Desenvolvimento e manutenção de um tumor do paciente pré-clínica Derivado Xenoenxerto Modelo de Investigação de Novel Anti-Cancer Therapies

O objetivo geral deste procedimento subcutâneo de Xenoenxerto de Tumor Derivado do Paciente é estudar a eficácia de novas terapias, descoberta preditiva de biomarcadores e vias resistentes a medicamentos em tumores. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da oncologia sobre se um determinado medicamento exibe atividade contra um tipo específico de tumor. A principal vantagem dessa técnica é que os Xenógrafos de Tumores Derivados do Paciente mantêm a heterogeneidade molecular, genética e histológica típica dos tumores de origem, tornando o modelo mais clinicamente relevante.

Demonstrando o procedimento estará Stacey Bagby, assistente de pesquisa profissional e técnica veterinária certificada de nosso laboratório. Depois de coletar um a dois mililitros de sangue em um tubo de separação de células sanguíneas contendo citrato de sódio, centrifugue as amostras e transfira a camada de células mononucleares do sangue periférico para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Encha o tubo até o topo com PBS estéril.

Em seguida, gire as células novamente. Seguido de uma lavagem rápida com um mililitro de PBS, tomando cuidado para não perturbar o pellet PMBC. Em seguida, use uma pipeta para transferir o plasma do tubo de coleta de células sanguíneas para um frasco criogênico estéril de 1,5 mililitro e armazene o plasma e o pellet PBMC a 80 graus Celsius negativos.

Transfira o tecido tumoral humano para a instalação animal em um copo estéril contendo meio completo e coloque o copo em uma capela de fluxo laminar. Assim que possível, após a colheita, transfira o tecido para uma placa de corte de plástico estéril em uma pequena quantidade do meio de recuperação. Em seguida, usando uma pequena tesoura e fórceps esterilizados em autoclave, corte o tecido em pedaços de aproximadamente três por três por três mililitros e coloque de 10 a 12 pedaços em um tubo de microcentrífuga esterilizado em autoclave de 1,5 mililitro contendo 300 microlitros de solução de mistura de proteínas gelatinosas em gelo para o implante.

Para armazenamento congelado instantâneo, transfira o número apropriado de pedaços de tumor para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e coloque o frasco em um dosador de nitrogênio líquido. Em seguida, coloque em um freezer de 80 graus Celsius negativos. Para infixação formal e inclusão em parafina, coloque três pequenos pedaços de tumor em um copo de formalina a 10% de 10 mililitros por 24 horas.

Depois que os tecidos forem processados em blocos embebidos em parafina, transfira quaisquer pedaços de tecido restantes para um tubo criogênico. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo suplementado com 10% de DMSO ao tecido e armazene os tubos no gelo até que possam ser transferidos para um recipiente de congelamento com álcool isopropílico. E coloque esse recipiente em um freezer de 80 graus Celsius negativos.

Para injetar o tecido tumoral, carregue os pedaços de tumor armazenados na solução de mistura de proteínas gelatinosas em trocartes autoclavados de calibre 12, cuidando para que cada pedaço de tumor seja completamente inserido no trocarte. Em seguida, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um camundongo atímico nu de seis a oito semanas e transfira o mouse para um campo limpo em uma capa de fluxo laminar estéril. Entregue o tumor F0 por via subcutânea na região dorsal do pescoço e em cada lado do flanco do camundongo, seguido pela administração subcutânea de analgesia distal a um dos locais do flanco da injeção do tumor.

Em seguida, coloque o mouse de volta em sua gaiola com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Monitore o crescimento e a saúde dos camundongos implantados com xenógrafo pelo menos uma vez por semana, registrando os tamanhos dos tumores, a geração do tumor, a data da injeção do tumor e a saúde dos camundongos em um sistema de rastreamento apropriado. Quando um tumor atingir aproximadamente 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos de tamanho, use tesouras e fórceps autoclavados para extirpar o tumor e passar o tumor F1 para a próxima geração de cinco animais, como acabamos de demonstrar, tendo o cuidado de coletar formalina congelada instantânea e amostras de tumores viáveis, conforme demonstrado para cada tumor.

Quando os camundongos restantes do grupo de tumores F0 exibirem tumores de aproximadamente 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos de tamanho, colete esses tumores conforme demonstrado para coleta. Quando a geração do tumor no estágio F15 for atingida, use a primeira geração de pedaços tumorais viáveis disponíveis no armazenamento de nitrogênio líquido para a próxima série de injeções tumorais. Quando o tumor desejado for muito grande, 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos, siga os procedimentos acima para coletar o tumor e expandi-lo para a quantidade desejada de camundongos.

Dose os camundongos com a droga e pese-os e meça-os duas vezes por semana. Randomize os camundongos em grupos de tratamento com 10 tumores por grupo e uma média de volume tumoral de grupo de 100 a 300 milímetros cúbicos dentro de alguns desvios padrão um do outro. Em seguida, classifique os camundongos nos grupos apropriados para tratamento.

A hibridização in situ de fluorescência de duas cores para o DNA humano e de camundongo capturado demonstra que as células estromais humanas no tumor F0 são substituídas pelas células estromais de camundongo no tumor F1. Considerando que, todo o fator de crescimento de hepatócitos derivado de humanos na geração F0 é substituído pelo fator de crescimento de hepatócitos de camundongo na geração F1, o ligante do fator de crescimento endotelial vascular consiste em proteínas humanas e de camundongos na geração F1. O tratamento de diferentes gerações do mesmo tumor não altera a resposta ao tratamento.

Com a resistência ou sensibilidade do tumor parecendo ser uma cepa tumoral em vez de específica da geração do tumor. Além disso, a frequência de mutações nesses genes comumente mutados é muito semelhante entre o atlas do genoma do câncer e o banco de xenógrafos de tumores derivados de pacientes colorretais. Sugerindo que as mutações comuns observadas na população de pacientes colorretais estão bem representadas no modelo de xenotransplante derivado de pacientes colorretais.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma a duas horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ter uma equipe clínica coesa para identificar e obter o consentimento dos pacientes com câncer e para a remoção e macroscopagem do tecido tumoral. Após esse procedimento, outros métodos, como a investigação de compostos anticancerígenos como agentes únicos ou combinados, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a viabilidade dessas estratégias para pacientes com um determinado tipo de tumor.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da oncologia explorarem novas terapias contra o câncer, heterogeneidade tumoral, mecanismos resistentes ao tratamento, biologia de células-tronco cancerígenas e interações estromais tumorais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como desenvolver e manter um modelo de xenógrafo de tumor derivado de paciente para avaliar novas terapias contra o câncer.