Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como a espectrometria de massa por eletroforese capilar, ou CE-MS, usando uma interface de ponta porosa sem bainha, pode ser usada para a análise de metabólitos altamente polares e carregados. Supondo que nenhum metabólito possa ser carregado com frequência, e eles podem ser catiônicos ou aniônicos, e separá-los separações eletrolíticas como eletroforese capilar é o método mais adequado. No entanto, nos últimos anos, a sensibilidade não foi boa o suficiente.

Isso se deveu à interface e o método também não era robusto. Mas acho que resolvemos bem os dois problemas usando uma bainha como interface livre e usando esse novo protocolo. A espectrometria de massa por eletroforese capilar usando uma nova interface de ponta porosa sem bainha pode ser usada para abordar questões clínicas importantes no campo da metabolômica.

Por exemplo, o perfil de metabólitos carregados altamente polares pode ser feito facilmente com essa tecnologia. Compósitos S separados na base da relação carga/tamanho. Mais frequentemente, esta técnica é muito adequada para o perfil deste tipo de volume de compostos marcados em amostras biológicas.

Uma característica única da metodologia CE-MS sem bainha proposta é que eles podem ser usados para o perfil de metabólitos aniônicos e catiônicos, alternando apenas a polaridade da tensão CE e a polaridade de detecção de MS. Geralmente, as pessoas novas neste método terão dificuldades porque o CE-MS é considerado uma técnica relativamente nova e complicada. Para iniciar este procedimento, coloque um novo cartucho de sílica fundida nua com um emissor de ponta porosa na eletroforese da zona capilar ou instrumento CE.

Aplique um enxágue direto de metanol a 50 psi por 15 minutos com o software que controla o instrumento CE. E verifique visualmente se o líquido está saindo da saída capilar. Em seguida, execute um enxágue na direção oposta a 50 psi por cinco minutos usando o eletrólito de fundo, ou solução BGE, para examinar visualmente se o líquido está saindo do capilar condutor.

Repita a etapa anterior a uma pressão de 100 psi caso não tenha sido observado líquido saindo da saída capilar. Em seguida, enxágue o capilar de separação com água a 50 psi por 10 minutos, seguido de hidróxido de sódio 0.1 molar a 50 psi por 10 minutos, água a 50 psi por 10 minutos e solução de BGE a 50 psi por 10 minutos. Em seguida, remova a ponta do pulverizador do cartucho de sílica fundida do tubo de água e instale-o no adaptador de fonte de nanospray para acoplamento ao instrumento MS.

Certifique-se de que a altura dos frascos de solução BGE no instrumento CE corresponda à altura da ponta do pulverizador. Verifique o fluxo de líquido através do capilar condutor enxaguando com solução BGE a 50 psi por cinco minutos. Durante esta etapa de enxágue, deve-se observar uma gota de líquido na base da ionização por eletrospray, ou agulha do pulverizador ESI.

Após o enxágue, lave o capilar de separação com solução BGE a 50 psi por 10 minutos na direção direta. Uma gota de líquido deve ser observada na ponta do emissor de ponta porosa durante esta etapa. Agora, posicione o emissor de ponta porosa na entrada da entrada do MS a uma distância aproximada de dois a três mm.

Aplique uma tensão de 30 kV usando um tempo de rampa de um minuto e comece a adquirir dados de MS na faixa de massa para carga de 65 a 1000 para estudos de perfil metabólico usando primeiro uma tensão ESI de zero. Defina o volume ESItage para 1000 V enquanto mede os dados. Aumente a tensão ESI com incrementos de 200 V até que um sinal de fundo constante seja observado por pelo menos 15 minutos.

Transfira 20 microlitros de uma mistura padrão de metabólitos aniônicos previamente preparada para um microfrasco vazio de 100 microlitros. Coloque o microfrasco em um frasco CE e coloque o frasco CE na bandeja de entrada de amostras. Inicie um método de modo de íon negativo de aquisição de MS criado anteriormente e, posteriormente, inicie a sequência CE usando o software que controla o instrumento CE.

Em seguida, enxágue o capilar de separação com solução de BGE a 50 psi por três minutos, seguido de injeções a dois psi por 60 segundos e um psi por 10 segundos. Aplique uma tensão de 30 kV com um tempo de rampa de um minuto e uma pressão de 0,5 psi por 30 minutos na entrada. Após uma separação eletroforética de 30 minutos, pare a aquisição de dados MS e diminua a tensão CE para 1 kV usando um tempo de rampa de cinco minutos.

Entre as injeções de amostra, enxágue o capilar de separação com água, hidróxido de sódio 0,1 molar, água e solução de BGE a 30 psi por três minutos. Quando as execuções estiverem concluídas, analise os dados registrados determinando os tempos de migração e a intensidade do sinal da mistura de metabólitos aniônicos analisada. Avaliar se os padrões de metabólitos aniônicos aparecem na região entre 10 e 28 minutos.

Em seguida, verifique se os três isômeros estruturalmente relacionados, D-glicose 1-fosfato, D-glicose 6-fosfato e D-frutose 6-fosfato, estão parcialmente separados. O desempenho de separação do método CE-MS sem bainha para a análise de metabólitos aniônicos altamente polares é demonstrado para três isômeros de fosfato de açúcar estruturalmente relacionados. Embora uma separação de linha de base não tenha sido obtida para esses três analitos, uma separação parcial é suficiente para permitir sua detecção seletiva por MS, pois esses analitos têm a mesma massa exata.

Ao analisar amostras biológicas, com esta metodologia CE-MS sem bainha, é importante verificar regularmente o desempenho analítico ao longo do tempo usando padrões acadêmicos. No geral, a metodologia sem bainha permite o perfil desse tipo de composto em amostras biológicas ultrapequenas, abrindo assim muitas possibilidades para analisar esse tipo de amostra nas áreas de ciências biomédicas, química bioanalítica e áreas de pesquisa externas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como acoplar CE a MS por meio de uma interface porosa sem bainha para o perfil de metabólitos altamente polares e carregados.