microlitros de óleo gerador de gotas. Encaixe a junta sobre o suporte do cartucho.Insira no gerador de microgotas e feche a tampa para iniciar a geração de microgotas. Quando a geração de microgotas for concluída, abra a tampa, remova o cartucho do gerador de microgotas e retire a junta descartável. Os poços superiores do cartucho contêm as microgotas.Transfira lentamente e suavemente 40 microlitros de cada um dos oito poços superiores para uma única coluna de uma placa PCR de 96 poços. Sobreponha imediatamente a placa com folha de alumínio para evitar evaporação. Dentro de 30 minutos após vedar a placa, inicie o ciclo térmico utilizando o protocolo de PCR descrito na tabela três do documento anexo.Ligue o leitor de gotas. Em seguida, transfira a placa do ciclador térmico para o leitor de gotas. Coloque a placa PCR de 96 poços contendo as gotas pós-PCR na base do suporte de placas do leitor de gotas.Coloque a parte superior do suporte na placa de PCR. Pressione firmemente as duas abas de liberação para baixo para fixar a placa de PCR no suporte. Inicie o software QuantaLife a partir do PC do sistema. Clique em Configuração e abra o arquivo de modelo de dados que contém informações sobre as amostras, genes-alvo e ensaios.No painel de navegação do lado esquerdo, selecione Executar. Uma janela de Opções de Execução será exibida. No menu Conjunto de Corante, selecione EVA e clique em OK para iniciar a leitura das gotas.Após a conclusão da corrida, utilize o gráfico de amplitude 2D no software de análise para selecionar as gotículas positivas. Para selecionar as gotículas positivas, use a ferramenta de laço localizada na barra de navegação lateral esquerda. Em seguida, clique na aba Eventos para verificar o número de gotículas positivas e o número total de gotículas.Normalmente, um número total de 18.000 gotículas é obtido com ddPCR sem sonda. Em seguida, clique na aba Concentração para visualizar a amostra final de concentração. Por fim, utilize a Exportação.CSV para exportar os valores de concentração de microRNA. O mRNA miR-181a-5p foi quantificado em duas amostras de plasma, S1 e S2, utilizando concentrações de primer de 0,5 e um microlitro em temperaturas de anelamento de 58 e 60 graus Celsius. Esta figura apresenta as cópias de microRNA por microlitro na reação de amplificação para cada condição.As gotas positivas para PCR de cada amostra são mostradas em azul, e as gotas negativas são mostradas em preto. Como pode ser visto aqui, a amostra controle não possui gotas positivas, conforme esperado. Realizar a PCR a 60 graus Celsius utilizando 0,5 ou um microlitro de iniciador resultou em uma melhor separação entre gotas positivas e negativas.Nesta figura, as barras de erro representam o intervalo de confiança de Poisson de 95%. E aqui, o número de gotículas positivas mostradas em azul é comparado ao número total de gotículas, mostradas em verde. Em conjunto, esses dados demonstram que a PCR digital em gotículas pode ser utilizada para determinar o número absoluto de cópias de microRNA por microlitro de um fluido biológico.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a quantificação de mRNA utilizando a PCR digital em gotas. Uma vez dominada, 96 amostras podem ser analisadas em apenas algumas horas, o que representa um resultado ideal para um ambiente clínico. Após cada avanço, essa técnica abre caminho para o campo da biópsia líquida, possibilitando a exploração de microRNAs e outros ácidos nucleicos como biomarcadores de doenças.

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Bioengenharia

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Neste vídeo, apresentamos um procedimento passo a passo para gerar nanogotículas emulsionadas para detectar ácidos nucléicos alvo por reação em cadeia da polimerase digital ou dPCR.

Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas: um método para gerar reações de PCR de nanogotículas para detectar mutações tumorais raras

Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe amplamente conservada de moléculas reguladoras. Aqui descrevemos um método de clonagem de miRNA que se baseia em duas etapas de ligação potentes seguidas de sequenciamento de alto rendimento. Nosso método permite a quantificação precisa de miRNAs em todo o genoma.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

MicroRNAs circulam surgiram recentemente como biomarcadores promissoras e inovadoras para vários tipos de câncer e outras doenças. O objetivo deste artigo é discutir três diferentes plataformas baseadas em sonda de PCR em tempo real e métodos que estão disponíveis para quantificar e determinar a abundância de microRNAs em circulação.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Descrevemos um ensaio digital de ponto final para quantificar ácidos nucléicos com uma leitura simplificada (analógica). Medimos a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas usando uma máquina de qPCR padrão em vez de instrumentação especializada e confirmamos nossos resultados por microscopia.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR com ou sem pré-amplificação. Este protocolo permite melhor entendimento da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação qualitativa da correspondentes dados de diferentes estudos ou laboratórios.

Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR

MicroRNAs circulantes têm mostrado promessa como biomarcadores para doenças cardiovasculares e aguda do miocárdio. Neste estudo, descrevemos um protocolo para extração de miRNA, a transcrição reversa e PCR digital para a quantificação absoluta dos miRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular.

PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

Este protocolo descreve o método detalhado de PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificação precisa dos níveis de RNA circular (circRNA) em células usando primers divergentes.

Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais

Aprenda a quantificar microRNAs circulantes em plasma ou soro usando PCR digital em gotículas com alta sensibilidade. Este método permite detectar biomarcadores de câncer em estágios iniciais sem necessidade de genes de referência.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

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