Name: Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Aprenda um método eficiente de cultura celular para gerar células de gordura desdiferenciadas (DFAT) com maior qualidade. Esta técnica aprimora aplicações em medicina regenerativa e engenharia de tecidos.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa para Criação de Start-ups de Pesquisa e Tecnologia Avançada (Programa START) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (ST261006IP, TM) e pelo Programa para a Fundação de Pesquisa Estratégica em Universidades Privadas (2014-2019) (S1411018, TM) do Ministério da Educação, Esportes, Ciência e Tecnologia.

As amostras de gordura subcutânea humana foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia nos Departamentos de Cirurgia Plástica, Urologia, Cirurgia Pediátrica e Cirurgia Ortopédica da Universidade Nihon Itabashi Hospital (Tóquio, Japão). Os pacientes deram consentimento informado por escrito, e do Comité de Nihon University School of Medicine de Ética aprovou o estudo. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Traga a amostra de tecido da sala de operações para o laboratório. </li><li> Lavar 1-2 g de tecido adiposo com 5 ml de PBS (-) à temperatura ambiente (TA), uma vez, em um tubo de 50 ml e, em seguida, colocar a amostra num prato de plástico de 10 cm. </li></ol> 2. A colagenase digestão <ol><li> Retirar a amostra do PBS (-), em seguida, adicionar 10 ml de solução estéril de 0,1% (w / v) de solução de colagenase (colagenase de tipo II) para o prato que contém a amostra de tecido. </li><li> Picar o tecido com tesouras cirúrgicas durante aproximadamente 15 minutos, até que se atinja um puré consistemrência. </li><li> Subsequentemente, digerir o tecido picada no 0,1% (w / v) de solução de colagenase a 37 ° C durante 30 minutos (60 rpm) num tubo de 50 ml com agitação suave num agitador. </li><li> Filtrar a amostra digerida através de um filtro de 100 um para um tubo de 50 ml. Em seguida, passar 10 ml de DCM (ver Tabela de Materiais) suplementado com FBS a 2% através do filtro. </li></ol> Isolamento 3. celular <ol><li> Centrifugar as células filtradas em 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente. </li><li> Neste ponto, preparar 5 ml de DCM suplementado com FBS a 2% em um tubo de 50 ml. </li><li> Em seguida, elaborar as células de gordura flutuantes utilizando uma pipeta ul 1.000 e adicionar as células a um meio contendo 50 ml tubo. </li><li> Posteriormente, agite o tubo de 50 ml suavemente para misturar o meio DCM com as células. </li><li> Em seguida, o tubo de centrifugação a 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar a forma na parte inferior do tubo, usando uma agulha 18 G e seringa de 20 ml. </li><li> Em seguida, adicione 10 ml de DCM supplemented com FBS a 2% para as células colhidas. </li><li> Misturar o DCM com as células por agitação no tubo de 50 ml suavemente. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 100 xg durante 1 min à temperatura ambiente. </li></ol> 4. Células chapeamento <ol><li> Adicionar 41 ml de DCM ou DMEM suplementado com FBS a 20% a um frasco de 12,5 centímetros. </li><li> Em seguida, utilizando uma pipeta de 200 uL adicionar 40 ul de células de gordura para o balão. </li><li> Em seguida, encher o frasco com DCM ou DMEM suplementado com 20% FBS. Passo crítico: Neste momento, assegurar que as células estão espalhados por todo o meio. Verificar visualmente as células destacadas e depois manter o frasco sobre a tampa de uma placa de Petri rodada para mantê-lo liso. </li><li> Finalmente, colocar o balão no interior da incubadora e deixá-la sem ser perturbado em uma incubadora de CO 2 a 5% a 37 ° C durante 7 dias. </li><li> Na sequência de uma semana de incubação, inverter o frasco e verificar se as células DFAT. Em seguida, avaliar DFAT geração de células de proficiência, como descrito 10 desde a este ponto fibroblcélulas AST-like (células DFAT) estão localizados em regiões distintas a partir de células de gordura. </li><li> Adicionar 5 ml de DCM ou DMEM suplementado com FBS a 20% para o balão a seguir à remoção do meio de cultura de células anterior. Permitir que as células DFAT a crescer por mais uma semana depois de mudar o meio. </li><li> Utilizando um contador de células, contar o número de células DFAT gerados sob várias condições de cultura de células (DCM vs DMEM). </li></ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Adipócitos maduros que passam na desdiferenciação vitro, um processo conhecido como cultura de teto, pode reverter para um fenótipo mais primitivo e ganhar habilidades proliferativa. Estas células são referidas como células de gordura (desdiferenciado DFAT). foi avaliado o potencial de diferenciação das células multilinhagens DFAT. A análise de citometria de fluxo e análise da expressão de genes revelaram que as células DFAT eram altamente homogénea em comparação com 6 ASC. Na verdade, o per...

A terapia celular e engenharia de tecidos são tópicos quentes no campo da medicina regenerativa 1-5. Embora essas modalidades terapêuticas são uma grande promessa, várias questões técnicas actualmente dificultam a sua utilização clínica. A este respeito, como na geração de células iPS, todas as terapias de engenharia de tecidos devem produzir células livres de transduções de genes externos, a fim de manter a segurança do paciente. Dessa forma, foram o primeiro grupo a produzir com sucesso células DFAT humanos 6. Vários outros grupos de pesquisa têm uma vez adoptada nosso método para gerar células de origem em mamíferos DFAT 7-9, destacando ainda mais a utilidade do nosso modelo. Ao longo de vários estudos, verificou-se que a qualidade do ambiente de cultura de células podem ser modificadas por ajustamento do teor do meio celular. Esta descoberta conduziu a um aumento na taxa de sucesso da produção de células DFAT e melhoria da qualidade de células; ambos os fatores críticos paraeficiente geração de células para futuros ensaios clínicos. A este respeito, um melhor meio de cultura DFAT (DCM, um produto semelhante a CTM a forma de células, que contém a insulina recombinante humana, albumina de soro, ácido L-glutâmico, vários ácidos gordos, e colesterol) e um método para a geração de células DFAT e proliferação foi desenvolvido (mais informações sobre o conteúdo do DCM está disponível mediante solicitação). Usando este método de elevada qualidade DFAT células foram gerados com a capacidade de se diferenciar em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogénica, e as células condrogénicas. Ao todo, este protocolo de cultura celular validado melhora a qualidade das células DFAT e pode ser bastante útil para melhorar aplicações clínicas de terapia celular e engenharia de tecidos.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC médio&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>Este meio é definido como DCM no texto</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>Não contém Mg2+ e Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM meio</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células Falcon 100 &mu; m Amarelo</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12.5 cm&sup2; Cantil de Cultura de Células de Pescoço Retangular com Tampa de Rosca Azul Ventilada</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>agulha de 18 G</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 20 ml&nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Contador de relhas série Z</td><td>BECKMAN RELHA</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

engenharia de tecidos e terapia celular são uma grande promessa clinicamente. A este respeito, as células multipotentes, tais como células estaminais mesenquimais (MSCs), pode ser utilizado terapeuticamente, no futuro próximo, para restaurar a função de órgãos danificados. No entanto, várias questões técnicas, incluindo o procedimento altamente invasivo de isolar MSCs e da ineficiência que cerca sua amplificação, atualmente dificultam o potencial uso clínico dessas modalidades terapêuticas. Aqui, nós apresentamos um método altamente eficiente para a geração de células indiferenciadas de gordura (DFAT), células MSC-like. Curiosamente, as células DFAT podem ser diferenciados em vários tipos de células, incluindo adipogênica, osteogênico, e células condrogênicas. Embora outros grupos apresentaram anteriormente vários métodos para gerar células DFAT a partir de tecido adiposo maduro, nosso método nos permite produzir células DFAT de forma mais eficiente. A este respeito, foi demonstrado que o meio de cultura DFAT (DCM), suplementado com FBS a 20%,é mais eficaz na geração de células DFAT que DMEM, suplementado com 20% FBS. Além disso, as células DFAT produzidos pelo nosso método de cultura de células pode ser redifferentiated em vários tipos de tecidos. Como tal, é apresentado um modelo muito interessante e útil para o estudo de desdiferenciação tecido.

<html> Neste estudo, o método e o kit de ferramentas para a geração de célula DFAT foi melhorada (Figura 1). O nosso método permite gerar células DFAT usando tanto DCM e meio DMEM contendo 20% de FBS (Figura 2A). Como tal, comparou-se a eficiência de DCM e DMEM na geração de células DFAT. A este respeito, o DCM promoveu a proliferação de células DFAT por três vezes quando comparado com DMEM, independentemente do número de adipócitos (Figura 2A</st...

Modificamos as condições para a geração de células DFAT e fornecemos aqui informações sobre o uso de um meio de crescimento aprimorado para a produção dessas células.

Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

O objetivo geral deste novo método de cultura celular é gerar células adiposas desdiferenciadas com maior eficiência. Nosso método pode ajudar pesquisadores que atuam na área de medicina regenerativa a responder perguntas fundamentais sobre os diversos processos envolvidos na produção de células adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. Uma vez que a principal vantagem do nosso protocolo de cultura celular é a melhoria da qualidade das células DEFAT, ele poderá ser aplicado em um futuro próximo para aprimorar as aplicações atuais em terapia celular e engenharia de tecidos.Após trazer a amostra de gordura subcutânea do paciente do centro cirúrgico para o laboratório, pese o tecido e coloque uma amostra de um a dois gramas de tecido adiposo em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, lave a amostra com cinco mililitros de PBS e, depois, transfira a amostra para uma placa plástica de 10 centímetros. Remova o PBS.Em seguida, adicione 10 mililitros de colagenase estéril a 0,1% peso por volume ao recipiente contendo a amostra. Depois, use tesoura cirúrgica para picar o tecido até que atinja uma consistência pastosa. Transfira o tecido picado e a solução de colagenase para um tubo cônico d

an-efficient-method-to-obtain-dedifferentiated-fat-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Os adipócitos maduros podem representar uma fonte abundante de células-tronco por meio da desdiferenciação, o que leva a uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos. A digestão da colagenase é usada para isolar adipócitos maduros da gordura humana. O objetivo do nosso protocolo é obter células de gordura multipotentes e desdiferenciadas a partir de adipócitos humanos maduros.

Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Apresentamos as técnicas necessárias para isolar a fração vascular estromal (SVF) de depósitos de tecido adiposo inguinal (subcutâneo) e perigonadal (visceral) de camundongos para avaliar sua expressão gênica e atividade colagenolítica. Este método inclui o enriquecimento de células-tronco derivadas de alto teor adiposo (ASCs) Sca1 usando separação celular imunomagnética.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Tecido adiposo branco (WAT) tem deficiências críticas em seus modelos de cultura primária atual, dificultando o Desenvolvimento farmacológico e estudos metabólicos. Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um sistema de microphysiological de tecido adiposo por WAT imprensar entre lençóis de células do estroma. Essa construção fornece uma plataforma estável e adaptável para a cultura primária de WAT.

Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.

Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência. As FAPs obtidas a partir deste protocolo podem ser efetivamente expandidas e diferenciadas para miofibroblastos e adipócitos.

Isolamento, expansão e diferenciação de progenitores fibroadipogênicos do modelo de camundongo espinhoso

Aqui, apresentamos um protocolo que pode transformar o tecido adiposo autólogo em várias substâncias componentes adiposas com diferentes propriedades e funções físico-químicas.

Fracionamento inovador de tecido adiposo para transformar gordura em componentes especializados

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Aprenda um método eficiente de cultura celular para gerar células de gordura desdiferenciadas (DFAT) com maior qualidade. Esta técnica aprimora aplicações em medicina regenerativa e engenharia de tecidos.

Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

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