Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva, In Vivo Análise Tissue

O objetivo geral deste procedimento é a caracterização funcional do tecido in vivo, combinando informações estruturais de alta resolução com dados espectrais quantitativos. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da biologia do câncer, como quantificar os efeitos da terapia na microestrutura e perfusão do tecido. A principal vantagem dessa técnica é que uma única sonda pode ser usada para coletar dados de imagem e espectroscopia do mesmo local.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer gastrointestinal porque a sonda é compatível com as técnicas convencionais de endoscopia. Geralmente, indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque pequenas irregularidades no posicionamento da sonda podem afetar significativamente a precisão dos dados. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos a importância de combinar uma técnica de imagem de alta resolução com um método de espectroscopia quantitativa.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de preparação são difíceis de aprender devido à complexidade da construção e da calibração. Para começar a montar a modalidade de microscopia de fluorescência de alta resolução do microendoscópio multimodal, monte um espelho dicróico de 470 nanômetros em um cubo de gaiola de 30 milímetros. Prenda as hastes de montagem da gaiola nos lados frontal, direito e esquerdo do cubo da gaiola.

Prenda um anel de retenção sem tensão a uma placa de gaiola rosqueada e aparafuse um tubo de lente no anel de retenção. Prenda outra placa de gaiola ao tubo da lente alinhado com a primeira placa de gaiola. Em seguida, prenda um espelho de alumínio aprimorado com UV em um suporte de espelho de ângulo reto.

Prenda quatro hastes na frente do suporte do espelho e duas hastes na diagonal do lado direito do suporte. Deslize o conjunto do tubo da lente para o lado esquerdo do cubo da gaiola. Conecte o lado direito do conjunto de montagem do espelho ao conjunto do tubo da lente.

Deslize um suporte de translação do eixo Z para o lado direito da montagem. Conecte uma lente objetiva acromática de 10x ao suporte de translação. Em seguida, prenda uma placa adaptadora de fibra a um suporte de lente de translação do eixo XY.

Deslize o suporte no conjunto na frente da lente objetiva. Usando anéis de retenção, prenda um filtro de excitação apropriado e um filtro de emissão nos tubos da lente. Aparafuse o tubo da lente do filtro de excitação na frente do cubo da gaiola.

E o tubo da lente do filtro de emissão na frente do suporte do espelho em ângulo reto. Usando epóxi, conecte um LED de 455 nanômetros à placa da gaiola na frente do filtro de excitação. Deslize uma placa de gaiola na frente de cada tubo de lente de filtro.

Usando um anel de retenção, prenda uma lente de tubo duplo acromática em outro tubo de lente de modo que a seta na parte externa da lente fique voltada para o lado rosqueado externamente do tubo da lente. Prenda a lente do tubo na placa da gaiola esquerda, coloque outra placa da gaiola na frente da lente do tubo. Usando um anel de retenção sem estresse, conecte uma câmera monocromática USB à placa da gaiola.

Para começar a montar a modalidade de espectroscopia de reflexão subdifusa, prenda uma placa de gaiola rosqueada na frente de uma fonte de luz de halogênio de tungstênio com epóxi. Insira quatro hastes de montagem da gaiola na placa da gaiola e deslize um suporte de translação do eixo Z nas hastes. Aparafuse uma lente objetiva acromática de 20x no suporte de translação do eixo Z.

Conecte uma placa adaptadora de fibra a um suporte de translação do eixo XY e deslize o suporte no conjunto na frente da lente objetiva. Por fim, prenda os dois conjuntos a uma mesa óptica próximos usando dispositivos de montagem apropriados. Para começar a construir o dispositivo de comutação de separação do detector de fonte, aparafuse uma placa adaptadora de fibra SMA com rosca externa em um braço de motor de alumínio.

Conecte um adaptador do braço do motor na parte traseira do braço do motor. Em seguida, aparafuse um motor de passo em uma carcaça de alumínio. Rosqueie o conjunto do braço do motor na haste do motor e aperte o parafuso de travamento.

Em seguida, aparafuse três placas adaptadoras de fibra em um interruptor óptico e, em seguida, aparafuse a placa frontal no interruptor óptico. Passe a haste do motor de passo pelo orifício central do interruptor óptico. Coloque um driver de motor de passo na linha central de uma placa vermelha sem grama.

Conecte o driver a uma fonte de alimentação apropriada e ao motor de passo. Prenda o interruptor óptico à mesa óptica. Conecte um cabo de conexão de 550 micrômetros de 0.22 na ao braço do motor.

Conecte a outra extremidade a um espectrômetro USB. Para conectar a sonda de fibra óptica, conecte o cabo central de fibra de imagem de 1 milímetro ao conjunto da modalidade de microscopia de fluorescência de alta resolução. Conecte o cabo multimodo esquerdo de 200 micrômetros ao conjunto da modalidade de espectroscopia de reflexão subdifusa.

Continuando da esquerda, conecte os cabos multimodo restantes aos adaptadores esquerdo, intermediário e direito do dispositivo de comutação óptica. Para iniciar a calibração do experimento, conecte todos os periféricos USB ao computador. Ligue toda a instrumentação e certifique-se de que o halogênio de tungstênio lamp obturador está aberto.

Em seguida, desligue as luzes da sala e feche outras fontes de luz ambiente. Abra o software de aquisição de dados. Deixe o equipamento funcionar por 30 minutos antes de prosseguir com a calibração.

Coloque um padrão de reflexão difusa de 20% na seção inferior do dispositivo de calibração. Insira a sonda de fibra óptica no slot esquerdo do dispositivo e coloque a chave óptica motorizada para a esquerda para selecionar o micrômetro 374 como configuração DS. No software, defina o tempo de integração para 500 milissegundos.

Em seguida, clique em adquirir espectro para iniciar a aquisição de RMAX para este SDS. Quando a aquisição do RMAX estiver concluída, salve o espectro em uma pasta designada. Feche o obturador da lâmpada halógena de tungstênio e adquira o espectro escuro R para este SDS.

Abra o obturador, mova a sonda para o slot direito no dispositivo de calibração e coloque a chave óptica motorizada na posição intermediária para a configuração SDS de 730 micrômetros. Adquira RMAX e RDARK para este SDS para concluir a calibração. Primeiro, determine a área de pele apropriada para a coleta de dados.

Usando um iluminador amarelo como fonte de piranina, manche levemente a área escolhida. Para iniciar a microscopia de fluorescência de alta resolução, ligue o LED de 455 nanômetros e feche o obturador da lâmpada halógena de tungstênio. Coloque a sonda de fibra óptica em contato suave com a pele.

Mova a sonda através do tecido corado com piranina para exibir a arquitetura de insight da corrente apical. No software, defina um tempo de exposição e ganho apropriados para evitar a saturação da imagem. Em seguida, clique em adquirir imagem para obter uma imagem estática.

Mantenha a sonda no lugar para a espectroscopia de refletância subdifusa. Desligue o LED de 455 nanômetros e abra o obturador da lâmpada halógena de tungstênio. Em seguida, mude para a configuração SDS de 374 micrômetros à esquerda.

Clique em adquirir espectros para adquirir o espectro de tecido R para este SDS. Em seguida, mude para a posição intermediária e adquira o espectro de tecido SDS R de 730 micrômetros. Abra o software de pós-processamento e clique em executar.

Quando solicitado, selecione os espectros de calibração, os espectros in vivo e a imagem de fluorescência de alta resolução para obter a imagem do tecido. A modalidade de microscopia de fluorescência de alta resolução fornece uma imagem de alta resolução em foco do local do tecido. A coloração com piranina mostra contornos individuais de queratinócitos.

O software de pós-processamento usa os dados de espectroscopia de refletância subdifusa para calcular a concentração de hemoglobina, a concentração de melanina e a saturação de oxigênio do tecido. Um nevo melanocítico benigno foi comparado ao tecido cutâneo normal vizinho usando este microendoscópio multimodal. O nevo melanocítico apresentou uma concentração de hemoglobina ligeiramente menor e uma concentração de melanina ligeiramente elevada em comparação com o tecido normal.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante deixar a lâmpada halógena de tungstênio aquecer por 15 minutos e calibrar a instrumentação com um padrão de refletância antes da coleta de dados. Após este procedimento, outras técnicas, como microscopia confocal ou microscopia multifotônica, podem ser usadas para explorar mudanças subcelulares na estrutura ou metabolismo da proteína.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a relação entre a perfusão tecidual e a microestrutura em resposta à quimioterapia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir e usar um dispositivo híbrido de imagem e espectroscopia microendoscópica.