Name: Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda a desenvolver transdutores químicos sintéticos que ativam enzimas detoxificantes por fatores de crescimento em engenharia de proteínas. Este método avança terapias de transdução de sinais artificiais.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Minerva, a Organização HFSP e um Grant Conselho Europeu de Investigação (Começando Grant 338265).

1. Síntese do &quot;Chemical Transdutor &#39; <ol><li> Os preparativos preliminares <ol><li> Preparar 2 M de acetato de trietilamónio tampão (TEAA) por mistura de 278 ml de trietilamina, com 114 ml de ácido acético e 400 ml de água ultrapura. Ajustar o pH a 7 e adicione água até um volume final de 1 L. mantê-lo em um frasco escuro. Nota: Esta solução é estável durante anos. </li><li> Prepara-se uma solução de ácido ascórbico 5 mM por dissolução de 18 mg de ácido ascórbico em 20 ml de água ultrapura. Use uma solução fresca; a solução é estável durante um dia. </li><li> Prepara-se uma solução de Cu 10 mM (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amina (TBTA) por dissolução de 25 mg de cobre (II) penta-hidrato de sulfato em 10 ml de água ultrapura e 58 mg de TBTA em 11 ml de dimetil sulfóxido (DMSO). Misturar as duas soluções. Mantenha-o em temperatura ambiente e proteger da luz. </li></ol></li><li> conjugação Procedimento <ol><li> Dissolve-se 100 nmoles do oligonucleótido modificado (ODN-1) em 80 ulde água ultrapura fresca. Adicionar 20 ul de TEAA 2 M, pH = 7. Adicionar 80 ul de uma solução feita recentemente de ácido ascórbico (5 mM em água). </li><li> Dissolve-se 1,5 mol (574,5 g) de ácido etacrínico modificada-azido em 180 ul de DMSO e adicioná-lo para a solução. Desgaseificar a solução com árgon durante 60 segundos e rapidamente adicionar 40 ul a partir da (ii) Solução de Cu / TBTA (10 mM em 55% (v / v) de DMSO / água). </li><li> Purgar novamente com Argon, fechar bem e agitar durante a noite. </li><li> Monitorizar o progresso da reacção e purificar o conjugado por RP-HPLC (fase móvel: A) 5% acetonitrilo, 5% de TEAA, 90% de água ultrapura; B) 65% de acetonitrilo, 5% de TEAA, 30% de água ultrapura). 24 </li></ol></li></ol> 2. Controlar GST Atividade por PDGF <ol><li> Os preparativos preliminares <ol><li> Preparar 50 ml de tampão de ensaio por mistura de 33,9 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBSx1) com 16,1 ml de água ultrapura para atingir uma concentração final de fosfato de 8 mm e add 23,8 mg de MgCl2 para obter uma concentração final de 5 mM. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de GST M1-1 por dissolução da proteína em tampão contendo Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM (DTT), 5 mM e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para uma concentração final de 30 uM. Divida esta solução em pequenas alíquotas e armazenar a -80 C. Diluir recentemente, de acordo com a secção 2.1.5.1, no tampão de ensaio e manter em gelo. Nota: a solução será estável durante cerca de 5 horas, ou até que haja uma redução na actividade da enzima. </li><li> Prepara-se o substrato de acordo com as seguintes instruções: <ol><li> Dissolve-se 10 mg de glutationa reduzida (GSH) em 325 ul de água ultrapura até uma concentração final de solução de estoque de 100 mM. Dilui-se 21 ul desta solução de stock em 979 ul de tampão de ensaio para uma concentração final de solução de trabalho de 2,1 mM. </li><li> Dissolve-se 10 mg de 2,4-dinitroclorobenzeno (CDNB) em 492 ul de eThanol para uma concentração final da solução de estoque 100 mM. Dilui-se 43,2 ul de solução de reserva em 956,8 ul de um tampão de ensaio para uma concentração final de 4,32 mM de solução de trabalho. </li></ol></li><li> Em uma placa de 96 poços, coloque cada substrato em uma linha separada (12 poços). Inserir, pelo menos, 60 uL em cada poço para permitir a retirada fácil e rápida da solução. Cubra o prato com uma folha de alumínio para proteção contra a luz. </li><li> Prepare as seguintes soluções de no tampão de ensaio: <ol><li> Diluir GST M1-1 por 50 a uma concentração final de 0,6 uM do dímero. </li><li> Dilui-se a &#39;transdutor químico »a uma solução de estoque de 30? M. </li><li> Dilui-se PDGF para uma concentração final de 40 uM. </li><li> Diluir PDGF aptâmero a uma concentração final de 250 uM. </li></ol></li></ol></li><li> Medir a atividade da GST na Presença do &#39;transdutor química &quot;e PDGF. <ol><li> Estabelecer um procedimento experimental iN o leitor de placas para a medição cinética. <ol><li> Criar uma nova experiência como um &quot;protocolo padrão &#39;. </li><li> Pressione no &quot;processo&quot; para abrir a janela de configurações do procedimento. </li><li> Na lista pop-up na parte superior da janela, escolher o tipo de &#39;384 placa&#39; de acordo com o fabricante da placa. </li><li> Pressione &#39;Ler&#39; no menu à esquerda. </li><li> Em relação ao método de detecção escolha &#39;Absorvância&#39;. </li><li> Em relação ao tipo de leitura escolha &#39;ponto final&#39;. </li><li> Adicione 340 nm na janela de comprimento de onda. </li><li> Pressione na parte inferior &#39;placa completa &quot;no lado superior direito e escolha o bem a ser medido. </li><li> Pressione &quot;OK&quot; para fechar o &quot;Read&quot; janela. </li><li> Escolha &#39;start cinético &quot;no menu à esquerda. </li><li> Faça o tempo de execução 10 min. </li><li> Selecione a opção intervalos mínimos. </li><li> Pressione &quot;OK&quot; para fechar a janela cinética. </li><li> Arraste o &quot;Read&quot; linha into a medida cinética. </li><li> Pressione o botão &#39;validar&#39; e depois no botão &#39;ok&#39;. </li><li> Salve o experimento. </li><li> Pressione o botão &#39;play&#39;. Uma caixa de diálogo aparecerá - pressione o botão &#39;ok&#39; apenas quando a medição deve ser iniciado. </li></ol></li><li> A fim de realizar o experimento triplicado, preparar quatro amostras de cada uma contendo 3,25 mL da &#39;transdutor química &quot;e 3,25 ul de GST M1-1. Adicionar a cada amostra de 0, 1,2, 2,4, ou 4,9 ul de PDGF e 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 ou ul de tampão de ensaio, respectivamente. </li><li> Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 40 ul de amostra a cada poço. Inserir as amostras apenas nos poços ímpares ou apenas do mesmo poços na mesma linha para permitir a utilização de um multi-pipeta para adição de substrato. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul de cada uma das tele substratos que foram previamente preparados, na placa de 96 poços (secção 2.1.4). Misture delicadamente e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética. Como a cinética de GST é bastante rápido, tentar minimizar o tempo entre a adição de substrato e o início da medição cinética. </li></ol></li><li> GST Activation Ciclos / inibição mediada pelo &quot;transdutor química&quot;. <ol><li> A fim de realizar o experimento triplicado, preparar 5 amostras, cada uma contendo 84,5 uL de tampão de ensaio, 3,25 ul de &#39;transdutor química &quot;, e 3,25 ul de GST M1-1. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Adicionar 3,65 mL de tampão de ensaio para a amostra 1 e 3,65 mL de PDGF para amostras 2-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Adicionar 3,12 mL de tampão de ensaio para as amostras 1-2 e 3,12 ul de PDGF aptâmero para amostras 3-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Adicionar 24.4 ul de tampão de ensaio para amostras1-3 e 24,4 ul de PDGF para amostras 4-5. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Adicionar 7,8 uL de tampão de ensaio para as amostras 1-4 e 7,8 ul de PDGF aptâmero a amostra 5. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 40 ul de amostra em cada poço. amostras inserir somente para o ângulo diferente, ou apenas para os poços até mesmo na mesma linha. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato (pré-preparado na placa de 96 poços). Misture delicadamente e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética. </li><li> Calcula-se a 0 V [mOD / min] sob cada condição subtraindo a densidade óptica medida a 340 nm a t = 0,5 min medido a partir da OD a 340 nm a t = 1,5 min para avaliar a activação / inibição de reciclagem. 25 </li></ol></li><li> Avaliar a resposta em tempo real do &#39;transdutor química&#39; para mudanças no ambiente. <ol> &lt;li&gt; efeito em tempo real de PDGF disso <ol><li> Estabelecer um procedimento experimental no leitor de placas para a medição cinética. </li><li> Repita os passos 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Faça o tempo de execução de 3,5 min. </li><li> Selecione a opção intervalos mínimos. </li><li> Pressione &quot;OK&quot; para fechar a janela cinética. </li><li> Arraste a linha de &quot;Read&quot; para a medição cinética. </li><li> Escolha Placa Out / In no menu à esquerda. </li><li> Escolha a opção &quot;placa out (sem diálogo) &#39;. </li><li> Escolha a opção &quot;Delay&quot; no menu à esquerda e entrar 30 seg. </li><li> Escolha Placa Out / In no menu à esquerda. </li><li> Escolha o &quot;prato em (sem diálogo)&quot; opção. </li><li> Criar uma segunda medição de cinética, repetindo os passos 2.2.1.4 - 2.2.1.14 mas na secção 2.2.1.11 definir a cinética de ser de 25 minutos em vez de 10 minutos. </li><li> Pressione o botão &#39;validar&#39; e depois no botão &#39;ok&#39;. </li><li> Salve o experimento. </li><li> Pressione o &#39;plabotão y &#39;. Uma caixa de diálogo aparecerá - pressione o botão &#39;ok&#39; apenas quando a medição deve ser iniciado. </li><li> Prepare duas amostras por mistura de 1 ul de GST M1-1 e 1 ul da &#39;transdutor químico »em 38 ul de tampão de ensaio. Coloque as amostras em duas cavidades de uma placa de 384 poços-transparente, deixando um poço vazio entre estes dois poços. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato, misturar suavemente e rapidamente para evitar bolhas, inserir a placa no leitor e iniciar a medição cinética. </li><li> Quando a chapa se abre para cima (após 3,5 min), adicionar rapidamente 1.125 ul de PDGF a um dos poços, misturar suavemente, e permitir que a placa para a fechar-se para as restantes medições cinéticas. </li></ol></li><li> efeito em tempo real da adição do PDGF aptâmero <ol><li> Repita os passos 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Prepare duas amostras por mistura de 1 ul de GST M1-1, 1 ul da &#39;transdutor química &quot;, e 1,125 mL de PDGF em 36,9 ul de tampão de ensaio. Coloque as amostras em duas cavidades de uma placa de 384 poços-transparente, deixando um poço vazio entre estes dois poços. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul a partir de cada substrato, misturar suavemente e rapidamente para evitar bolhas, inserir a placa no leitor, e iniciar a medição cinética. </li><li> Quando a chapa se abre para cima (após 1,5 min), adicionar rapidamente 1,2 mL de PDGF aptâmero a um dos poços, misturam suavemente e permitir que a placa para a fechar-se para as restantes medições cinéticas. </li></ol></li></ol></li><li> Meça JS-K Prï¿½fï¿½maco Ativação por GST na Presença do &#39;transdutor química &quot;e PDGF. <ol><li> Estabelecer um procedimento experimental no leitor de placas para a medição cinética. <ol><li> Criar uma nova experiência como um &quot;protocolo padrão &#39;. </li><li> Pressione no &quot;processo&quot; para abrir a janela de configurações do procedimento.</li><li> Na lista pop-up na parte superior da janela, escolha o tipo &#39;384 placa&#39; de acordo com o fabricante da placa. </li><li> Pressione &#39;Ler&#39; no menu à esquerda. </li><li> Em relação ao método de detecção escolhi &#39;absorvância&#39;. </li><li> Em relação ao tipo de leitura escolha &#39;ponto final&#39;. </li><li> Adicione 305 nm na janela de comprimento de onda. </li><li> Pressione o botão de &#39;placa completa &quot;no lado superior direito e escolha o bem a ser medido. </li><li> Pressione &quot;OK&quot; para fechar o &quot;Read&quot; janela. </li><li> Escolha &#39;start cinético &quot;no menu à esquerda. </li><li> Faça o tempo de execução 10 min. </li><li> Selecione a opção intervalos mínimos. </li><li> Pressione &quot;OK&quot; para fechar a janela cinética. </li><li> Arraste a linha de &quot;Read&quot; para a medição cinética. </li><li> Pressione o botão &#39;validar&#39; e depois no botão &#39;ok&#39;. </li><li> Salve o experimento. </li><li> Pressione o botão &#39;play&#39;. A bo de diálogox aparecerá - pressione o botão &#39;ok&#39; apenas quando a medição deve ser iniciado. </li></ol></li><li> Para a produção de medições usar um kit de calorimetria nitrito / nitrato. Numa placa de 96 poços inserir 50 ul de tampão de ensaio em uma fileira, 70 ul de Griess eu reagente numa segunda fila, e 70 ul de reagente de Griess II em uma terceira fila. </li><li> A fim de realizar o experimento triplicado, preparar quatro amostras de cada uma contendo 4,8 mL da &#39;transdutor química &quot;. Para a amostra 1, adicionar 155,2 ul de tampão de ensaio; a Amostra 2, adicionar 3,2 mL de GST-M1-1 e 152 ul de tampão de ensaio; a Amostra 3, adicionar 9,6 mL de PDGF e 145,6 uL de tampão de ensaio; e a amostra 4, adicionar 3,2 mL de GST-M1-1, 9,6 ul de PDGF, e 142,4 uL de tampão de ensaio. </li><li> Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Em uma placa de 384 poços-transparente, inserir 50 ul de amostra em cada poço. amostras de inserção apenas no estranho ou apenas namesmo poços na mesma linha para permitir a utilização de um multi-pipeta para adição de substrato. </li><li> Adicionar 0,54 mL de JS-K (5 mM em DMSO) a cada poço. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal 12, adicionar rapidamente 10 ul da solução de GSH (pré-preparado na placa de 96 poços), misturar suavemente e rapidamente, para evitar as bolhas. Insira a placa no leitor e iniciar a medição cinética. </li><li> Imediatamente após a medição da cinética, utilizando um multi-pipeta de 12 canais, tomar 50 ul de cada amostra para a linha de tampão de ensaio na placa de 96 poços pré-preparado e rapidamente adicionar-lhe 50 ul de Griess eu reagente e 50 ul de reagente de Griess II. Incubar enquanto protege da luz durante 10 min à temperatura ambiente e meça a absorvência a 550 nm. Nota: O tampão de ensaio e os volumes de reagentes são dependentes de protocolo dos kits. </li></ol></li></ol>

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<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Apresentamos um método para projetar e testar um 'transdutor químico' que pode induzir a comunicação artificial entre duas proteínas naturalmente não relacionadas, GST e PDGF, sem modificar as proteínas nativas. As comunicações GST-PDGF não naturais podem ser detectadas em tempo real usando ensaios enzimáticos que seguem as mudanças na atividade do GST na presença do 'transdutor químico' e aumentando as concentrações de PDGF. Além de detectar a ativação do GST pelo PDGF, esses ensaios foram usados para acompanhar a desat...

Vias de transdução de sinal de desempenhar um papel significativo em virtualmente todos os processos celulares e permitir que a célula para responder rapidamente aos sinais ambientais. 1 Estas vias são frequentemente desencadeada pela ligação de uma molécula de sinalização a um receptor extracelular, o que resulta na activação de enzimas intracelulares. A amplificação e a propagação deste sinal dentro da célula é mediada pela função de sinalização de proteínas que formam uma rede de interacções proteína-proteína, em que as enzimas são activadas de forma reversível com alta especificidade. Porque desregulação destas redes freqüentemente leva ao desenvolvimento do câncer, tem havido muito interesse no estabelecimento de &quot;terapia de transdução de sinal do câncer &#39;, 2 em que as drogas são projetados para interromper vias de sinalização malignas. Propusemos recentemente uma abordagem alternativa terapia para assinalar a transdução que se baseia na capacidade das drogas para gerar vias de transdução de sinal não naturais. <sup&gt; 3 em particular, acreditamos que através da concepção de agentes sintéticos que mimetizam a função das proteínas de sinalização, seria possível modular a função da célula indirectamente. Por exemplo, estas redes artificiais podem activar proteínas biomarcadores para activar enzimas que clivam pró-fármacos. Alternativamente, estes miméticos de proteínas de sinalização pode ser capaz de activar as vias de sinalização de células não-naturais, o que resulta em efeitos terapêuticos. Para demonstrar a viabilidade desta abordagem, criámos recentemente um transdutor química &quot;sintético 4, que permite que o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), para desencadear a clivagem de um pró-fármaco anticanceroso, activando a glutationa-S-transferase (GST), que é não o seu parceiro de ligação natural. A estrutura deste &quot;transdutor&quot; consiste em um aptâmero ADN anti-PDGF que é modificado com um inibidor bivalente para GST. Por isso, este agente sintético pertence a uma família de moléculas com locais de ligação paraproteínas diferentes, 5-7, tais como indutores químicos de dimerização (CIDs) 8-10 e também para o grupo de proteína de ligantes com base em conjugados de molécula oligonucleotídica-sintético. 21/11 Os princípios gerais da concepção de tais sistemas é aqui descrito e protocolos detalhados para sintetizar e testar a função deste &quot;transdutor&quot; com ensaios enzimáticos convencionais são fornecidos. Este trabalho destina-se a facilitar o desenvolvimento de transdutores &#39;&#39; adicionais desta classe, que pode ser usado para mediar a comunicação proteína-proteína intracelular e, consequentemente, para induzir vias de sinalização celular artificiais. A Figura 1 descreve esquematicamente os princípios de funcionamento dos transdutores &#39;&#39; químicos sintéticos que podem mediar a comunicação proteína-proteína não naturais. Nesta ilustração, um transdutor química &quot;, que integra ligantes sintéticos para protEins I e II (ligantes I e II), permite que a proteína II para desencadear a actividade catalítica da proteína I, que não é o seu parceiro de ligação natural. Na ausência de proteína II, o transdutor se liga ao sítio catalítico da enzima (proteína I) e inibe a sua actividade (Figura 1, no estado II). A ligação do &quot;transdutor&quot; de proteína II, no entanto, promove as interacções entre ligante I e a superfície da proteína II (Figura 1, no estado III), o que reduz a sua afinidade para a proteína I. Como resultado, a concentração eficaz do &#39; livre transdutor &#39;na solução é reduzida, o que conduz à dissociação do transdutor em proteínas do complexo I e a reactivação da proteína I (Figura 1, estado IV). Tomados em conjunto, estes passos destacar três princípios fundamentais subjacentes à concepção de transdutores &#39;&#39; eficazes: (1) um transdutor &#39;deve ter um ligante específico para cada um dos alvos de proteína, (2) a interacção between ligante II e proteína II deve ser mais forte do que a interacção entre o ligante I e proteína I, e (3) agente ligante que deve ser capaz de interagir com a superfície da proteína II. Este último princípio não exige necessariamente que aglutinante só eu teria uma alta afinidade e selectividade para a proteína II. Em vez disso, baseia-se nos nossos estudos recentes que mostraram que a interposição de uma molécula sintética na proximidade de uma proteína é susceptível de promover interacções entre esta molécula e a superfície da proteína 19,22,23. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Figura 1:. Operando princípios da &#39;transdutores químicas &quot;Quando o&#39; transdutor química &#39;é adicionada a uma proteína ativa I (estado i), que se liga ao seu sítio ativo através ligante I e inibe a sua actividade (estado ii). Na presença da proteína II, no entanto, não ligado a &#39;t químicaransducer &#39;interage com a proteína II por meio de ligante II, que promove as interacções entre ligante I e a superfície da proteína II. Esta pasta induzida I-proteína interação II reduz a concentração eficaz de ligante I, o que leva à dissociação do &#39;transducer&#39;-proteína I complexa e à proteína I reactivação (estado iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .</a>

<table><tbody><tr><td>1-cloro-2,4-dinitrobenzeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acenitrila</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Salino</td><td>Biológico Indústrias</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etacrínico</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa-s-transferase M1-1</td><td>Centro de Proteômica Estrutural de Israel (Instituto Weizmann de Ciência, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa reduzida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>kit de ensaio colorimétrico de nitrato/nitrito</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>W. M. Keck Foundation Biotechnology na Universidade</td><td></td> de Yale <td>pedido personalizado</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Centro de Proteômica Estrutural de Israel (Instituto Weizmann de Ciência, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de dessalinização</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Colunas</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp;</td><td>2695 módulo</td><td></td>de separação</tr><tr><td>Coluna HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 coluna (2,5 &mu; M, 4,6 mm e vezes; Coluna de HPLC de 50 mm</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Coluna Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 (2,5&nbsp; &mu; M, 10 mm e tempos; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

imitando a função de proteínas de sinalização: toward artificial signal therapy transdução

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

As vias de transdução de sinal, que controlam a resposta das células a vários sinais ambientais, são mediadas pela função de proteínas sinalizadoras que interagem entre si e se ativam umas às outras com alta especificidade. Agentes sintéticos que imitam a função dessas proteínas podem, portanto, ser usados para gerar etapas de transdução de sinal não naturais e, consequentemente, alterar a função da célula. Apresentamos diretrizes para projetar 'transdutores químicos' que podem induzir a comunicação artificial entre proteínas nativas. Além disso, apresentamos protocolos detalhados para sintetizar e testar um 'transdutor' específico, que pode induzir a comunicação entre duas proteínas não relacionadas: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e glutationa-S-transferase (GST). A maneira pela qual essa comunicação PDGF-GST não natural poderia ser usada para controlar a clivagem de um pró-fármaco anticâncer também é apresentada, indicando o potencial para o uso de tais sistemas em 'terapia de transdução de sinal artificial'. Este trabalho tem como objetivo facilitar o desenvolvimento de 'transdutores' adicionais desta classe, que podem ser usados para mediar a comunicação proteína-proteína intracelular e, consequentemente, para induzir vias de sinalização celular artificial.

A concepção, síntese e mecanismo de acção de um transdutor químico &quot;que pode induzir a comunicação artificial entre PDGF e GST são apresentados na Figura 2. A estrutura do&quot; transdutor &quot;integra um aptâmero ADN de PDGF e uma amida de bis-etacrínico (bEA ), que é um conhecido inibidor de GST (figura 2a). 19 Estes ligantes permitir o &#39;transdutor&#39; para se ligar tanto PDGF e GST com afinidades diferentes, a saber, com constant...

Apresentamos diretrizes para o desenvolvimento de 'transdutores químicos' sintéticos que podem induzir a comunicação entre proteínas naturalmente não relacionadas. Além disso, são apresentados protocolos detalhados para sintetizar e testar um 'transdutor' específico que permite que um fator de crescimento ative uma enzima desintoxicante e, consequentemente, regule a clivagem de um pró-fármaco anticâncer.

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

O objetivo geral deste experimento é acompanhar espectroscopicamente a comunicação não natural entre duas proteínas induzida por um transdutor químico sintético. Isso demonstrará a possibilidade de desenvolver análogos sintéticos de proteínas sinalizadoras que sejam capazes de realizar vias de transdução de sinal inexistentes na natureza. A capacidade de acompanhar a comunicação não natural entre proteínas por meio de um espectrofotômetro comum poderá ajudar a desenvolver e aprimorar a função de transdutores químicos artificiais, aproximando-nos da realização de terapias de transdução de sinal artificial.O transdutor químico é composto por um aptâmero de fator de crescimento derivado de plaquetas, ou PDGF, um inibidor bivalente de GST da etacrínica amida, um fluoróforo e um quenchador. A síntese do transdutor químico não será demonstrada neste vídeo.Mas é descrito no protocolo do texto. Os princípios de funcionamento do transdutor químico são ilustrados aqui. O transdutor químico inibe a atividade enzimática da GST quando os dois grupos EA ligam-se aos sítios ativos da enzima.A adição de PDGF leva à formação do complexo químico transdutor de PDGF. O que interrompe a interação entre o transdutor e a GST, restaurando assim a atividade enzimática da GST. A adição subsequente de um aptâmero de PDGF não modificado libera o transdutor químico e permite que ele volte a inibir a enzima.Antes de iniciar os experimentos para examinar o controle da atividade de GST pelo PDGF, configure um procedimento experimental no leitor de placas para medição cinética. Crie um novo experimento como um protocolo padrão. Selecione Procedimento para abrir a janela de Configurações de Procedimento.No menu suspenso na parte superior da janela, escolha o Tipo de Placa 384 de acordo com o fabricante da placa. Selecione Ler no menu à esquerda. Escolha Absorbância como Método de Detecção.E Ponto final para o Tipo de Leitura. Na janela Comprimento de onda, digite 340 nanômetros. Selecione Placa Inteira e escolha as poças a serem medidas.Em seguida, clique em OK para fechar a janela de Leitura. No menu à esquerda, escolha Iniciar Cinética. Defina o Tempo de Execução como 10 minutos.Selecione a opção Intervalos Mínimos. Em seguida, clique em OK para fechar a janela Cinética. Arraste a Linha de Leitura para a Medição Cinética.Selecione o botão Validar, seguido pelo botão OK. Salve o experimento. Selecione o botão Executar.Uma caixa de diálogo aparecerá, mas não selecione o botão OK até estar pronto para iniciar a medição cinética. Uma vez que o leitor de placas tenha sido configurado, o próximo passo é preparar as amostras para medir a atividade da GST na presença do transdutor químico e do PDGF. Para testar quatro concentrações de PDGF em triplicata, prepare quatro amostras, sendo que cada uma contém 3,25 µL do transdutor químico e 3,25 µL da GST M-1.Adicione a cada amostra, respectivamente, zero, 1,2, 2,4 ou 4,9 microlitros de PDGF. Em seguida, adicione o volume apropriado do tampão de ensaio a cada amostra para ajustar o volume total a 130 microlitros. Incube as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos.Após 10 minutos, transfira 40 microlitros de cada amostra para os poços de uma placa transparente de 384 poços. Transfira cada uma das quatro amostras apenas para os poços ímpares ou pares da mesma linha. Isso permite o uso de um pipetador múltiplo para a adição do substrato.Em seguida, utilize um multicanal de 12 canais para adicionar rapidamente a cada amostra 10 microlitros de cada substrato previamente preparado em uma placa de 96 poços. Misture rapidamente, mas com cuidado, para evitar bolhas. Insira imediatamente a placa no leitor de placas e inicie a medida cinética selecionando o botão OK na caixa de diálogo.Para examinar os ciclos de inibição da ativação da GST mediados pelo transdutor químico, prepare cinco amostras, cada uma contendo 84,5 microlitros de tampão de ensaio, 3,25 microlitros de transdutor químico e 3,25 microlitros de GST M1-1. Incube à temperatura ambiente por três minutos.Adicione 3,65 microlitros de tampão de ensaio à amostra um e 3,65 microlitros de PDGF às amostras dois, três, quatro e cinco. Incube em temperatura ambiente por três minutos. Adicione 3,12 microlitros de tampão de ensaio às amostras um e dois e 3,12 microlitros de aptâmero de PDGF às amostras três, quatro e cinco.Incubar à temperatura ambiente por três minutos. Adicione 24,4 microlitros de tampão de ensaio às amostras um, dois e três. E 24,4 microlitros de PDGF às amostras quatro e cinco.Incubar à temperatura ambiente por três minutos. Adicione 7,8 microlitros de tampão de ensaio às amostras de um a quatro e 7,8 microlitros de aptâmero PDGF à amostra cinco. Incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.Transfira as amostras para uma placa de 384 poços transparente. Para realizar o experimento em triplicata e adicionar rapidamente o substrato às amostras, insira a placa no leitor e inicie a medição cinética.Para iniciar este ensaio, configure um procedimento experimental no leitor de placas para medição cinética conforme descrito no texto do protocolo. Prepare duas amostras em dois poços de uma placa transparente de 384 poços. Para cada poço, misture um microlitro de GST M1-1 e um microlitro do transdutor químico em 38 microlitros de tampão do ensaio.Deixe um poço vazio entre os dois poços. Usando um multicaneta de 12 canais, adicione rapidamente 10 microlitros de substrato a cada poço. E misture suave e rapidamente para evitar bolhas.Insira imediatamente a placa no leitor e inicie a medição cinética. Quando o leitor abrir após 3,5 minutos, adicione rapidamente 1,125 microlitros de PDGF a um dos poços, misture suavemente e permita que a placa retorne ao leitor para as medições cinéticas restantes. Antes de preparar as amostras para este experimento, configure um procedimento experimental no leitor de placas para medição cinética conforme descrito no texto do protocolo.Um kit colorimétrico de nitrito/nitrato será utilizado para medir a produção de óxido nítrico. Em uma placa de 96 poços, adicione 50 microlitros de tampão de ensaio por poço na primeira linha. Adicione 70 microlitros do Reagente Griess One por poço na segunda linha.E 70 microlitros do Reagente Dois de Griess por poço na terceira linha. Prepare quatro amostras, cada uma contendo 4,8 microlitros do transdutor químico. À amostra um, adicione 155,2 microlitros de tampão de ensaio.Para a amostra dois, adicione 3,2 microlitros de GST M1-1 e 152 microlitros de tampão do ensaio. Para a amostra três, adicione 9,6 microlitros de PDGF e 145,6 microlitros de tampão do ensaio. E para a amostra quatro, adicione 3,2 microlitros de GST M1-1, 9,6 microlitros de PDGF e 142,4 microlitros de tampão do ensaio.Incube as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. Distribua 50 microlitros de amostra por poço em uma placa de 384 poços transparente para realizar o experimento em triplicata. Distribua as amostras apenas nos poços ímpares ou pares da mesma linha para permitir o uso de uma pipeta múltipla na adição do substrato.Adicione 0,54 microlitros do pró-fármaco JS-K a cada amostra. Adicione rapidamente a cada amostra 10 microlitros de solução de glutationa e misture suave e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e inicie a medição cinética.Imediatamente após a medição cinética, transfira 50 microlitros de cada amostra para cada poço da primeira linha da placa de 96 poços com tampão do ensaio. Em seguida, transfira 50 microlitros de cada poço da segunda linha da placa para os poços da primeira linha da placa. E 50 microlitros por poço da terceira linha da placa para os poços da primeira linha da placa.Incube, protegendo da luz, por 10 minutos à temperatura ambiente. Antes de medir a absorbância em 550 nanômetros. A medição da atividade da GST sem o transdutor químico e com o transdutor químico mostrou que o transdutor químico inibe a atividade da GST.A GST é reativada pela adição de concentrações crescentes de PDGF ao complexo de transdutor químico com GST. Adições sequenciais de PDGF e de uma aptâmero de PDGF não modificada ao complexo de transdutor químico com GST revelaram que a comunicação entre PDGF e GST era reversível. A adição de PDGF ao complexo de transdutor com GST resultou em um aumento rápido da atividade da GST, 3,5 minutos após a adição dos substratos.Embora a adição de um aptâmero de PDGF a uma mistura de GST, PDGF e o transdutor químico tenha resultado em uma diminuição da atividade de GST. Esses resultados indicam que o sistema responde em tempo real às alterações em seu ambiente. Posteriormente, investigou-se a capacidade desse sistema em controlar a ativação de pró-fármacos utilizando JS-K, um pró-fármaco anticâncer que é ativado pela GST para liberar óxido nítrico tóxico.Medições das quantidades de óxido nítrico liberadas após a adição de JS-K ao transdutor químico e a diferentes combinações de GST e PDGF confirmaram que apenas a presença conjunta de GST e PDGF ativa o JS-K. Tudo isso demonstra como um agente sintético pode permitir que um fator de crescimento desencadeie a atividade catalítica da Glutationa S-Transferase, que não é sua enzima parceira natural. Biomiméticos futuros dessa classe poderão, portanto, ser utilizados para alterar a resposta das células a sinais ambientais ou fornecer-lhes novas propriedades.

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e<em&gt; Xenopus</em&gt; Desenvolvimento embrionário

Aqui, apresentamos um protocolo para matrizes de anticorpos identificar alterações nas vias de sinalização em vários modelos de celulares. Estas mudanças, causadas por drogas/hipóxia/ultra-violet luz/radiação ou superexpressão/downregulation/nocautes, são importantes para vários modelos da doença e podem indicar se uma terapia será eficaz ou pode identificar mecanismos de drogas resistência.

Avaliação da resistência aos inibidores de tirosina quinase por um interrogatório das vias de transdução de sinal por matrizes de anticorpo

É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.

Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica

A manipulação optogenética de vias de sinalização pode ser uma estratégia poderosa para investigar como a sinalização é decodificada no desenvolvimento, regeneração, homeostase e doença. Este protocolo fornece diretrizes práticas para o uso de ativadores de sinalização nodal e proteína morfogênica óssea (BMP) baseados em luz-oxigênio-voltagem no embrião inicial do peixe-zebra.

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

A ligação de trifosfato de guanosina (GTP) é um dos primeiros eventos na ativação do receptor acoplado com proteína G (GPCR). Este protocolo descreve como caracterizar farmacologicamente as interacções específicas de GPCR-ligando, monitorizando a ligação do análogo de GTP radio-marcado, [ 35 S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em Resposta a um ligando de interesse.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

Utilizou-se uma metodologia baseada em gradiente de centrifugação por densidade modificada para isolar células epiteliais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus . As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

A composição protéica da válvula mitral humana ainda é parcialmente desconhecida, pois sua análise é complicada pela baixa celularidade e, portanto, pela baixa biossíntese de proteínas. Este trabalho fornece um protocolo para extrair eficientemente proteínas para a análise do proteoma valvar mitral.

Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Aprenda a desenvolver transdutores químicos sintéticos que ativam enzimas detoxificantes por fatores de crescimento em engenharia de proteínas. Este método avança terapias de transdução de sinais artificiais.

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

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