A ligação do anticorpo especificidade para Kappa (VK) Humanos (IgM) Anticorpos contendo Cadeia Luz: Acid polissiálico (PSA) Anexado a MACN como um estudo de caso

O objetivo geral deste procedimento é identificar antígenos para anticorpos com potencial terapêutico com foco no isotipo IgM. Este método preenche uma lacuna de conhecimento no campo biomédico e pode ajudar a identificar novos biomarcadores e agentes imunoterapêuticos para a pesquisa do câncer e doenças do sistema nervoso central. A principal vantagem dessa técnica é que ela abre as portas para uma classe negligenciada de anticorpos com grande potencial terapêutico.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico e tratamento de todas as doenças que podem ser alvo de terapias baseadas em anticorpos. O que este assunto pode fornecer informações sobre antígenos de anticorpos IgM e tecidos e subculturas em crescimento. Também pode ser uma praga para outros isotipos de anticorpos de todas as espécies.

Tive a ideia para esse método pela primeira vez quando percebi a ligação específica e proeminente do anticorpo IgM em diferentes aplicações bioquímicas. Demonstrando o procedimento estarão Robert Kahoud e Jens Watzlawik. Para iniciar este procedimento, faça um corte no crânio em direção à frente no nível da orelha e retire o crânio.

Em seguida, coloque suavemente o cérebro em um tubo de 15 mililitros e armazene-o imediatamente em gelo seco. Após cinco minutos, transfira o cérebro para um papel de pesagem limpo e remova rapidamente o cerebelo e o tronco cerebral usando uma lâmina de barbear limpa. Em seguida, pese o cérebro congelado antes de transferi-lo de volta para o tubo de 15 mililitros no gelo.

Adicione tampão de lise gelado a uma concentração final de 150 microgramas de tecido cerebral por microlitro de tampão de lise. Em seguida, homogeneizar o cérebro em tampão de lise por trituração através de uma ponta de pipeta de um mililitro seguida de trituração através de uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 27. Depois disso, incube o lisado cerebral por mais 30 minutos no gelo para permitir a lise completa do tecido.

Após 30 minutos, remova o detergente, o material insolúvel e os lipídios cerebrais para centrifugação seriada. Rejeitar a mielina e os restos celulares que contenham o sedimento, mas reter o sobrenadante após cada etapa de centrifugação. Alíquota do lisado cerebral e armazene a 80 graus Celsius.

Nesta etapa, prepare 200 mililitros de IP Buffer com BSA e outros 200 mililitros de IP Buffer sem BSA. Para a reação de imunoprecipitação, transfira 100 microlitros de pasta de agarose de proteína L para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de tampão IP com BSA ao tubo.

Em seguida, misture manualmente por inversão. Em seguida, lave as esferas de agarose Protein L quatro vezes por centrifugação. Em seguida, retirar o sobrenadante sem perturbar o pellet de agarose e repetir o procedimento de lavagem mais três vezes.

Em seguida, adicione um novo tampão IP contendo BSA à agarose da proteína L e incube-o durante a noite em um rolo a quatro graus Celsius. Em 800 microlitros de tampão IP contendo BSA e 30 miligramas de tecido cerebral lisado, adicione 20 microgramas de anticorpo experimental, anticorpo de controle ou PBS. Incube 30 miligramas de tecido cerebral lisado em tampão IP gelado com anticorpo IgM em um tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetro durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, gire as esferas de agarose de proteína L em uma centrífuga de bancada. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento de agarose. Em seguida, adicione a solução de lisado cerebral de anticorpos resfriados à agarose da proteína L.

Incube o antígeno do anticorpo, suspensão de agarose de proteína L por duas horas em um rolo a quatro graus Celsius. Após duas horas, lavar o complexo anticorpo antigénio ligado à agarose L por centrifugação. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione um mililitro de tampão IP gelado contendo 0,2% BSA.

Repita a etapa de lavagem mais uma vez usando um buffer IP gelado contendo 0,2% BSA e duas vezes adicionais usando um buffer IP gelado sem BSA. Depois disso, gire para baixo o complexo de antígeno de anticorpo ligado à agarose L. Use uma pipeta de 200 microlitros para descartar o sobrenadante até que cerca de 50 microlitros da solução sejam deixados em cima do pellet de agarose de proteína L. Em seguida, use uma pipeta de 10 microlitros para removê-lo completamente.

Mantenha todas as amostras no gelo. Em seguida, adicione 40 microlitros de tampão de eluição IP a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Passe o tubo com o dedo seis vezes e aqueça-o por cinco minutos a 95 graus Celsius.

Depois disso, coloque a amostra no gelo por dois minutos e gire-a por 30 segundos. Em seguida, transfira 35 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetro sem perturbar o pellet. Em seguida, confirme a ausência de grânulos de agarose de proteína L enxaguando uma pequena quantidade de amostra diluída na parede do tubo interno.

Se estiverem presentes grânulos de agarose de proteína L, centrifugar a amostra durante mais 30 segundos a 13 000 vezes g e transferir o sobrenadante para um tubo limpo. Repita esta etapa até que nenhuma gota de agarose seja detectável. Em seguida, carregue 10-20 microlitros de amostras diluídas por poço em um gel de poliacrilamida SDS e um sistema tampão SDS de trisglicina e deixe o gel funcionar por cerca de uma hora a 100 volts na bancada sem resfriamento adicional.

Posteriormente, transfira as proteínas para uma membrana de PVDF. As proteínas são transferidas por duas horas e meia na câmara fria a 100 volts usando tampão de transferência a frio. Bloqueie a membrana com 10% de peso por volume de leite em pó em pó em PBS-T por uma hora a 25 graus Celsius em um agitador orbital de bancada.

Lave duas vezes por 10 minutos de cada vez com PBS-T. Sonda a membrana com anticorpo primário em 5% BSA em PBS-T. Incube em um agitador orbital na câmara fria durante a noite.

Na manhã seguinte, lave a membrana uma vez com excesso de PBS-T a 25 graus Celsius, seguida de três lavagens com PBS-T por 10 minutos cada em um agitador orbital. Em seguida, adicione anticorpo secundário e 5% de leite em pó seco em PBS-T à membrana e incube-o por uma hora a 25 graus Celsius em um agitador orbital. Depois disso, lave a membrana uma vez com excesso de PBS-T a 25 graus Celsius, seguido de três lavagens com PBS-T por 10 minutos cada em um agitador orbital.

Misture um mililitro de componente A do substrato HRP de quimioluminescência aprimorada resfriada com um mililitro do componente B a 25 graus Celsius. Transfira a membrana para uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Em seguida, seque o recipiente com papel toalha antes de transferir a membrana de volta para ele.

Imediatamente, adicione dois mililitros do substrato HRP de quimioluminescência aprimorada pré-misturado à membrana e incube-o por dois minutos a 25 graus Celsius. Incline o recipiente com a mão a cada 20 segundos para umedecer a membrana uniformemente. Depois disso, transfira a membrana para uma manga de plástico transparente e remova o excesso de líquido e bolhas de ar com toalhas de papel.

Cole a manga plástica no e feche-a. Esta figura mostra que o HigM12 imunoprecipita seu antígeno dos lisados cerebrais e atua como um agente de detecção em Western blots. Nem o anticorpo de controle do isotipo nem as esferas de agarose L imunoprecipitam um antígeno semelhante, o que demonstra a especificidade do pulldown.

Aqui, Western blots usando lisados do SNC de camundongos selvagens e knockout para NCAM demonstram a especificidade da ligação de HIgM ao PSA contendo NCAM'A digestão enzimática do tecido do SNC de camundongos do tipo selvagem usando ENDO-NF identifica o PSA ligado ao NCAM como o apitopo de ligação específico para HIgM12. Usando o método descrito aqui, são obtidas culturas microgliais de rato positivas para IBA-1 de alta pureza. Em contraste com a microglia, os antígenos de superfície da célula-alvo HIgM12 e A2B5 foram altamente enriquecidos em culturas de OPC de ratos em condições de células vivas.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em 13 horas úteis. Após este procedimento, outros métodos como Biacore ou tecnologia de ressonância plasmônica de superfície podem ser empregados para identificar as afinidades de ligação dos anticorpos às constantes de associação e associação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa do câncer, imunoterapias e autoanticorpos naturais identificarem apítopos de carboidratos em proteínas semelhantes como antígenos para anticorpos IgM terapêuticos em humanos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar antígenos de glicoproteína para trabalhos de pesquisa contendo anticorpos IgM humanos. Os dados fornecem um novo alvo para a terapia da EM. O PSA ENCAP, o tratamento com anticorpos que desenvolvemos, é um dos primeiros a mostrar melhora funcional em uma caixa de atividades usando o modelo rigoroso que está na doença e desvalorizando a doença semelhante à Esclerose Múltipla.