Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

O objetivo geral deste procedimento é quantificar microRNAs circulantes e fluidos biológicos, como plasma ou soro, usando a tecnologia de PCR digital de gotículas. O método pode ajudar a responder a perguntas no campo do biomercado. Ao identificar o câncer diagnóstico e prognóstico, biomarketing.

A principal vantagem desta técnica está na alta sensibilidade. Pode ser usado para quantificar também os microRNAs menos abundantes sem a necessidade de um gene de referência andrógino. A implicação desse método se estende ao diagnóstico do câncer porque tem o potencial de identificar pessoas com câncer em estágio inicial.

Também pode ser aplicado a outras doenças, como distúrbios neurológicos ou cardíacos. Geralmente, os indivíduos precisam prestar atenção à manipulação das gotículas antes da etapa de ciclagem térmica para evitar sua interrupção. Portanto, uma demonstração visual da geração de gotículas é crítica porque as gotículas podem ser destruídas por manipulação descuidada ou pipetagem muito rápida.

Comece este procedimento isolando microRNAs de plasma ou soro. Em seguida, transcrevendo e diluindo-os conforme descrito no documento anexo. Remova o conjunto de primers de microRNA da mistura mestre EvaGreen e o cDNA do freezer e deixe-os descongelar em temperatura ambiente.

Depois de descongelado, inverta o tubo da master mix várias vezes. E então gire para baixo todos os reagentes. Prepare uma solução de trabalho de gotículas digitais ou mistura de ddPCR de acordo com as instruções no documento anexo.

Prepare o suficiente para até oito amostras com um controle sem modelo para cada condição mais um excesso de 10%Depois de montado, misture bem e gire a mistura de ddPCR. Observe que as réplicas técnicas não são necessárias devido à alta reprodutibilidade dessa tecnologia. Após a centrifugação, dispense 12 microlitros de mistura de ddPCR em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços.

Adicione oito microlitros de molde de cDNA diluído a cada poço. Em seguida, insira o cartucho gerador de gotículas no suporte do cartucho. Para a linha do meio do cartucho gerador de gotículas, transfira cuidadosamente 20 microlitros de cada amostra preparada.

Evite introduzir bolhas de ar no fundo do poço. Encha cada um dos poços de petróleo na linha inferior com 70 microlitros de óleo gerador de gotículas. Prenda a junta sobre o suporte do cartucho.

Insira no gerador de gotículas e feche a tampa para iniciar a geração de gotículas. Quando a geração de gotículas terminar, abra a tampa, remova o cartucho do gerador de gotículas e remova a junta descartável. Os poços superiores do cartucho contêm as gotículas.

Transfira lenta e suavemente 40 microlitros de cada um dos oito poços superiores para uma única coluna de uma placa de PCR de 96 poços. Sele imediatamente a placa com papel alumínio para evitar a evaporação. Dentro de 30 minutos após a selagem da placa, inicie o ciclo térmico usando o protocolo de PCR descrito na tabela três do documento anexo.

Ligue o leitor de gotículas. Em seguida, mova a placa do termociclador para o leitor de gotículas. Coloque a placa de PCR de 96 poços contendo as gotículas pós-PCR na base do suporte da placa no leitor de gotículas.

Coloque a parte superior do suporte da placa na placa PCR. Pressione firmemente ambas as abas de liberação para baixo para prender a placa PCR no suporte. Inicie o software QuantaLife a partir do PC do sistema. Clique em Configurar e abra o arquivo de dados de modelo que contém informações sobre as amostras, genes-alvo e ensaios.

Na barra de navegação do lado esquerdo, selecione Executar. Uma janela Opções de execução será exibida. No menu Conjunto de corantes, selecione EVA e clique em OK para iniciar a leitura das gotículas.

Quando a execução estiver concluída, use o gráfico de amplitude 2D no software de análise para selecionar as gotículas positivas. Para selecionar as gotículas positivas, use a ferramenta laço na barra de navegação do lado esquerdo. Em seguida, clique na guia Eventos para verificar o número de gotículas positivas e totais.

Um número total de 18.000 gotículas é geralmente alcançado com ddPCR sem sonda. Em seguida, clique na guia Concentração para visualizar a amostra final de concentração. Por fim, use o botão Exportar.

CSV para exportar os valores de concentração de microRNA. O mRNA miR-181a-5p foi quantificado em duas amostras de plasma, S1 e S2, usando concentração de primer de 0,5 e um microlitro em temperaturas de recozimento de 58 e 60 graus Celsius. Esta figura apresenta as cópias de microRNA por microlitro na reação de amplificação para cada condição.

As gotículas positivas de PCR para cada amostra são mostradas em azul e as gotículas negativas são mostradas em preto. Como pode ser visto aqui, a amostra de controle não tem gotículas positivas como esperado. A realização da PCR a 60 graus Celsius com o uso de 0,5 ou um microlitro de primer resultou em uma melhor separação de gotículas positivas e negativas.

Nesta figura, as barras de erro representam o intervalo de confiança de Poisson de 95%. E aqui, o número de gotículas positivas mostradas em azul é comparado ao número total de gotículas, mostrado em verde. Em conjunto, esses dados demonstram que a PCR digital de gotículas pode ser usada para determinar o número absoluto de cópias de microRNA por microlitro de um fluido biológico.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar uma quantificação de mRNA usando PCR digital de gotículas. Uma vez dominadas, 96 amostras podem ser analisadas em apenas algumas horas, o que é um resultado ideal para um ambiente clínico. Após cada desenvolvimento, esta técnica abre caminho para o campo da biópsia líquida para explorar o microRNA e outros ácidos nucléicos como biomarcadores de doenças.