Name: A ligação do anticorpo especificidade para Kappa (VK) Humanos (IgM) Anticorpos contendo Cadeia Luz: Acid polissiálico (PSA) Anexado a MACN como um estudo de caso (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a identificar antígenos para anticorpos IgM com potencial terapêutico usando imunoprecipitação e Western blot em tecido cerebral. Este método auxilia pesquisadores a descobrir novos biomarcadores e alvos imunoterapêuticos para câncer e doenças do sistema nervoso central.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 e R21 NS073684), a National Science Foundation (Prémio Carreira), o Prêmio de Parceria Minnesota for Biotechnology and Medical Genomics, a National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) , e da Clínica Mayo Centro para a clínica e Translational Science (CCATS). Os autores reconhecem o apoio das Fundações Applebaum, Hilton, Peterson e Sanford, a Lua e Marilyn Fundo Diretoria Park e da família McNeilus.

As patentes de anticorpos que promovem a remielinização e o reparo do SNC são emitidas e de propriedade da Mayo Clinic. Os autores têm um potencial conflito de interesses.

Auto-anticorpos IgM naturais humanos são candidatos atraentes para imunoterapias e demonstraram o potencial terapêutico para o tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro e doenças do SNC 1-7. Vantajosamente, estes anticorpos não vai eliciar uma resposta imunitária em que a geração de anticorpos neutralizantes reduz substancialmente a dose terapêutica eficaz e eficácia. Mais importante, todos os anticorpos com potencial terapêutico foram do isotipo IgM e pertencem ao repertório NAB 3-5,8,9,37,40,42-45. Um obstáculo principal para a potencial aplicação clínica de anticorpos IgM é a identificação dos seus antigénios, que são indeterminado em muitos casos. As técnicas padrão empregadas para anticorpos IgG muitas vezes não são aplicáveis ​​para identificar o antigénio de uma IgM. Este protocolo descreve a identificação de PSA-NCAM como o antigénio para o anticorpo IgM humano regenerativa HIgM12, eficazes em modelos animaisde MS e ALS 15-18. A metodologia utilizada é principalmente aplicável a todos os anticorpos humanos com cadeias leves sequência Vk específicos VκI, VκIII e VκIV e anticorpos de ratinho com cadeias leves VκI, independentemente do isotipo do anticorpo. O passo mais importante neste protocolo é a utilização de anticorpos IgM em aplicações de cromatografia de afinidade. Mais especificamente, os anticorpos bem sucedidos são obrigados a actuar como agentes suspensos em imunoprecipitações para isolar ou para enriquecer um antigénio de complexos para tecidos ou de células de cultura de lisados. As fracções enriquecidas de antigénios pode ser comparado com as imunoprecipitações de anticorpos de controlo de isotipo e subsequentemente analisados ​​por diferenças por espectrometria de massa. Um requisito essencial ou limitação deste passo é a presença do anticorpo correcta sequência Vk de cadeia leve e hospedeiro (humano, rato) para permitir a ligação à proteína G de agarose anticorpo. Utilização de proteínas de ligação a manana ligada a agarose (também callelectina de ligação a manose d) em vez da proteína G de agarose é uma alternativa potencial para imunoprecipitar IgM específicas sem cadeias leves sequência Vk. No entanto, como indicado por Arnold et al. 35, os anticorpos IgM ligado ao antigénio não se ligam à proteína de ligação a manana, como os glicano alvo parecem tornar-se inacessível uma vez que o IgM tem ligado ao seu antigénio. Com base nestes resultados de ligação a manana proteína não pode ser usado como uma matriz de ligação para imunoprecipitar IgM carregadas com antigénio, as moléculas 35. Outras alternativas potenciais pode ser o uso de anticorpos ligados a agarose secundárias IgM anti-IgG 46,47 ou utilização de esferas magnéticas activadas de superfície 48. anticorpos dirigidos contra IgG IgM pode ser quimicamente reticulado a agarose A ou G agarose a fim de reduzir o grau de anticorpo eluído juntamente com o antigénio de interesse. Uma comparação adequada entre as diferentes variantes de IgM imunoprecipitação com respeito aos antigénios identificados com sucesso ié difícil porque a maioria imunoprecipitaï¿½es foram realizados para isolar ou empobrecem IgM sem mais interesse em seus antígenos. Além disso, imunoprecipitaï¿½es usando IgM foram usados ​​principalmente para confirmar um antígeno único já conhecidos ou esperados com a exposição anticorpo para antigénios purificados 49. Uma desvantagem das IgG acoplado a agarose dirigido contra IgM humano é um rendimento muito baixo (10 - 15%) das moléculas de IgM séricos imunoprecipitado quando comparado ao material de partida 50. Em contraste, esferas magnéticas activadas de superfície foram aplicadas com sucesso para anticorpos de diferentes isotipos, incluindo IgM para imunoprecipitar fibrilas associadas à scrapie 48. Este método não se restringe a kappa específica (VK) ou cadeias lambda (λ) ou de um hospedeiro particular e pode alargar substancialmente o espectro de anticorpos IgM utilizadas em imunoprecipitações. Outro passo importante no protocolo é a capacidade do anticorpo para funcionar como um detecting anticorpo (anticorpo primário) em Western blots ou outras plataformas de rastreio. anticorpos de sucesso deve ter como alvo o seu antigénio com afinidade suficientemente elevada para permitir a ligação do antigénio na presença de detergentes não-iónicos ou iónicos, possivelmente. anticorpos de elevada afinidade são comuns entre anticorpos IgG maturados por afinidade, mas menos comum entre os anticorpos do isótipo IgM, o que é uma das razões pelas quais há relativamente poucos anticorpos IgM disponíveis comercialmente como agentes de detecção em configurações bioquímicos. ligação de anticorpos de alta afinidade é uma exigência para imunoprecipi tacões de antigénios moleculares e por Western blotting. Redução das concentrações de detergente ou a completa ausência de detergentes em buffers IP e tampões de lise permite antigénio alvo por anticorpos de baixa afinidade, através do seu domínio Fab. Em contraste, a capacidade do anticorpo para a proteína alvo G agarose através da sua porção Fe não é substancialmente afectada entre os controlos de isotipo longo de uma gama de diferentes detergentes concentrações. No entanto, a baixa concentração de detergente no tampão de lise e tampão IP impede ruptura da membrana celular e o isolamento de moléculas específicas. Da mesma forma, uma baixa concentração de detergente de lavagem em tampões de Western blot (por exemplo, PBS-T) permite a ligação de anticorpos de baixa afinidade antigénio, mas ao mesmo tempo aumenta a ligação não específica e, portanto, não é uma opção. A presença de uma proteína de antigénio núcleo é outro requisito para este método. Proteínas com modificações pós-tradução (por exemplo, glicoproteínas, lipoproteínas) e as proteínas não modificadas, mas não únicos lípidos ou hidratos de carbono, são detectáveis ​​em transferências de Western. Não é possível imunoprecipitar lípidos (por exemplo, esfingolípidos) a partir de lisados ​​celulares ou de tecidos, na presença ou na ausência de detergentes. As propriedades físico-químicas dos lípidos e detergentes são muito semelhantes para permitir interacções selectivas lipídicas-anticorpo, enquanto que ao mesmo tempo detergentes são essenciais para interrompermembranas a fim de permitir o isolamento selectivo de moléculas específicas. Para o nosso melhor conhecimento, imunoprecipitações exclusivamente constituídas por hidrato de carbono, na ausência de um núcleo proteico, não foram relatados na literatura. Isto torna-se particularmente relevante porque os anticorpos IgM frequentemente alvo carboidratos e glycolipids, que não estão necessariamente ligados a uma unidade de proteína. Outras técnicas cromatográficas são necessários para a separação e identificação imunológica de lípidos e hidratos de carbono na ausência de um núcleo proteico. Por exemplo, cromatografia de camada fina (TLC) dos lípidos celulares, com detecção subsequente anticorpo na placa de TLC (imuno-TLC) pode ser implementado 51,52. Outros anticorpos anti-PSA foram descritos em estudos anteriores e os resultados são comparados com HIgM12, bem como a IgM anti-PSA comercialmente disponível (clone 2-2B). O anticorpo mais vulgarmente utilizados no campo de PSA é um anticorpo de IgG (o clone 735) disponível como monoc ratolonal ou anticorpo policlonal de coelho 53. Este anticorpo anti-PSA de PSA detecta IgG em SynCAM e NCAM em diferentes tipos de células do SNC, incluindo as células microgliais 41. Em contraste com o anticorpo anti-PSA de IgG, os anticorpos IgM humanos HIgM12, HIgM42 e o anti-PSA IgM de ratinho (clone 2-2B) são incapazes de atingir PSA em SynCAM (mas em MACN) em vários estágios embrionários e pós-natais precoces em ratinhos , enquanto SynCAM não polissialilados é facilmente detectável 15. Os anticorpos IgM utilizadas também não são capazes de detectar PSA em células microgliais (Figuras 3 + 4). Uma possível explicação para as diferenças observadas entre os isotipos de anticorpos podem ser baixos níveis de PSA-SynCAM em comparação com os níveis de PSA-NCAM combinados com o potencial mais baixo de ligação de anticorpos de IgM em comparação com a IgG anti-PSA afinidade. Para testar essa hipótese, realizamos imunoprecipitaï¿½es em animais MACN KO em fase embrionária E17 com vastas quantidades de SynCAM presente e usado HIgM12 como um &quot;agente de pull-down&quot; &lt;sup&gt; 15. Em E17 WT da mesma ninhada controla HIgM12 imunoprecipitada PSA-NCAM de uma forma que mostrou intensidades semelhantes de &quot;puxado para baixo&quot; de PSA-NCAM em comparação com a cadeia pesada de IgM, conforme detectado por densitometria de Western blot subsequente utilizando antigénios eluídos. Este resultado sugeriu que pelo menos uma afinidade suficiente para a sua HIgM12 de PSA alvo. Em contraste com a da mesma ninhada WT controla HIgM12 não detectar PSA ligado a MACN SynCAM em animais KO. Resultados idênticos foram obtidos em imunoprecipitações com o anticorpo anti-PSA HIgM42 IgM. HIgM12 e HIgM42, bem como a de ratinho anti-PSA IgM (clone 2-2B) foram incapazes de atingir PSA em SynCAM em transferências de Western de animais WT e KO NCAM em estágios embrionários e pós-natais. Dada a baixa quantidade de HIgM12 requerido (0,1 ug / ml) para detectar especificamente PSA ligado a MACN, em transferências de Western, utilizando pequenas quantidades de tecido do SNC (0,1 ug tecido do SNC por poço) 15 parece ser pouco provável que as baixas afinidades são sozinhoresponsável pela completa falta de detecção de PSA-SynCAM por HIgM12 em três métodos diferentes. Conclui-se que existem diferenças significativas entre os anticorpos IgM-PSA anti e o anticorpo anti-PSA IgG frequentemente publicados (clone 735). Não está claro por que os anticorpos anti-PSA IgM comercialmente disponíveis não foram utilizados com mais frequência no passado para confirmar os resultados obtidos com antiPSA IgG anticorpo 735. Isto é particularmente interessante porque HIgM12 já provou eficácia em diferentes modelos de doenças. Enquanto outros anticorpos anti-PSA IgM podem ter efeitos terapêuticos semelhantes não fica claro se o anticorpo PSA anti-IgG (clone 735) tem um resultado terapêutico semelhante em modelos de MS e ALS. Em resumo, os métodos descritos aqui foram utilizados principalmente para identificar o antigénio dos anticorpos humanos HIgM12 regenerativas para suportar ensaios clínicos potenciais para MS e, possivelmente, de outras doenças neurodegenerativas. A identificação de formigaIrgens para anticorpos com atividade biológica é um passo essencial para compreender o seu mecanismo de acção. Isto torna-se particularmente relevante no contexto de numerosos anticorpos monoclonais actualmente a ser testados para a segurança e eficácia em humanos ensaios. Embora o número de anticorpos IgM clinicamente testados até à data é pequeno, os recentes avanços na tecnologia de hibridoma, juntamente com um número crescente de estudos que destacam o potencial terapêutico desta classe de anticorpos 1-10,37,40,42-45 insta o desenvolvimento de novos ou métodos modificados aplicável para identificar não-protéicos antigénios IgM.

Os anticorpos do isotipo IgM demonstram um grande potencial terapêutico para o tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro e doenças do SNC 1-7. O grupo Vollmers &#39;identificados numerosos anticorpos em doentes com cancro para utilização potencial como biomarcadores específicos de tumores ou terapêuticos activos que são capazes de matar células malignas, induzindo vias apoptóticas 4,8,9. Curiosamente, todos os anticorpos identificados com potencial terapêutico são do isotipo IgM e pertencer ao grupo de &quot;auto-anticorpos naturais&quot; (bebidas não alcoólicas). Do mesmo modo, o grupo de Rodriguez identificado rato e anticorpos humanos que estimulam a remielinização em lesões da medula espinhal de desmielinização cronicamente nos modelos de esclerose múltipla (EM). Idêntico a anticorpos com efeitos anti-cancro, todos os anticorpos de promover a remielinização são NAbs e do isotipo IgM 1,6,7,10. Os antígenos precisas para IgM mais identificados ainda estão undetermined incluindo o anticorpo de promoção remielinização humana rHIgM22, atualmente em Fase I de ensaios clínicos para pacientes com EM 11. Apesar dos repetidos esforços por especialistas no campo da pesquisa de lipídeos e carboidratos, tanto no ambiente acadêmico e em parceria com a indústria 11, tenta identificar o antigénio de rHIgM22 não foram bem sucedidos. A falha de técnicas convencionais usadas para identificar antigénios de anticorpos IgG para o trabalho com anticorpos IgM identifica uma necessidade crítica de métodos específicos para refinar esses anticorpos que provavelmente de hidratos de carbono ou lípidos alvo antigénios. O foco deste manuscrito é o anticorpo humano HIgM12 regenerativa e os procedimentos experimentais utilizados para identificar o seu antigénio. Anticorpo HIgM12 foi identificado a partir de pacientes com macroglobulinemia de Waldenstrom, estimula o crescimento de neurites in vitro e 12-14 como alvo ácido polissiálico (PSA) ligado à molécula de adesão celular neural (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 estende vida útil em um modelo de mouse ALS 17 e melhora o resultado funcional em vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) camundongos infectados. Especificamente, HIgM12 estimula a atividade motora horizontal e vertical espontânea em ratos e aumenta cronicamente desmielinização número de diâmetro pequeno e médio axônios da medula espinhal oito semanas após uma única dose baixa de intraperitoneal, injetado anticorpo 18. A molécula de adesão de células neurais (NCAM) é uma glicoproteína da imunoglobulina (Ig) superfamília expressa na superfície celular de neurónios, glia, no músculo esquelético, e células assassinas naturais 19-25. Os três principais isoformas NCAM denominado NCAM180, NCAM140 e NCAM120, são variantes de splicing alternativo de um transcrito primário, que variam apenas em seu domínio citoplasmático. Dentro do sistema nervoso central, NCAM é a maior molécula polissialilados (&gt; 95%) com homopolímeros de ácido longos, siálico carregados negativamente. polissiálico umcid com n&gt; 10 é chamado de PSA, mas existem estruturas oligoméricas mais curtos, que também são biologicamente relevante. Outras proteínas expressas polissialilados no SNC são SynCAM1 26, neuropilina-2 (NRP-2) 27,28 e uma subunidade do canal de sódio de 25 (para revisão veja-se 29). Os métodos aqui descritos permitem a identificação de antigénio para imunoglobulinas humanas e de ratinho contendo (cadeias leves VκI, VκIII ou VκIV para anticorpos humanos e cadeias leves VκI para anticorpos de ratinho) específicos kapa (VK) cadeias leves independentemente do isotipo do anticorpo (por exemplo, IgG, IgM , IgA, IgD ou IgE). Esta limitação se baseia na utilização de proteína G agarose para imunoprecipitaï¿½es com anticorpos do isótipo IgM. As estratégias alternativas podem incluir as lectinas de ligação a manose e anticorpos IgG anti-IgM secundários ligados covalentemente a esferas de agarose, que pode alargar a aplicabilidade deste método a mais anticorpos IgM Including aqueles com cadeias leves lambda (λ) (ver discussão). Rácios de cadeias de soro luz IgM VK comparação com cadeias leves IgM λ derivados de indivíduos saudáveis ​​são 1,5: 1 30. Com base na metodologia de cromatografia usado aqui para separar, enriquecer, e imunologicamente detectar certas moléculas 31, todos os antigénios devem incluir, pelo menos, um domínio de proteína pequena. Epitopo de ligação específica do anticorpo pode estar dentro ou fora do domínio da proteína (por exemplo, glicoproteínas, lipoproteínas no). passos bioquímicos iniciais utilizados para identificar o antígeno específico para HIgM12, respectiva para diminuir a lista de potenciais candidatos, são os passos mais decisivos na esse método. Preparações específicas do tipo de célula e caracterizações baseadas na morfologia das células são descritos para células gliais, mas esta metodologia pode ser extrapolada para acomodar outros tipos de células dentro ou fora do SNC. Existe uma urgenteprecisa para desenvolver novas ou modificadas técnicas aplicáveis ​​para o aumento do número de anticorpos IgM com potencial terapêutico em diferentes desordens humanas particularmente nos casos (a maioria dos antigénios da classe IgM), onde os alvos de anticorpos são estruturas de hidratos de carbono ou lípidos.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>Alta glicose, com glutamina, com piruvato de sódio, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-glutamina, piruvato de sódio, alta glicose</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>sem soro, 10 ml</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Água estéril para irrigação</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1.000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Clomidrato de poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot; xHBr, Peso Molecular 30.000-70.000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>fração de albumina de soro bovino V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>fração de choque térmico, livre de protease, pH 7,&nbsp; pureza 98%, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, Peso molecular: 180,16 g/mol, reagente ACS, 500 g</td></tr><tr><td>de tripsina do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>essencialmente sem sal, pó liofilizado, 9.000 unidades BAEE/mg de proteína</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Tipo IV, pó liofilizado, 2.000 unidades Kunitz/mg de proteína</td></tr><tr><td>Proteína básica Recombinante de rato FGF R</td><td>& D systems</td><td>3339-FB-025</td><td>BSA como proteína transportadora, 25 &#181; g, liofilizado, > 95%, 16,2 kDa</td></tr><tr><td>Proteína PDGF-AA Recombinante de Rato</td><td>R& D systems</td><td>1055-AA-50</td><td>sem transportadora, 50 &#181; g, liofilizado, > 97%, derivado de E. coli, 12,5</td></tr><tr><td>kDa Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, Sem Glutamina, Sem Ácido Aspártico, Sem Ácido Glutâmico</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>cristalino, 1 kg, grau de reagente, Peso Molecular 30,03 g/mol (como monômero)</td></tr><tr><td>Tris[hidroximetil]aminometano (Tris bas</td><td>Biorad</td>#<td>1610719</td><td>1 kg, 99,8% puro, pó</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, pó</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, Peso molecular: 75,07 g/mol, Pó cristalino branco, 5 kg</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, Peso molecular: 58,44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>de fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, Peso molecular: 119,98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>sem cálcio e magnésio, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>Placa de Cultura de Células de 60 mm, poliestireno tratado com TC, 20/pacote, placa de</td></tr><tr><td>Petri Falcon estéril de 60 mm x 15 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Não Placa de Petri Bacteriológica Não Tratada com TC, 20/Pacote</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 6 poços</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 poços, fundo plano (Embalado individualmente), irradiado com raios gama, área de crescimento 9.5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; frasco de cultura de tecidos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2; Cantil de Cultura de Células em Forma de U com Tampa de Vedação de Plugue</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Proteína L Plus Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, reticulado 6% agarose frisada (CL-6B), capacidade de ligação: 10 a 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10-poço, 50 &micro; l, para uso com células de eletroforese Mini-PROTEAN</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0,45 &micro; m, rolo de 26,5 cm x 3,75 m</td></tr><tr><td>Anticorpo antiácido polissiálico-NCAM, clone</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 microlitros, Hospedeiro: camundongo, monoclonal IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli Tampão de amostra</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x tampão de amostra de proteína pré-misturada</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, 98% puro, 14,2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 microlitros, 200 e micro; g/ml, 3.500 U/mg</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Círculos nº 1; Espessura: 0,13 a 0,17 mm; Tamanho: solução</td></tr><tr><td>tampão HEPES</td> de 25 mm <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Hanks' Solução salina balanceada 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, sem cálcio, magnésio, fenol vermelho</td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington Cooperação</td><td>bioquímica LS003119</td><td>pó liofilizado, 100 mg</td></tr><tr><td>de sulfato de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>pó, 500 g</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

a ligação do anticorpo especificidade para kappa (vk) humanos (igm) anticorpos contendo cadeia luz: acid polissiálico (psa) anexado a macn como um estudo de caso

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Os anticorpos do isotipo IgM são frequentemente negligenciados como potenciais terapêuticos em ensaios em humanos, modelos animais de doenças humanas, bem como agentes de detecção em técnicas laboratoriais padrão. Em contraste, vários IgMs humanos demonstraram prova de eficácia em modelos de câncer e modelos de distúrbios do SNC, incluindo esclerose múltipla (EM) e esclerose lateral amiotrófica (ELA). As razões para sua falta de consideração incluem dificuldades para expressar, purificar e estabilizar anticorpos IgM, desafio para identificar antígenos (não proteicos), ligação de baixa afinidade e lacunas de conhecimento fundamentais na pesquisa de carboidratos e lipídios. 
Este manuscrito usa HIgM12 como exemplo para fornecer um protocolo detalhado para detectar antígenos por Western blotting, imunoprecipitações e imunocitoquímica. O HIgM12 tem como alvo o ácido polissiálico (PSA) ligado à molécula de adesão de células neurais (NCAM). O tecido cerebral de camundongos pós-natais precoces de camundongos do tipo selvagem (WT) e NCAM knockout (KO) sem as três principais variantes de splice do sistema nervoso central (SNC) NCAM180, 140 e 120 foi usado para avaliar a importância do NCAM para a ligação ao HIgM12. A digestão enzimática adicional do tecido do SNC e das células do SNC cultivadas usando endoneuraminidases nos levou a identificar o PSA como o epítopo de ligação específico para HIgM12.

Esta secção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos através do estudo de PSA-antigénios específicos de IgM humanas no SNC. A utilização de anticorpos IgM humanos contendo cadeias específicas de luz a sequência Vk em configurações bioquímicas e por imunocitoquímica fluorescente é mostrado. HIgM12 imunoprecipita o seu antigénio a partir de lisados ​​de cérebro cerebrais e actua como um (anticorpo primário) agente de detecção, em transferências de Western. Nem o anticorpo de controlo de isotipo ou L esferas de agarose imunoprecipitar um antigénio semelhante, o que demonstra a especificidade do puxar para baixo (Figura 1). As transferências de Western utilizando lisados ​​do SNC de ratinhos WT e KO MACN demonstrar a especificidade da ligação a HIgM12-MACN-PSA contendo (Figura 2A). A digestão enzimática de tecido do SNC de ratinhos WT usando ENDO-NF identifica PSA ligado a MACN como o epitopo de ligação específica para HIgM12 (Figura 2B). Utilizando o método descrito no presente documento, IBA-1-positivo de rato culturas microgliais de elevada pureza são obtidos (Figura 3). Comercialmente disponível anticorpo anti-PSA (clone 2-2B) não rotula da superfície celular ou piscinas PSA internas no fixadas e permeabilizadas células microgliais IBA-1-positivos por microscopia fluorescente. Consistente com a literatura publicado anteriormente, que relata nenhuma expressão na superfície celular de PSA-NCAM em microglia 16,41 não HIgM12 não rotular antígenos de superfície celular em microglia de rato purificadas. Curiosamente, a rotulagem HIgM12 de resultados microglia fixadas e permeabilizadas em uma intracelular padrão perinuclear, que não se restringe a organelos específicos (figura 3). Os resultados estão em contraste com os resultados obtidos utilizando um anticorpo anti-IgG de PSA (clone 735) 26, que tem como alvo o PSA-SynCAM em microglia no nível do Golgi 41. Em contraste com a microglia, HIgM12e antigénios de superfície de células alvo A2B5 em culturas de OPC de rato altamente enriquecidos sob condições de células vivas (Figura 4). Culturas OPC contêm ~ 5% contaminar as células microgliais. A Figura 5 ilustra um padrão praticamente idêntico na superfície celular de coloração entre HIgM12 e anti-PSA mAb (clone 2-2B) em astrócitos GFAP-positivos (Figura 5A). Rotulagem de imunofluorescência de astrócitos WT ENDO-NF-digeridos em comparação com tampão astrócitos WT tratados de controle usando HIgM12 demonstra a presença de PSA astrócitos (Figura 5B). A presença de astrócitos PSA-positiva in vivo ainda não foi confirmada. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> Figura 1: HIgM12 age como um &quot;pull-down&quot; Agente em imunoprecipitações imunoprecipitações de lisado total do cérebro de ratos de três meses de idade usando HIgM12, controle de isotipo humano HIGM.grânulos de 126 ou de agarose G apenas como &quot;puxar para baixo&quot; agentes. proteínas eluídas foram executados em Western blot com membranas sondadas contra HIgM12. Os pesos moleculares das proteínas eluidas a partir de grânulos revestidos foram HIgM12 na gama de 160-200 kDa, para além da cadeia pesada de IgM (~ 65-73 kDa). Este valor foi modificado de J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> Figura 2: HIgM12 Metas do ácido polissiálico (PSA) Porção de MACN. A. homogeneizados de cérebro de P7, P13, P16 e P27 MACN total de KO e controles ninhada heterozigotos foram executados em Western blot com membranas sondadas contra HIgM12, PSA e β-actina como controlo de carga. <strong&gt; B. 10 ug de adulto WT lisado de cérebro de rato em 1% de NP40 em PBS, pH 6,5, foi tratada com endoneuraminidase N (endo-N) (exo) com neuraminidase α2-3 especificidade polímero de ácido polisiálico (sialidase) ou PBS durante a noite a 37 ºC, executado como dobletes em Western blot e sondado contra HIgM12, PSA e β-actina como controlo de carga. Este valor foi modificado de J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> Figura 3: a ausência de PSA no Rat Microglia é espelhada por uma falta de HIgM12 Labeling microglia rato foram cultivadas durante 48 horas na revestidas com poli-D-lisina lamínulas de vidro e ou rotulados ao vivo no gelo com HIgM12 ou após fixação com HIgM12 ou anti. -PSA mAb (clone 2-2B). As células foram triple marcado com microglia marcador IBA-1 (verde), HIgM12 / PSA (vermelho) e DAPI (azul). Imagens mostram falta de superfície de células microgliais ligação usando HIgM12 (linha superior) e falta de anti-PSA de ligação (clone 2-2B) à superfície da célula e lojas internas no microglia rato primário (linha inferior). Com base na morfologia bipolar e ausência de IBA-1 coloração, a pequena célula de PSA-positivas (fila inferior) foi sugerida para ser uma OPC. Em células fixas, HIgM12 coloração resultou em um padrão punctated, perinuclear que não se restringiu à organelas específicas e foi considerado ligação não específica (linha do meio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> Figura 4: HIgM12 alvos celulares de superfície PSA-NCAM em Rat OPCs OPCs rato e microglia foram cultu.vermelho por 4 dias em meio de proliferação em lamelas de vidro revestidas com poli-D lisina e triplos marcados ao vivo no gelo com HIgM12 ou A2B5 (verde), interna macrófagos / monócitos marcador CD68 (clone ED-1) (vermelho) e DAPI (azul) . Imagens mostram populações de células majoritariamente positivo para A2B5 OPC marcador (linha superior) e HIgM12 (linha inferior) com poucas microglia CD68-positivos (~ 5%). Contraste de fase e imagens DAPI foram adicionados para revelar a integridade celular e os números de celulares para cada população. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> Figura 5: HIgM12 e mAb anti-PSA co-rotular um subpopulação astrocitária mouse Mixed Glia. A. mouse células gliais mistas de WT e MACN total de animais KO contendo astrócitos, células oligodendrócitos-linhagem e microglia foram cultivadas durante 3 dias e rotulados ao vivo no gelo com HIgM12 (verde), anti-PSA mAb (clone 2-2B) (vermelho) e, posteriormente, para astrocitário marcador GFAP (roxo) e DAPI (azul). HIgM12 e anti-PSA revelam um padrão de coloração idêntica virtual em astrócitos WT GFAP-positivos, mas a falta de ligação para astrócitos em cultura de ratos MACN KO. Este valor foi modificado de J. Neurochem. 15. B. glia misturadas foram cultivadas de forma idêntica tal como descrito em A. e tratadas durante a noite com endoneuraminidase-NF (gentilmente fornecida pelo Dr. Martina Muehlenhoff) ou controlo de PBS. As células foram marcadas ao vivo no gelo com HIgM12 (verde) e posteriormente coradas para marcadores GFAP interno (vermelho) e DAPI (azul). HIgM12 alvo antígenos de superfície celular em PBS-controlo tratado culturas gliais mistos, mas não endoneuraminidase-NF tratados glia mista. Este valor foi modificado a partir JNSCI 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>facilitar clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Todas as imagens foram tomadas em 60X de ampliação usando as mesmas configurações do instrumento e processados ​​de forma idêntica. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> Tabela 1:. Tampão e Solução Receitas <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">Por favor clique aqui para baixar esta tabela.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> tecido do SNC </td><td> ENDO-NF / PBS </td><td> O tampão de lise </td><td> Volume total </td></tr><tr><td> 1. rato WT </td><td> 67 ^ g (0,45 ul) </td><td> 2 ul (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7,55 mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 2. rato WT </td><td> 67 ^ g (0,45 ul) </td><td> 2 ul de PBS </td><td> 7,55 mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 3. rato WT </td><td> 67 ^ g (0,45 ul) </td><td> nenhum PBS ou ENDO-NF </td><td> 9,55 mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 4. MACN KO rato </td><td> 67 ^ g (0,45 ul) </td><td> 2 ul (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7,55 mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 5. MACN KO rato </td><td> 67 ^ g (0,45 ul) </td><td> 2 ul de PBS </td><td> 7,55 mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 6. MACN KO rato </td><td> 67 ^ g (0,45 ul) </td><td> nenhum PBS ou ENDO-NF </td><td> 9,55 mL </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Endo-NF digestão de tecido do SNC de ratinhos P7 WT e KO MACN.

Apresentamos um protocolo para identificar porções proteicas contendo antígenos para anticorpos IgM humanos e de camundongos com cadeias leves kappa (Vκ) específicas. Este protocolo não se limita aos anticorpos da classe IgM, mas se aplica a todos os isotipos de imunoglobulinas que visam seu antígeno com afinidade suficientemente alta durante as imunoprecipitações.

A ligação do anticorpo especificidade para Kappa (VK) Humanos (IgM) Anticorpos contendo Cadeia Luz: Acid polissiálico (PSA) Anexado a MACN como um estudo de caso

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar antígenos para anticorpos com potencial terapêutico, com foco no isotipo IgM. Este método preenche uma lacuna no campo biomédico e pode ajudar a identificar novos biomarcadores e agentes imunoterapêuticos para a pesquisa de câncer e doenças do sistema nervoso central. A principal vantagem desta técnica é que ela abre as portas para uma classe negligenciada de anticorpos com grande potencial terapêutico.As implicações desta técnica estendem-se aos diagnósticos e tratamentos de todas as doenças que podem ser alvo de terapêuticas baseadas em anticorpos. Este método pode fornecer informações sobre antígenos de anticorpos IgM e tecidos em crescimento e subculturas. Também pode ser aplicado a outros isotipos de anticorpos de todas as espécies.Tive pela primeira vez a ideia deste método quando percebi a ligação específica e acentuada do anticorpo IgM em diferentes aplicações bioquímicas. O procedimento será demonstrado por Robert Kahoud e Jens Watzlawik. Para iniciar este procedimento, faça um corte no crânio em direção à frente, ao nível da orelha, e afaste o crânio.Em seguida, coloque cuidadosamente o cérebro em um tubo de 15 mililitros e armazene-o imediatamente sobre gelo seco. Após cinco minutos, transfira o cérebro para um papel de pesagem limpo e remova rapidamente o cerebelo e o tronco encefálico usando uma lâmina de barbear limpa. Em seguida, pese o cérebro congelado antes de transferi-lo novamente para o tubo de 15 mililitros sobre gelo.Adicione tampão de lise gelado até atingir uma concentração final de 150 microgramas de tecido cerebral por microlitro de tampão de lise. Em seguida, homogeneíze o cérebro no tampão de lise por meio de trituração através da ponteira de uma pipeta de um mililitro, seguida por trituração através de uma seringa de cinco mililitros equipada com agulha de 27 graus. Depois disso, incube o lisado cerebral por mais 30 minutos no gelo para permitir a lise completa do tecido.Após 30 minutos, remova o detergente, o material insolúvel e os lipídios cerebrais por centrifugação em série. Descarte o precipitado contendo mielina e detritos celulares, mas retenha o sobrenadante após cada etapa de centrifugação. Aliquote o lisado cerebral e armazene a 80 graus Celsius.Nesta etapa, prepare 200 mililitros de Tampão IP com BSA e outros 200 mililitros de Tampão IP sem BSA. Para a reação de imunoprecipitação, transfira 100 microlitros de suspensão de agarose Protein L para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de tampão IP com BSA ao tubo.Em seguida, misture manualmente por inversão. Depois, lave as esferas de agarose com Proteína L quatro vezes por centrifugação. Após isso, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet de agarose e repita o procedimento de lavagem mais três vezes.Em seguida, adicione tampão IP fresco contendo BSA ao agarose Protein L e incube durante a noite em um rolo a quatro graus Celsius. Em 800 microlitros de tampão IP contendo BSA e 30 miligramas de tecido cerebral lisado, adicione 20 microgramas de anticorpo experimental, anticorpo controle ou PBS. Incube 30 miligramas de tecido cerebral lisado em tampão IP gelado com anticorpo IgM em um tubo microcentrífugo de 1,5 milímetro durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, centrifugue as microesferas de agarose com proteína L em uma centrífuga de bancada. Descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet de agarose. Em seguida, adicione a solução de lisado cerebral com anticorpo resfriada à agarose com proteína L.Incube a suspensão de anticorpo antígeno com agarose proteína L por duas horas em rolo a quatro graus Celsius. Após duas horas, lave o complexo de anticorpo antígeno ligado à agarose L por meio de centrifugação. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o precipitado e adicione um mililitro de tampão IP frio contendo 0,2% de BSA.Repita a etapa de lavagem mais uma vez usando o tampão IP frio contendo BSA a 0,2% e mais duas vezes usando o tampão IP frio sem BSA. Em seguida, centrifugue para sedimentar o complexo anticorpo-antígeno ligado ao agarose L. Use uma pipeta de 200 microlitros para descartar o sobrenadante até que cerca de 50 microlitros da solução permaneçam sobre o pellet de agarose Protein L. Depois, use uma pipeta de 10 microlitros para removê-lo completamente.Mantenha todas as amostras em gelo. Em seguida, adicione 40 microlitros de tampão de eluição para IP a cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Agite o tubo com os dedos seis vezes e aqueça por cinco minutos a 95 graus Celsius.Em seguida, coloque a amostra em gelo por dois minutos e centrifugue por 30 segundos. Depois, transfira 35 microlitros do sobrenatante para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro sem perturbar o pellet. Em seguida, confirme a ausência de microesferas de agarose com Proteína L lavando suavemente uma pequena quantidade da amostra diluída na parede interna do tubo.Se houver microesferas de agarose com proteína L, centrifugue a amostra por mais 30 segundos a 13.000 ×g e transfira o sobrenadante para um tubo limpo. Repita este passo até que nenhuma microesfera de agarose seja detectável. Em seguida, aplique 10–20 microlitros das amostras diluídas por poço em um gel de poliacrilamida SDS com sistema de tampão tris-glicina SDS e execute a eletroforese por cerca de uma hora a 100 volts em temperatura ambiente, sem refrigeração adicional.Posteriormente, transfira as proteínas para uma membrana de PVDF. As proteínas são transferidas por duas horas e meia na geladeira a 100 volts usando tampão de transferência frio. Bloqueie a membrana com 10% peso por volume de leite em pó desnatado em PBS-T durante uma hora a 25 graus Celsius em um agitador orbital na bancada.Lave duas vezes, durante 10 minutos cada vez, com PBS-T. Incube a membrana com anticorpo primário em PBS-T contendo 5% de BSA. Incube em agitador orbital na câmara fria durante a noite.Na manhã seguinte, lave a membrana uma vez com PBS-T em excesso a 25 graus Celsius, seguido por três lavagens com PBS-T durante 10 minutos cada em um agitador orbital. Em seguida, adicione anticorpo secundário e 5% de leite em pó desnatado em PBS-T à membrana e incube por uma hora a 25 graus Celsius em um agitador orbital. Após isso, lave a membrana uma vez com PBS-T em excesso a 25 graus Celsius, seguido por três lavagens com PBS-T durante 10 minutos cada em um agitador orbital.Adicione um mililitro do componente A do substrato de quimioluminescência aprimorada para HRP resfriado com um mililitro do componente B a 25 graus Celsius. Transfira a membrana para uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Em seguida, seque o recipiente com toalhas de papel antes de devolver a membrana a ele.Imediatamente, adicione dois mililitros do substrato HRP de quimioluminescência aprimorada previamente misturado à membrana e incube por dois minutos a 25 graus Celsius. Incline o recipiente manualmente a cada 20 segundos para umedecer a membrana uniformemente. Em seguida, transfira a membrana para uma bolsa plástica transparente e remova o líquido em excesso e bolhas de ar com toalhas de papel.Fixe com fita o invólucro de plástico na cassete e feche-a. Esta figura mostra que o HigM12 imunoprecipita seu antígeno a partir de lisados cerebrais e atua como agente de detecção em blots sulternos. Nem o anticorpo controle de isotipo nem as microesferas de agarose L imunoprecipitam um antígeno semelhante, o que demonstra a especificidade do pull down.Aqui, os blotagens ocidentais utilizando lisados do SNC de camundongos selvagens e camundongos knockout para NCAM demonstram a especificidade da ligação de HIgM ao NCAM contendo PSA. A digestão enzimática de tecido do SNC de camundongos selvagens utilizando ENDO-NF identifica o PSA ligado ao NCAM como o epítopo de ligação específico para HIgM12. Utilizando o método descrito aqui, são obtidas culturas de microglia de rato positivas para IBA-1 com alta pureza. Em contraste com a microglia, os antígenos de superfície celular alvo de HIgM12 e A2B5 foram altamente enriquecidos em culturas de OPC de rato sob condições de células vivas.Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em até 13 horas de trabalho. Após esse procedimento, outros métodos como o Biacore ou a tecnologia de ressonância de plasmones de superfície podem ser empregados para identificar as afinidades de ligação dos anticorpos e as constantes de associação e dissociação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa do câncer, imunoterapias e autoanticorpos naturais identificarem epítopos carboidratos em proteínas como antígenos para anticorpos terapêuticos IgM em humanos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar antígenos glicoproteicos para trabalhos de pesquisa que contenham anticorpos IgM humanos. Os dados fornecem um novo alvo para a terapia da EM. O PSA ENCAP, o tratamento com anticorpos que desenvolvemos, é um dos primeiros a demonstrar melhora funcional em uma caixa de atividade utilizando o modelo rigoroso presente na doença e em condições semelhantes à Esclerose Múltipla.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Este protocolo descreve o desenvolvimento de dois anticorpos monoclonais (mAbs) da classe IgG fortemente reativos à mioglobina de cetáceos. Esses mAbs são aplicados em uma tira de teste imunocromatográfica de ouro coloidal baseada no formato sanduíche para diferenciar o Mb de cetáceos de focas e outros animais.

Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um anticorpo bispecific GPC3-S-Fab em Escherichia coli. O GPC3-S-Fab purificado tem potente citotoxicidade contra células de câncer de fígado positivo GPC3.

Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade

Apresentamos abordagens para a caracterização estrutural e biofísica das glicoproteínas com a dobra de imunoglobulina por cristalografia de raios x, Calorimetria de Titulação Isotérmica e interferometria de biolayer.

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

A expansão do código genético é aplicada para a introdução de um aminoácido não natural com um grupo funcional biorthogonal em uma proteína portadora em um local definido. A função biorthogonal é ainda utilizada para o acoplamento seletivo local de um antígeno de carboidratos para fornecer uma vacina glicoconjugar homogênea.

Glicoconjugate homogêneo produzido por incorporação combinada de aminoácidos não naturais e click-química para fins de vacina

Aqui, um método é descrito para determinar a afinidade vinculante (KD) de anticorpos radiolabelados a antígenos imobilizados. KD é a constante de dissociação de equilíbrio que pode ser determinada a partir de um experimento de ligação de saturação medindo a ligação total, específica e inespecífica de um anticorpo radiolabeled em várias concentrações ao seu antígeno.

Determinando afinidade de ligação (KD) de anticorpos radiolabelados para antígenos imobilizados

Este protocolo descreve a marcação de anticorpo único (SAL) para resolver a organização espacial em nanoescala das proteínas da membrana plasmática. Ao aproveitar as interações cumulativas anticorpo-epítopo no nível de molécula única, o SAL de membrana (mSAL) mapeia distribuições locais de epítopos enquanto captura simultaneamente o comportamento de ligação de anticorpos no ambiente celular nativo.

Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo

Aprenda a identificar antígenos para anticorpos IgM com potencial terapêutico usando imunoprecipitação e Western blot em tecido cerebral. Este método auxilia pesquisadores a descobrir novos biomarcadores e alvos imunoterapêuticos para câncer e doenças do sistema nervoso central.

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A ligação do anticorpo especificidade para Kappa (VK) Humanos (IgM) Anticorpos contendo Cadeia Luz: Acid polissiálico (PSA) Anexado a MACN como um estudo de caso

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