Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

O objetivo geral deste novo método de cultura de células é gerar células de gordura desdiferenciadas com maior eficiência. Nosso método pode ajudar os pesquisadores que trabalham no campo da medicina regenerativa a responder a perguntas-chave sobre os vários processos envolvidos na produção de células adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. Como a principal vantagem do nosso protocolo de cultura celular é que ele melhora a qualidade das células DEFAT, ele pode ser aplicado em um futuro próximo para melhorar as aplicações atuais em terapia celular e engenharia de tecidos.

Depois de trazer a amostra de gordura subcutânea do paciente da sala de cirurgia para o laboratório, pese o tecido e coloque uma amostra de um a dois gramas de tecido adiposo em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, lave a amostra com cinco mililitros de PBS e transfira a amostra para um prato de plástico de 10 centímetros. Remova o PBS.

Em seguida, adicione 10 mililitros de colagenase estéril a 0,1% de peso por volume ao prato que contém a amostra. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para picar o tecido até atingir uma consistência purê. Transfira o tecido picado e a solução de colagenase para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e digerir a 37 graus Celsius por 30 minutos, agitando a 60 RPM.

Após a digestão, filtrar a amostra digerida através de um filtro de 100 mícrons para um tubo novo de 15 mililitros. Em seguida, passe 10 mililitros de meio de cultura DEFAT suplementado com 2%FBS pelo filtro. Para isolar as células adiposas da suspensão celular, primeiro centrifugue as células filtradas a 100 vezes g por um minuto à temperatura ambiente.

Durante a centrifugação, prepare cinco mililitros de DCM suplementados com 2%FBS em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, use uma pipeta de 1000 microlitros para extrair as células de gordura flutuantes do tubo centrifugado e adicione as células a um tubo de 15 mililitros contendo meio. Agite o tubo suavemente para misturar o meio DCM com as células.

Em seguida, centrifugue o tubo a 100 vezes g durante um minuto à temperatura ambiente. Após a centrifugação, use uma agulha de calibre 18 e uma seringa de 20 mililitros para remover o meio no fundo do tubo. Em seguida, adicione 10 mililitros de DCM suplementado com 2% de FBS às células e misture agitando o tubo suavemente.

Centrifugar novamente as pilhas a 100 vezes g durante um minuto à temperatura ambiente. Para iniciar o revestimento, adicione 41 mililitros de DCM ou DMEM suplementado com 20% FBS a um frasco de 12,5 centímetros. Em seguida, use uma pipeta de 200 microlitros para extrair 40 microlitros de células de gordura e adicioná-las ao frasco.

Em seguida, encha o frasco com DCM ou DMEM suplementado com 20% de FBS. É fundamental que as células estejam espalhadas por todo o meio. Coloque o frasco na tampa de uma placa de Petri redonda para mantê-la plana.

Por fim, coloque o frasco dentro de uma incubadora ajustada para 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius e deixe-o sem perturbação por sete dias. Após uma semana de incubação, inverter o balão e verificar se há células de gordura desdiferenciadas. Em seguida, aspire o meio e adicione cinco mililitros de DCM ou DMEM suplementado com 20% de FBS ao frasco.

Deixe as células DEFAT crescerem por mais uma semana após a troca do meio. Após uma semana, use um contador de células para contar o número de células DEFAT geradas sob várias condições de cultura de células. Esta imagem mostra colônias de células DEFAT após 14 dias de cultivo em DMEM.

Aqui as células DEFAT são mostradas após 14 dias de cultura em DCM. Em cada caso, a barra de escala representa 200 mícrons. A proliferação de células DEFAT foi quantificada usando um contador de células, e a eficiência do DCM e do DMEM na geração de células DEFAT foi comparada.

Como visto aqui, a proliferação celular aumentada é observada com o uso de DCM. Aqui, células DEFAT humanas, geradas usando DCM, foram cultivadas por três semanas no meio de indução apropriado para avaliar as habilidades de rediferenciação e diferenciação das células DEFAT. As células foram positivas para a capacidade osteogênica pela coloração de fosfatase alcalina e pela coloração com Vermelho de Alizarina S. Finalmente, a capacidade adipogênica foi mostrada com uma coloração de Vermelho Óleo O.

É muito importante garantir que a colagenase com isolamento rudimentar e de células adiposas seja realizada com o máximo cuidado para gerar com sucesso células DEFAT de alta qualidade. Por meio desses esforços, nosso método de cultura de células validado visa facilitar os esforços de pesquisa atuais e futuros nas áreas de biologia do desenvolvimento e medicina regenerativa.