Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

O objetivo geral deste experimento é seguir espectroscopicamente a comunicação não natural entre duas proteínas induzidas por um transdutor químico sintético. Demonstrará a possibilidade de desenvolver análogos sintéticos de proteínas sinalizadoras que serão capazes de realizar vias de transdução de sinal não encontradas na natureza. A capacidade de seguir a comunicação não natural de proteína para proteína por espectrofotômetro comum pode ajudar a desenvolver e melhorar a função de transdutores químicos artificiais e nos aproximar da realização da terapia de transdução de sinal artificial.

O transdutor químico é composto por um fator de crescimento derivado de plaquetas, ou aptâmero PDGF. Um inibidor bivalente de GST de amida etacrínica, um fluoróforo e um atenuador. A síntese do transdutor químico não será demonstrada neste vídeo.

Mas é descrito no protocolo de texto. Os princípios operacionais do transdutor químico são ilustrados aqui. O transdutor químico inibe a atividade enzimática do GST, quando os dois grupos EA se ligam aos sítios ativos das enzimas.

A adição de PDGF leva à formação do complexo transdutor químico PDGF. O que interrompe a interação transdutor-GST, restaurando assim a atividade enzimática do GST. A adição seguinte de um aptâmero PDGF não modificado libera o transdutor químico e permite que ele reibiba a enzima.

Antes de iniciar os experimentos para examinar o controle da atividade de GST por PDGF, configure um procedimento experimental no leitor de placas para medição cinética. Crie um novo experimento como um protocolo padrão. Selecione Procedimento para abrir a janela Configurações do Procedimento.

Na lista pop-up na parte superior da janela, escolha o Tipo de Placa 384 de acordo com o fabricante da placa. Selecione Ler no menu à esquerda. Escolha Absorbância para o método de detecção.

e ponto de extremidade para o tipo de leitura. Na janela Comprimento de onda, digite 340 nanômetros. Selecione Placa Cheia e escolha os poços a serem medidos.

Em seguida, clique em OK para fechar a janela Leitura. No menu à esquerda, escolha Iniciar cinética. Defina o tempo de execução como 10 minutos.

Selecione a opção Intervalos mínimos. Em seguida, clique em OK para fechar a janela Cinética. Arraste a linha de leitura para a medição cinética.

Selecione o botão Validar, seguido pelo botão OK. Salve o experimento. Selecione o botão Reproduzir.

Uma caixa de diálogo aparecerá, mas não selecione o botão OK até que esteja pronto para iniciar a medição cinética. Uma vez que o leitor de placas tenha sido configurado, o próximo passo é preparar as amostras para medir a atividade do GST na presença do transdutor químico e do PDGF. Para testar quatro concentrações de PDGF em triplicata, prepare quatro amostras onde cada uma contém 3,25 microlitros do transdutor químico e 3,25 microlitros de GST M-1.

Adicione a cada amostra, zero, 1,2, 2,4 ou 4,9 microlitros de PDGF, respectivamente. Em seguida, adicione o volume apropriado do tampão de ensaio a cada amostra para elevar o volume total a 130 microlitros. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos.

Após 10 minutos, transfira 40 microlitros de cada amostra para os poços de uma placa de 384 poços transparentes. Transferir cada uma das quatro amostras para os alvéolos pares ou ímpares apenas na mesma linha. Para permitir o uso de um multipipetador para adição de substrato.

Em seguida, use um multipipetador de 12 canais para adicionar rapidamente a cada amostra 10 microlitros de cada substrato previamente preparado em uma placa de 96 poços. Misture rapidamente, mas delicadamente, para evitar bolhas. Insira imediatamente a placa no leitor de placas e inicie a medição cinética selecionando o botão OK na caixa de diálogo.

Para examinar os ciclos de inibição da ativação de GST mediados pelo transdutor químico, prepare cinco amostras, cada uma contendo 84,5 microlitros de tampão de ensaio. 3,25 microlitros de transdutor químico e 3,25 microlitros de GST M1-1. Incube em temperatura ambiente por três minutos.

Adicione 3,65 microlitros de tampão de ensaio à amostra um e 3,65 microlitros de PDGF às amostras dois, três, quatro e cinco. Incube em temperatura ambiente por três minutos. Adicione 3,12 microlitros de tampão de ensaio às amostras um e dois e 3,12 microlitros de aptâmero PDGF às amostras três, quatro e cinco.

Incube em temperatura ambiente por três minutos. Adicione 24,4 microlitros de tampão de ensaio às amostras um, dois e três. E 24,4 microlitros de PDGF para as amostras quatro e cinco.

Incube em temperatura ambiente por três minutos. Adicione 7,8 microlitros de tampão de ensaio às amostras de um a quatro e 7,8 microlitros de aptâmero PDGF à amostra cinco. Incube em temperatura ambiente por cinco minutos.

Transfira as amostras para uma placa de poço transparente 384. Para realizar o experimento em triplicata, e adicionar rapidamente o substrato às amostras. Insira a placa no leitor e inicie a medição cinética.

Para iniciar este ensaio, configure um procedimento experimental no leitor de placas para medição cinética, conforme descrito no texto do protocolo. Prepare duas amostras em dois poços de uma placa de poço transparente 384. Para cada poço, misture um microlitro de GST M1-1 e um microlitro do transdutor químico em 38 microlitros de tampão de ensaio.

Deixe um poço vazio entre os dois poços. Usando um multipipetador de 12 canais, adicione rapidamente 10 microlitros de substrato a cada poço. E misture delicada e rapidamente para evitar bolhas.

Insira imediatamente a placa no leitor e inicie a medição cinética. Quando o leitor de placas abrir após 3,5 minutos, adicione rapidamente 1,125 microlitros de PDGF a um dos poços, misture suavemente e permita que a placa entre novamente no leitor para as medições cinéticas restantes. Antes de preparar as amostras para este experimento, configure um procedimento experimental no leitor de placas para medição cinética, conforme descrito no texto do protocolo.

Um kit colorimétrico de nitrito/nitrato será usado para medir a produção de óxido nítrico. Em uma placa de 96 poços, dispense 50 microlitros de tampão de ensaio por poço na primeira linha. 70 microlitros de Griess One Reagent por poço na segunda linha.

E 70 microlitros de Griess Two Reagent por poço na terceira linha. Prepare quatro amostras, cada uma contendo 4,8 microlitros do transdutor químico. Para amostrar um, adicione 155,2 microlitros de tampão de ensaio.

Para amostrar dois, adicione 3,2 microlitros de GST M1-1 e 152 microlitros de tampão de ensaio. Para amostrar três, adicione 9,6 microlitros de PDGF e 145,6 microlitros de tampão de ensaio. E para amostrar quatro, adicione 3,2 microlitros de GST M1-1, 9,6 microlitros de PDGF e 142,4 microlitros de tampão de ensaio.

Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos. Dispensar 50 microlitros de amostra por poço em uma placa de 384 poços transparentes para realizar o experimento em triplicata. Dispense amostras apenas para os poços pares ou ímpares na mesma linha para permitir o uso de um multipipetador para adição de substrato.

Adicione 0,54 microlitros de pró-fármaco JS-K a cada amostra. Adicione rapidamente a cada amostra 10 microlitros de solução de glutationa e misture delicada e rapidamente para evitar bolhas. Insira a placa no leitor e inicie a medição cinética.

Imediatamente após a medição cinética, transfira 50 microlitros de cada amostra para cada poço da primeira linha da placa de 96 poços com tampão de ensaio. Em seguida, transfira 50 microlitros de cada poço da segunda fileira da placa para os poços da primeira fileira da placa. E 50 microlitros por poço da terceira fileira da placa para os poços da primeira fileira da placa.

Incube enquanto protege da luz por 10 minutos em temperatura ambiente. Antes de medir a absorbância em 550 nanômetros. A medição da atividade de GST sem o transdutor químico e com o transdutor químico mostrou que o transdutor químico inibe a atividade de GST.

O GST é reativado pela adição de concentrações crescentes de PDGF ao complexo transdutor químico GST. Adições sequenciais de PDGF e um aptâmero PDGF não modificado ao complexo transdutor químico GST revelaram que a comunicação entre PDGF e GST era reversível. A adição de PDGF ao complexo GST-transdutor resultou em um rápido aumento na atividade de GST, 3,5 minutos após a adição de substratos.

Enquanto a adição de um aptâmero PDGF a uma mistura de GST, PDGF e o transdutor químico resultou em uma diminuição na atividade de GST. Esses resultados indicam que o sistema responde em tempo real às mudanças em seu ambiente. Posteriormente, a capacidade desse sistema de controlar a ativação do pró-fármaco foi investigada usando JS-K, um pró-fármaco anticâncer que é ativado por GST para liberar óxido nítrico tóxico.

As medições das quantidades de óxido nítrico liberadas após a adição de JS-K ao transdutor químico e diferentes combinações de GST e PDGF confirmaram que apenas a presença de GST e PDGF ativa o JS-K. Tudo isso mostra como um agente sintético pode permitir que um fator de crescimento desencadeie a atividade catalítica da glutationa S-transferase, que não é sua parceira enzimática natural. Futuros biomiméticos desta classe podem, portanto, ser usados para alterar a resposta das células aos sinais ambientais ou fornecer-lhes novas propriedades.