Name: Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a gerar vírus Vaccinia mutante com eficiência aumentada em mais de 100 vezes usando CRISPR-Cas9. Este método acelera a criação de vetores virais para terapia gênica e vacinação em apenas 10 dias.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa MRC DPFS (MR/M015696/1) e pelo Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2013DFG32080).

1. Preparação de Alvo RNA e Cas9 Constrói e Reparação Dador de Vector <ol><li> Clonagem de gRNAs <ol><li> Projetar uma sequência alvo guia-RNA alvo o gene N1L do vírus vaccinia seguindo o princípio afirmado anteriormente 25. Alinhar a sequência alvo de ARN-guia contra o genoma do vírus de vaccinia (neste caso, Lister estirpe de vírus da vacina) para descartar quaisquer sequências alvo gRNA fora do alvo. </li><li> Sintetizar e clonar os oligos gRNA em um vector de clonagem gRNA como previamente descrito 25. Confirmar a sequência de cada indivíduo gRNA no vector resultante por Sanger de sequenciação 33. Nomeie o gRNA construção resultante como gRNA N2 33. NOTA: O local alvo é gRNA dentro do gene N1L, e é na região entre o braço esquerdo e do braço direito que as tampas vector reparação doador (ver Figura 1). </li></ol></li><li> Clonar o gene Cas9 falta o sinal de localização nuclear (NLS) navector pST1374 e designar a construção como pST-Cas9 33. Nota: Quaisquer clonagem de expressão vector de mamífero pode ser utilizado para a construção do vector de expressão Cas9. </li><li> Construção de vector de reparação dos doadores para HR <ol><li> Use o gene N1L de VV como região-alvo para a modificação 33. Assegure-se que os comprimentos dos braços esquerdo e direito são cerca de 500-600 pb cada, e que flanqueiam a região alvo. NOTA: O braço / braço direito esquerdo pode ter até 50 sobreposição bp com a região de destino (ver Figura 1). </li><li> Clonar o reparo região doadora vector N1L como descrito anteriormente 33, 34 e designar o vetor doador de reparação como pT-N1L. Nota: Consulte a Figura 1 para o vetor de reparação doador e sua região alvo. Outras regiões da VV pode ser alvejado usando região (gene) especï¿½ico gRNA (s) e vector de reparação dador específico de região. Qualquer vector de clonagem pode ser utilizado para a construção do vector dador de reparação. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Expansão de plasmídeo <ol><li> Transformar o plasmídeo em E. quimicamente competente coli de acordo com as instruções do fabricante. Purifica-se o plasmídeo utilizando um kit de extracção de plasmídeo referindo-se o protocolo fornecido pelo fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Células Sementeira (Dia 1) <ol><li> Manter a células CV-1 (fibroblastos de rim de macaco) em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, e 100 ug / mL de estreptomicina, a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> células trypsinize CV-1, que são 80-90% confluentes <ol><li> Remover o meio de cultura de células a partir do balão T-175, contendo células CV-1. Lavar a monocamada com 5 mL de PBS estéril para remover o soro residual e aspirar o PBS. Adicionar 2,5 mL de uma solução 1 × Tripsina-EDTA para cobrir as células e colocar o balão em 37 ° C incubadora durante aproximadamente 5 min para auxiliar a separação celular. </li><li> Adicionar10 ml de meio de cultura celular (ver passo 2.1) para suspender as células por acção da pipeta suave. Conte o número de células usando um hemocitômetro. </li><li> Semeando as células em placas de 6 poços <ol><li> Seed 2 x 10 5 células CV-1 em 2 mL de meio de cultura de células em cada poço de uma placa de 6 poços um dia antes da transfecção. NOTA: Um passo adicional de centrifugação para remover a tripsina não é necessária. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. A transfecção do plasmídeo e Cas9 gRNA plasmídeo (Dia 2) <ol><li> transfectar células CV-1 (preparado no passo 2.2.3.1) com 0,5 ug de plasmídeo pST-Cas9 e 0,5 ug de plasmídeo gRNA N2 usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Incubam-se as células durante 24 h numa incubadora (37 ° C com 5% de CO 2) e, em seguida substituir o meio com 2 mL de meio de cultura celular fresco (descrito no passo 2.1). </li></ol> 4. A infecção de células CV-1 e Shuttle Donor Vector transfecção para HR (dia 3) <ol><li> Dilui-se a espinha dorsal vírus VVL15 com meio de cultura celular DMEM a uma concentração de 2 x 10 5 pfu / mL. 24 h pós-transfecção dos plasmídeos Cas9 e gRNA, adiciona-se 100 ul de vírus diluído em cada poço de células CV-1 transfectadas. </li><li> 2 h pós-infecção do vírus, transfectar 1,0 ug de transporte Dador de Vector em células infectadas para VVL15-RH usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Colocar as células transfectadas de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 h. </li></ol> 5. recolher o vírus recombinante (Dia 4) <ol><li> Após 24 horas de transfecção com o vector de transporte dador para HR na etapa 4.2, separar as células CV-1 transfectadas, utilizando um raspador de células. Recolha a suspensão de células para um frasco de congelação e armazenar a -80 ° C para uso futuro. NOTA: Limpe qualquer derrame de meio de cultura celular com desinfectante imediatamente e, em seguida, limpe novamente com 70% Ethanol. </li></ol> 6. Purificação da VV Modificado (Primeira Rodada) <ol><li> No dia 1, as sementes 15 placas de 6 cavidades com 3 x 10 5 células CV-1 em cada poço. <ol><li> No dia 2, descongelar a suspensão de células congeladas a partir do passo 5.1 em um banho de água a 37 ° C durante 3 minutos e agitar com vortex os criotubos vigorosamente durante 30 segundos para obter lisado celular sem remover os detritos celulares. </li></ol></li><li> Para a infecção de uma placa de 6 poços de células CV-1, diluir 1 mL de lisado de células com 3 mL de DMEM e adicionar 0,5 ml de ligado celular diluído em cada poço da placa de 6 cavidades, na parte superior dos meios de comunicação já presente. Infect todas as placas de 6 poços, preparado no passo 6.1. NOTA: A remoção de detritos de células não é necessário. </li><li> Após dois dias de infecção (isto é, no dia 4), identificar placas RFP-positiva sob um microscópio de fluorescência utilizando 10X lente objectiva e rotular as placas por baixo da placa utilizando uma caneta marcador circundando a localização da placa. NOTA: Ver <strong&gt; Figura 3 para a placa representante RFP-positivo. <ol><li> Prepare seis cryovials rotulados contendo meio de cultura de células 200 mL sem soro DMEM para pegar seis placas RFP-positivas diferentes. Aspirar o meio de cultura de células a partir da placa bem com rotulada (s) (passo 6.3). Anexar uma ponta de 200 mL de uma pipeta P200, definir o volume em 30 mL e tomar ~ meio de cultura de células 10 mL de uma cryovial. </li><li> Segure o botão pipeta sem liberar a médio e use a ponta a arranhar a área de uma placa rotulada. Solte o botão de pipeta para levantar as células destacadas e transferi-lo para o cryovial contendo 190 mL de DMEM isento de soro. </li><li> Tome um outro 10 ï¿½ de meio do frasco com as células riscados (da última etapa) e repita o procedimento de pegar a mesma placa RFP-positivas três vezes para recolher o máximo de células riscado quanto possível. Transferir todas as células no mesmo frasco e armazenar o frasco a -80 ° C. </ol></li></ol> 7. A purificação do VV Modificado (Segunda Rodada) <ol><li> Seed 3 x 10 5 células CV-1 em cada poço de seis placas de 6 poços e cultura das células durante 24 h. </li><li> Descongelar as criotubos congeladas (a partir do passo 6.3.3) em 37 ° C banho de água durante 3 min, em seguida, os criotubos vortex vigorosamente durante 30 segundos para obter lisado celular. <ol><li> Adicionar 0,5 mL do lisado celular mista para um poço de uma placa de 6 poços. Infect uma placa de 6 poços para cada placa. Incubar as placas de 6 poços VV infectadas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 dias (Segunda purificação de placa redonda). Em seguida, repita a secção 6.3. NOTA: Mais de seis placas de RFP-positivos podem ser apanhados; duas ou mais placas de 6 poços pode ser usado para a purificação de cada placa. </li></ol></li></ol> 8. novas rodadas de Plaque Purificação <ol><li> Continue mais três a cinco ciclos de purificação de acordo com o mesmo protocolo descrito no passo 7 até que todas as placas formadas a partir de uma placa positiva pareceu ser RFP-positiva sob um microscópio. NOTA: Esta placa, em seguida, é considerado puro. </li><li> Uma vez que a placa é pura (Figura 4, todas as células infectadas que expressam RFP), colher uma placa positiva em um cryovial e armazenar a -80 ° C, tal como descrito na secção 6.3. Verifique a placa seguindo o protocolo descrito no passo 9 e 10. </li></ol> 9. Expanda a placa (s) Purificada <ol><li> Seed 3 x 10 5 células CV-1 em cada poço de uma placa de 6 poços um dia antes da infecção pelo vírus. </li><li> Descongelar o criotubo gelado de 8,2 num banho de água a 37 ° C durante 3 minutos para se obter lisado celular. Adicionar todo o lisado (sem necessidade de remover os detritos celulares) para um poço de uma placa de 6 poços de células CV-1 (semeadas no passo 9.1). Incubar as células CV-1 infectadas a 37 ° C com 5% De CO 2 durante 3 dias. <ol><li> Expandir todas as placas purificadas (pelo menos três placas). NOTA: O tempo de infecção varia de 1-3 dias, dependendo da quantidade de vírus no lisado. </li></ol></li><li> Colher as células VV infectadas utilizando um raspador de células, quando mais de 50% das células mostram efeito citopático observado sob um microscópio (as células são arredondados, facilmente separado e RFP positivo). Recolher as células destacadas em conjunto com o meio de cultura de células para um tubo de 15 mL. <ol><li> Agregar as células por centrifugação a 300 g durante 3 min. Remover o sobrenadante e manter a pelete de células a -80 ° C até à sua utilização ou usar o sedimento celular imediatamente para o passo 10. </li></ol></li></ol> 10. Verificação da Modificação do Mutant VV Usando PCR <ol><li> Extracto de ADN VV a partir do sedimento de células, preparado no passo 9.3.1, utilizando um kit de extracção de ADN seguindo o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN com 200 uL de água duplamente destilada. NOTA: Use da metade do volume do pelete para extrair o ADN e manter o resto para a produção virai se o clone é verificado como contendo a correcta modificação / inserção. </li><li> Verificação da deleção do gene de N1L e da inserção do gene para a região de RFP N1L. <ol><li> Amplificar um fragmento de DNA abrangendo o gene N1L (L025) e o gene L026 utilizando iniciadores concebidos contra o gene N1L. Amplificar o gene RFP utilizando iniciadores especï¿½icos RFP. Amplificar um fragmento de ADN de controlo que mede A52R por PCR utilizando iniciadores específicos de A52R. NOTA: Veja a lista de materiais para primers específicos. <ol><li> Realizar a PCR usando um kit mestre de mistura de PCR. Defina-se 25 ul de reacção de PCR, utilizando 2 mL de modelo de DNA, desnaturar a reacção de PCR a 94 ° C durante 2 min, e, em seguida, executar 30 ciclos de PCR seguintes etapas: desnaturar o ADN, a 94 ° C durante 15 s, em seguida, recozer os iniciadores para os moldes de ADN a 52 ° C durante 15 s prolongar a reacção de PCR a 72 ° C durante 30 s. </li></ol></li></ol></li><li> Resolver os produtos de PCR utilizando um gel de agarose a 1% 33. Capturar a imagem do gel usando um doc gel UV. Se o N1L de PCR for negativo e A52R e RFP PCRs são positivos, então a placa está correctamente modificado na região do N1L. </li></ol>

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<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+marker-free+system+for+highly+efficient+construction+of+vaccinia+virus+vectors+using+CRISPR+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035(2015).</li>
<li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation%3A+recombination-independent+selectable+cloning+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li>
<li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li>
<li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Há dois objetivos principais relativamente à modificação da VV para fins terapêuticos. Uma consiste em eliminar um gene particular, tal como o gene da timidina quinase (TK) para atenuar o vírus para o anti-tumoral uso terapêutico. A outra é o braço VV com um gene terapêutico desejado (por exemplo, GM-CSF) ou um gene marcador (por exemplo, gene da luciferase). Atingir qualquer um destes envolve a eliminação de uma região alvo / gene. Um método de ligação directa de ADN 35 e um método de empacotamento in vitro 36 Foram utilizados anteriormente para gerar vírus vaccinia mutantes com alterações do gene TK. No entanto, estes métodos têm aplicação limitada em relação a mutação de outras regiões do genoma, devido à falta de locais de enzimas de restrição exclusivos, em todo o genoma. A actual abordagem para a criação de VV mutante envolve a transfecção de um vector de transporte (dador) com um marcador de selecção (RFP ou GFP) em células CV-1 de duas horas após a infecção com VV para induzir uma incorpor recombinação homólogang do marcador de selecção para a região alvo. Colecção de placas de marcadores positivos é seguida por sua h pós-transfecção de purificação 24. O processo de purificação de placa pode levar até 10 rodadas, últimas 3-4 semanas e, muitas vezes leva a vírus recombinantes com marcadores de selecção indesejáveis ​​inseridas em regiões fora do alvo. ADN quebras de cadeia dupla pode efectivamente induzir a recombinação homóloga em células de mamíferos 37, e do aproveitamento deste mecanismo, a eficiência de geração de VV mutante pode ser bastante melhorada. O sistema Cas9 gRNA-guiada tem sido empregada com sucesso na edição do genoma e aumenta a eficiência de recombinação homóloga em organismos eucarióticos 22, 25. Recentemente, em células hospedeiras os genomas de adenovírus e tipo I vírus herpes simplex foram editadas pelo Cas9 gRNA-guiada sistema de 24. Foi demonstrado recentemente que o sistema CRISPR Cas9 é uma ferramenta poderosa para a edição de forma eficiente no genoma VV e construção de um vector para a expressão de um VVgene particular. Ambos N1L gRNA-guiada ao método tradicional recombinação homóloga (HR) Cas9 e resultou em eventos bem sucedidas de RH no mesmo local alvo de N1L. É interessante notar, no entanto gRNA-guiado Cas9 AR induzida em níveis muito mais elevados de eficiência do que o método tradicional de RH. Assim, a utilização de Cas9 gRNA-guiado elimina a necessidade de purificar o maior número de placas para obter mutantes VV. Neste trabalho, nós melhorou significativamente a eficiência e prazo para geração de VV mutante usando o sistema Cas9 gRNA-guiada 33. De nota, um passo crítico para a obtenção de uma elevada eficiência da recombinação homóloga é para transfectar células CV-1 com os plasmídeos que expressam Cas9 e o gRNA durante 24 h antes de realizar a recombinação homóloga convencional. O intervalo de 24 h permite Cas9 e gRNA a ser expressa em um nível razoável. Além disso, a sequência de direccionamento gRNA de um determinado gene pode ter de ser optimizada, uma vez que descobrimos que os diferentes sequências t gRNAgene argeting N1L variar na sua eficácia 33, 34. A limitação para a CRISPR / Cas9 na edição VV é a baixa taxa de placas RFP positivo na primeira rodada de recombinação. Para se obter um número suficiente de placas RFP-positivo contendo vírus recombinante, geralmente, pelo menos, dez placas de 6 poços são necessárias, o que torna primeira ronda de rastreio tedioso. Assim, ainda existe uma necessidade para optimizar o protocolo de ultrapassar esta limitação. O pequeno tamanho de placas RFP-positivo é um outro problema potencial, o que é devido a um elevado volume de lisado utilizado para infectar uma placa de 6 poços. Para superar isto, um menor volume de lisado deve ser utilizado para infectar uma placa de 6 poços para se obter placas de tamanho maior RFP-positiva. Usando um pequeno volume de lisado permitirá também para uma melhor separação das placas RFP-positivo de os RFP-negativo. Consequentemente menos rondas de purificação de placas são necessários para obter placas RFP-positivos puros. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Off-alvo efeitos são sempre um problema indesejado na edição gene. CRISPR-Cas9 tem mostrado efeitos fora do alvo. No entanto, com design cuidadoso de gRNA, longe do alvo efeitos podem ser evitados durante a edição do VV genomas 33, 34. Este é o benefício particular de usar o sistema Cas9 gRNA-guiada para editar o genoma de VV. Dadas as promessas de VV, usando o sistema CRISPR / Cas9 irá acelerar o desenvolvimento de VV mutantes para a investigação biomédica e em medicina translacional. Além disso, um sistema deste tipo também iria acelerar descobertas em biologia celular, tais como a dissecção das vias de sinalização utilizadas por VV para a sua motilidade à base de actina.

vírus vaccinia (VV) é um vírus DNA envelopado, pertencente à família poxvírus e tem desempenhado um papel crucial em uma das maiores conquistas da medicina da erradicação da varíola. Na era pós-erradicação da varíola, VV foi desenvolvido como um vetor para a entrega de genes para as vacinas contra o HIV e outras doenças infecciosas 1-7 através da inserção de genes de vários patógenos em vectores VV. VV também tem sido amplamente utilizado como um vector para a imunoterapia do cancro 8-14 especialmente para o desenvolvimento de vírus de vaccinia oncolítico replicar-alvo do tumor. A fim de criar um vector de vacina eficiente com uma selectividade melhorada para as células cancerígenas, são necessárias modificações dentro do genoma viral, incluindo deleções de genes ou introdução de genes terapêuticos. Com o desenvolvimento da tecnologia de ADN e uma melhor compreensão da biologia molecular e virologia, a inserção de ADN estranho em VV foi originalmente atingird usando recombinação homóloga (HR) em 1980 15. Este método ainda é amplamente utilizado para a construção de vectores VV. Introdução da modificação genética, é conseguido através de um vector de transporte para a AR, que se recombina com o genoma de VV em células pré-infectados. No entanto, este método tem provado ser altamente ineficiente (inferior a 1% de eficiência de recombinação homóloga 16) e muitas vezes resulta na inserção aleatória do marcador de selecção em regiões e / ou perda do marcador sobre a expansão do vírus não-alvo. A eficiência de ADN de recombinação homóloga para introduzir ADN exógeno em loci genómico pode ser dramaticamente aumentada na presença de quebras de cadeias duplas (DSB) 17. Portanto, a tecnologia que pode induzir LAP em loci alvo tem um grande potencial para a engenharia de genoma de VV. O sistema CRISPR-Cas9 recentemente desenvolvido mostra a promessa para o desencadeamento de LAP em qualquer região do gene VV. CRISPR-Cas9 é uma RNA-nuclease guiada envolvidos na imunidade adaptativa contra invasores fagos e outros materiais genéticos estranhos 18-20. Existem três sistemas CRISPR-cas em uma variedade de espécies microbianas 21. O sistema CRISPR-cas tipo II é amplamente utilizado para a edição do genoma de células eucarióticas e vírus de grandes dimensões. Consiste na Cas9 endonuclease guiada por ARN (de Streptococcus pyogenes), um ARN de guia (sgRNA) e o crRNA trans-activação (tracrRNA) 22-24. O complexo Cas9 / sgRNA reconhece a sequência genómica de 20 nucleótidos complementares anterior uma sequência 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer motivo adjacente (PAM) em células de mamífero 22, 23. Ela tem sido usada com sucesso para a geração eficaz de células, vírus geneticamente modificados e modelos animais 22-32. O sistema CRISPR-Cas9 tem provado ser uma ferramenta eficiente para a segmentação genoma em combinação com recombinação homóloga no citoplasma de VV infectadas células CV-1s para gerar vírus vaccinia mutantes 33, 34. A fim de alargar o potencial de aplicação deste método, apresentamos informações detalhadas sobre metodologia deste sistema. O protocolo descrito pode ser usado para criar um mutante de VV com uma deleção do gene particular e / ou armar o vírus mutante com um transgene terapêutico.

<table><tbody><tr><td>Plasmídeo #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>gRNA clonando vetor</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 clonagem</td></tr><tr><td>vetor pGEMT fácil</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>reparo doador vetor clonagem</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Quimicamente Competente E. coli</td><td>C4040-10</td><td>Transformação Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>27106</td><td>Extração de plasmídeo</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia' s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>meio de cultura</td></tr><tr><td>de células soro fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Hyclone</td><td>cultura de células</td></tr><tr><td>soro penicilina, estreptomicina</td><td>15070-063</td><td>Antibióticos Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td><td>transfecção</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0&nbsp; mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>coleta de</td></tr><tr><td>vírus fluorescência microscópio&nbsp;</td><td>Fluorescência Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td>encontrar RFP-positivo plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de Tecidos</td><td>69506</td><td>Qiagen</td><td>DNA</td></tr><tr><td>extraction Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Reagente de PCR</td><td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>10 cm placa</td><td>de cultura Z688819-6EA</td><td>sigma</td><td>cell culture&nbsp;</td></tr><tr>Cultura de células <td>sigma</td> <td>de Z707759 de placa de 6 poços</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>raspador de células</td><td>C5981</td><td>sigma</td><td>sucata de células</td></tr><tr><td>1x solução de tripsina-EDTA</td><td>T4299</td><td>sigma</td><td>tripsinizar células</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>desinfetante</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>hold cell suspension</td></tr><tr><td>N1L forward 5'-TATCTAGCAATGGACCGT-3'</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>N1L reverso&nbsp; 5'-CCGAAGGTAGTAGTAGCATGGA-3'Sigma</td><td></td><td></td> <td>PCR</td></tr><tr><td>primer A52R forward 5'-ATAGGATTGTGTGCATGC-3'</td><td></td><td></td><td>Sigma PCR primer</td></tr><tr><td>A52R reverso 5'-TTGCGGTATGTATGAGGTG-3'</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP encaminhado 5'- GCTACCGGACTCAGATCCA-3' &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Sigma PCR primer</td></tr><tr><td>RFP reverso 5'-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3'</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR produto</td></tr><tr><td>G: CAIXA F3</td><td>G: CAIXA F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante vaccinia

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

A endonuclease Cas9 associada ao CRISPR pode editar loci genômicos específicos dirigidos por um único RNA guia (gRNA). O sistema CRISPR/Cas9 tem sido empregado com sucesso para editar genomas de vários organismos. Aqui descrevemos um protocolo para editar o genoma do vírus vaccinia (VV) no citoplasma de células CV-1 infectadas por VV usando o Cas9 guiado por RNA. O Cas9 guiado por RNA induz quebras de DNA de fita dupla, facilitando a recombinação homóloga de forma eficiente e específica no local alvo do VV e um transgene pode ser incorporado a esses locais por recombinação homóloga. Usando um vetor homólogo site-specific com transgene(s), um VV deletado do gene N1L com o gene da proteína de fluorescência vermelha (RFP) incorporado nesta região foi gerado com uma eficiência de recombinação bem-sucedida 10 vezes maior do que a obtida do método convencional de recombinação homóloga. Este protocolo demonstra o uso bem-sucedido do sistema Cas9 guiado por RNA para gerar VVs mutantes com maior eficiência.

Para a construção de um novo vector VV, o ponto de partida chave é projetar e construir um vetor de transporte de doadores que podem alvejar uma região específica do genoma. Neste estudo, o gene de VV N1L foi usado como um exemplo de destino. A cassete do vector de transporte dador para a recombinação e a região alvo no VV são mostrados na Figura 1. A fim de aumentar a eficiência da recombinação homóloga, os plasmídeos que expressam Cas9 e um gRNA específicos de N1L foram co-transfectados na CV -1 células 48 h antes de se realizar a recombinação homóloga 33. Um dia (24 h) após a transfecção, RFP foi expresso em células CV-1 (Figura 2). Após a infecção de células CV-1 com todo o lisado proveniente da recombinação homóloga (passo 5), as placas negativas RFP-positivas e foram observados tanto em células CV-1 (Figura 3). Seguindo o protocolo de purificação descrito, uma placa de co puro<html> uld ser obtido depois de 3-5 ciclos de purificação. Como mostrado na Figura 4, todos os placas após a infecção com lisado de células derivadas a partir de uma placa pura com o vírus vaccinia mutantes apresentaram um sinal RFP. Para verificar se o mutante pura VV tinha a modificação genética correcta, PCR foi utilizado para confirmar a ausência do gene N1L alvo, como se mostra na Figura 5. Por PCR do vírus modificado mostrou um sinal positivo para RFP e um sinal de ausente para N1L ( Figura 5 pista AG), enquanto que os resultados de PCR de N1L para o vírus de controlo (CTR) com uma região intacta N1L é positivo. Os fragmentos de ADN de controlo de A52R foram positivos para todos os vírus recombinantes do vírus e Ctr. A eficiência de RH em placas RFP-positivo é de 100% (6/6) nesta experiência (foi até 94% no trabalho anterior 34). O método aqui descrito melhorou a eficiência de recombinação em mais de 100 vezes em comparação com os protocolos convencionais 33, 34. conteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Figura 1:. A cassete do vector de transporte dador para a recombinação homóloga, e a região alvo no genoma VV A purificação RFP gene marcador é dirigido pelo promotor de H5. O vector de reparação dos doadores destinados à região resultados N1L no gene RFP serem incorporadas a região N1L após recombinação homóloga. &#39;X&#39; indica a sequência homóloga no vector dador de reparação que irá substituir a mesma sequência no genoma do vírus vaccinia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Figura 2:. Imagiologia das células CV-1 um dia após a recombinação homóloga Um dia afteR recombinação homóloga, as células infectadas com VV e transfectadas pelo vector dador de reparação são RFP-positiva A:. imagem de contraste de fase (original 100X). B: A microscopia de fluorescência imagem (original 100X). Barra de escala = 50 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Figura 3:. Uma placa RFP-positivo na primeira purificação rodada de vírus mutante Na purificação na primeira rodada do vírus mutante, a placa RFP-positivo (circulado com linha vermelha) com a eliminação região alvo está rodeado por placas formadas pela imagem de contraste de fase (original 100X) B:: Um vírus de tipo selvagem (circulado com linha amarela).. micr fluorescênciaimagem oscopy (original 100X). Barra de escala = 50 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Figura 4:. O mutante pura VV Após 3-5 ciclos de purificação, placas puras foram obtidos como todas as placas eram RFP-positiva A:. Imagem de contraste de fase (original 100X). B: A microscopia de fluorescência imagem (original 100X) . Barra de escala = 50 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Figura 5: VerificatioN pura do mutante VV. O DNA foi extraído a partir de células infectadas com VV CV-1. A deleção da região alvo N1L foi verificada por PCR, utilizando iniciadores N1L, a inserção de SDP na região N1L foi confirmada por PCR utilizando os iniciadores RFP. Lanes AF correspondem a seis placas purificadas, pista G é uma placa de controle com N1L exclusão verificado em trabalhos anteriores 33, pista Ctr (controle) é o vírus vaccinia tipo selvagem (com a região N1L intacta). A52R gene foi amplificado como o gene de controle para todas as amostras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

vírus vaccinia (VV) tem sido amplamente utilizada na investigação biomédica e da melhoria da saúde humana. Este artigo descreve um método simples, altamente eficiente para editar o genoma VV utilizando um sistema CRISPR-Cas9.

Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

O objetivo geral deste experimento é melhorar a eficiência da geração de vírus vaccinia mutantes utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9. Este método pode auxiliar na criação de novos vetores de vírus vaccinia para pesquisas biológicas e médicas, em particular para terapia gênica e vacinação. A demonstração viral com este método é fundamental, pois identificar e selecionar placas positivas é difícil de realizar.A principal vantagem desta técnica é que ela melhora drasticamente a eficiência na obtenção do nosso mutante do vírus vaccinia. A partir de células CV-1 colhidas, ajuste sua concentração para 100.000 células por mililitro. Em seguida, semeie dois mililitros da suspensão em cada poço de uma placa de seis poços para transfeção.No dia seguinte, transfecte as células com 0,5 nanogramas do plasmídeo gRNA-N2 e 0,5 nanogramas do plasmídeo pSTCas9. Em seguida, incube-as por 24 horas. Vinte e quatro horas depois, substitua o meio.Em seguida, prepare o vírus VVL15. Dilua o vírus VVL15 com DMEM até obter 200.000 PFU por mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros do vírus diluído em cada poço das células CV-1 transfectadas.Duas horas depois, transfete as células com um micrograma do vetor doador de transporte para expressão de HR e incube as células por 24 horas. No dia seguinte, desprenda as células CV-1 transfectadas utilizando uma espátula celular. Em seguida, colete a suspensão celular em um criotubo e armazene a -80 graus Celsius para uso futuro.Para iniciar a primeira rodada de purificação do VV modificado, semeie 15 placas de seis poços com 300.000 células CV-1 não modificadas por poço. No dia seguinte, descongele a suspensão congelada de células CV-1 transfectadas a 37 graus Celsius por três minutos e, em seguida, vortexe vigorosamente a suspensão por 30 segundos para lisar as células. Em seguida, dilua um microlitro do lisado com três mililitros de DMEM.Adicione meio mililitro dessa diluição a cada poço de placas com células CV-1 não modificadas. Em seguida, devolva as placas ao incubador por dois dias. Dois dias depois, identifique as placas positivas para RFP utilizando um microscópio de fluorescência.Eles podem ser visualizados com uma objetiva de 10X. À medida que forem identificados, rotule com precisão as placas na parte inferior da placa usando uma caneta marcadora. Agora, prepare um criotubo contendo 200 microlitros de DMEM sem soro para cada placa positiva a ser colhida.Em seguida, é importante aspirar todo o meio dos poços com placas marcadas. Então, utilizando uma pipeta de 200 microlitros ajustada para aspirar 30 microlitros, carregue parcialmente a pipeta com 10 microlitros de meio do criovial e, em seguida, raspe a placa e aspire as células com o volume restante. Ejecte este conteúdo no criovial e repita este procedimento mais duas vezes, visando a mesma placa positiva para RFP para coletar o maior número possível de células.Armazene as coleções a menos 80 graus Celsius ou, se a segunda rodada de purificação for realizada imediatamente, congele os crioviales em gelo seco por 10 minutos. A segunda rodada de purificação do VV modificado é realizada da mesma forma que a primeira, utilizando as células congeladas da primeira rodada. No entanto, mais de seis placas positivas para RFP podem ser selecionadas para cada linhagem positiva para RFP.Repita o processo de seleção até que todas as placas formadas a partir de uma placa positiva sejam positivas para RFP, indicando que a placa é pura, o que pode levar de três a cinco rodadas adicionais. Com um dia de antecedência, prepare uma placa de seis poços com meio milhão de células CV-1 por poço. No dia seguinte, descongele a placa purificada congelada a 37 graus celsius por três minutos.Em seguida, agite vigorosamente a placa por 30 segundos para obter um lisado. Adicione todo o lisado, incluindo os detritos celulares, a um poço de células CV-1 e incube a placa por três dias. Não utilize os outros cinco poços.Inspecione as células diariamente ao microscópio. Quando mais da metade das células apresentar aspecto citopático, colete as células infectadas. Idealmente, todas as células devem estar citopáticas.Use um raspador de células para coletar as células em um tubo de 15 mililitros com meio de cultura. Em seguida, pelote as células a 300g durante três minutos. Descarte o sobrenadante e prossiga com o uso de PCR para verificar a modificação do VV mutante, ou congele o pellet celular a menos 80 graus Celsius para fazê-lo posteriormente.O método descrito melhora a eficiência de recombinação em mais de 100 vezes em comparação com protocolos convencionais. Por exemplo, o gene VV N1LG foi direcionado para modificação. Conforme descrito, plasmídeos expressando Cas9 e um gRNA específico para N1L foram cotransfectados nas células CV-1 para aumentar sua eficiência de recombinação homóloga.Um dia após a transfeção, a RFP foi expressa nas células CV-1. Em seguida, as células CV-1 foram infectadas com o lisado total proveniente da recombinação homóloga. Placas positivas e negativas para RFP foram ambas observadas nas células CV-1.Após o protocolo de purificação, obteve-se uma proteína recombinante pura. Todas as placas após infecção com o lisado celular derivado de uma placa pura com o vírus vaccinia mutante apresentaram sinal de RFP. A PCR foi utilizada para verificar a deleção do gene alvo.O vírus modificado apresentou um sinal positivo para RFP e nenhum sinal para N1L, ao contrário do controle N1L intacto. Todos foram positivos para o gene não direcionado A52R. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir rapidamente um novo vetor de vírus vaccinia.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 10 dias se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área das ciências biomédicas explorarem novos vetores virais no desenvolvimento de agentes biológicos para o tratamento e a prevenção de câncer e doenças infecciosas.

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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