Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia

O objetivo geral deste experimento é melhorar a eficiência da geração do vírus vaccinia mutante usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Este método pode ajudar a criar novos vetores do vírus vaccinia para pesquisa biológica e médica, em particular para terapia gênica e vacinação. A demonstração viral com esse método é crítica, pois identificar e detectar placas positivas é difícil de realizar.

A principal vantagem dessa técnica é que ela melhora drasticamente a eficiência em tornar nosso mutante o vírus vaccinia. Começando com células CV-1 colhidas, ajuste sua concentração para 100.000 células por mililitro. Em seguida, semeie dois mililitros da suspensão em cada poço de uma placa de seis poços para transfecção.

No dia seguinte, transfectar as células com 0,5 nanogramas de plasmídeo gRNA-N2 e 0,5 nanogramas de plasmídeo pSTCas9. Em seguida, incube-os por 24 horas. 24 horas depois, substitua o meio.

Em seguida, prepare o vírus VVL15. Diluir o vírus VVL15 da espinha dorsal com DMEM a 200.000 PFU por mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros do vírus diluído em cada poço das células CV-1 transfectadas.

Duas horas depois, transfectar as células com um micrograma do vetor doador shuttle para expressão de HR e incubar as células por 24 horas. No dia seguinte, retire as células CV-1 transfectadas usando um raspador de células. Em seguida, colete a suspensão celular em um criogênico e armazene a 80 graus Celsius negativos para uso futuro.

Para iniciar a primeira rodada de purificação do VV modificado, semeie 15 placas de seis poços com 300.000 células CV-1 não modificadas por poço. No dia seguinte, descongele a suspensão congelada de células CV-1 transfectadas a 37 graus Celsius por três minutos e, em seguida, vortex vigorosamente a suspensão por 30 segundos para lisar as células. Em seguida, dilua um microlitro do lisado com três mililitros de DMEM.

Adicione meio mililitro desta diluição a cada poço de placa de células CV-1 não modificadas. Em seguida, devolva as placas à incubadora por dois dias. Dois dias depois, identifique as placas positivas para RFP usando um microscópio de fluorescência.

Eles podem ser vistos com uma objetiva de 10X. À medida que são identificados, rotule com precisão as placas embaixo da placa usando uma caneta marcadora. Agora prepare um criogenio contendo 200 microlitros de DMEM sem soro para cada placa positiva a ser colhida.

Em seguida, é importante aspirar todo o meio dos poços com placas marcadas. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros para aspirar 30 microlitros, carregue parcialmente a pipeta com 10 microlitros de meio do criotubo e, em seguida, raspe a placa e retire as células com a aspiração restante. Ejete-o no criogênico e repita esse procedimento mais duas vezes, visando a mesma placa positiva para RFP para coletar o maior número possível de células.

Armazene as coleções a 80 graus Celsius negativos ou, se a segunda rodada de purificação for realizada imediatamente, congele os criotubos em gelo seco por 10 minutos. A segunda rodada de purificação do VV modificado é realizada exatamente como a primeira, usando as células congeladas da primeira rodada. No entanto, mais de seis placas positivas para RFP podem ser selecionadas para cada linha positiva para RFP.

Repita o processo de seleção até que todas as placas formadas a partir de uma placa positiva sejam positivas para RFP, indicando que a placa é pura, o que pode levar de três a cinco rodadas adicionais. Com um dia de antecedência, prepare uma placa de seis paredes com meio milhão de células CV-1 por poço. No dia seguinte, descongele a placa purificada congelada a 37 graus Celsius por três minutos.

Em seguida, vórtice a placa vigorosamente por 30 segundos para fazer um lisado. Adicione todo o lisado, incluindo os detritos celulares, em um poço de células CV-1 e incube a placa por três dias. Não use os outros cinco poços.

Inspecione as células diariamente ao microscópio. Quando mais da metade das células parecerem citopáticas, colha as células infectadas. Idealmente, todas as células devem ser citopáticas.

Use um raspador de células para coletar as células em um tubo de 15 mililitros com meio de cultura. Em seguida, pellet as células a 300g por três minutos. Descarte o sobrenadante e prossiga com o uso de PCR para verificar a modificação do VV mutante ou congele o pellet celular a 80 graus Celsius negativos para fazê-lo mais tarde.

O método descrito melhora a eficiência da recombinação em mais de 100 vezes em comparação com os protocolos convencionais. Por exemplo, o VV N1LG foi alvo de modificação. Conforme descrito, plasmas expressando Cas9 e um gRNA específico para N1L foram co-transfectados nas células CV-1 para aumentar sua eficiência para recombinação homóloga.

Um dia após a transfecção, a RFP foi expressa nas células CV-1. Em seguida, as células CV-1 foram infectadas com todo o lisado da recombinação homóloga. Placas positivas e negativas para RFP foram observadas nas células CV-1.

Seguindo o protocolo de purificação, um recombinante puro foi obtido. Todas as placas após a infecção com o lisado celular derivado de uma placa pura com o vírus vaccinia mutante apresentaram um sinal de RFP. A PCR foi usada para verificar a deleção do gene alvo.

O vírus modificado mostrou um sinal positivo para RFP e nenhum sinal para N1L, ao contrário do controle N1L intacto. Todos foram positivos para o gene A52R não alvo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar rapidamente um novo vetor de vírus vaccinia.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 10 dias se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de ciências biomédicas explorarem novos vetores virais no desenvolvimento de agentes biológicos para tratamento e prevenção de câncer e doenças infecciosas.