Uma nova técnica para gerar e Observing Quimioluminescência em um ambiente Biológica

O objetivo geral deste protocolo é oferecer uma nova técnica de imagem quimioluminescente pré-clínica e interoperatória que possa fornecer benefícios em relação às técnicas ópticas existentes em termos de relações sinal-ruído e limites de detecção. Este método pode ajudar a responder a questões-chave que não foram acessíveis pelas técnicas tradicionais de imagem óptica em muitos campos relacionados às ciências biológicas. As principais vantagens dessa técnica são que ela tem uma alta relação sinal-ruído e não requer luz instantânea nem radiação.

Então, o que descobrimos é que as implicações dessa técnica realmente se estendem à imagem interoperatória de vários estados de doença, incluindo câncer, devido às altas relações sinal-ruído que essa técnica tem a oferecer. Como a luz incidente não é necessária para esta técnica, não há problemas com a absorção de luz incidente. Além disso, há uma grande caixa de ferramentas químicas disponível para funcionalizar a molécula do núcleo quimioluminescente.

Para iniciar o procedimento, prepare 100 microlitros de soluções-padrão de cloreto de tris (bypiridina) rutênio (II) em água de osmose reversa. Em seguida, combine cada padrão com 100 microlitros de uma solução 25 milimolar de nitrato de cério de amônio em água de osmose reversa em uma lâmina de microscópio. Abra o software de imagem do leitor de bioluminescência e clique em inicializar.

No modo de imagem, certifique-se de que luminescente e fotografia estejam marcados e fluorescente desmarcado. Defina o tempo de exposição luminescente, binning, f/stop e parâmetros do filtro de emissão. Defina o tempo de exposição da fotografia, binning e parâmetros f/stop.

Em seguida, defina a altura do assunto de acordo com a amostra a ser fotografada. Defina o campo de view para B para uma distância de 14 centímetros entre a câmera e o estágio de amostra. Cubra o piso da câmara de imagem do leitor de bioluminescência no estágio de amostra com cartolina preta.

Em seguida, coloque a primeira lâmina com a gota da mistura padrão no sample stage com a gota centralizada na mira verde da caixa de luz. Em seguida, encha o borrifador de três onças de um nebulizador personalizado com a solução 1:3 de trietilamina em uma solução 50/50 de água e etanol. Certifique-se de que não haja bolhas de ar no tubo de aspiração.

Coloque o conjunto do nebulizador na câmara de imagem com o bico de pulverização apontado para a gota a ser fotografada sem obstruir a câmera view da gota. Certifique-se de que o interruptor de alimentação do nebulizador e o indicador de energia estejam ligados, a chave seletora magnética esteja desligada e o nebulizador de energia e os cabos remotos não estejam emaranhados. Cubra os pontos quentes, como marcas no slide, com pequenos pedaços de cartolina preta.

Coloque pelo menos 40 centímetros do cabo remoto do nebulizador na câmara de imagem. Feche cuidadosamente a porta da câmara sem apertar os cabos do nebulizador. No software do instrumento, clique em adquirir, ative o salvamento automático e defina o caminho do arquivo de dados.

Inicie a sequência de imagem. Quando o obturador abrir com um clique audível, alterne o botão do nebulizador três vezes para pulverizar três rajadas de solução de trietilamina na amostra. Repita o procedimento com cada lâmina padrão para determinar a concentração mínima detectável do agente de imagem de rutênio.

Para iniciar o procedimento de imagem in vivo, prepare 100 microlitros de uma solução contendo entre 8 e 33 nanomoles de cloreto de tris (bypiridina) rutênio (II) em solução salina tamponada com fosfato. Preparar uma solução aquosa de nitrato de cério e amónio a 25 milimolares. Em seguida, injete por via intravenosa 100 microlitros do agente de imagem de rutênio na veia da cauda de camundongos saudáveis.

Sacrifique os camundongos 10 minutos após a injeção por asfixia com dióxido de carbono. Remova a pele do tronco com um corte em Y e, em seguida, remova o arco costal para expor o coração e os pulmões. Corte uma saída no átrio direito e injete 20 mililitros de PBS através de uma agulha de calibre 24 no ventrículo esquerdo.

Corte a pele da barriga para expor o rim e o fígado. Se o órgão de interesse for o fígado, rim ou baço, faça um corte longitudinal visível no órgão. Prepare uma nova sequência de imagem no software leitor bioluminescente.

Para imagens de abdômen inteiro, coloque o mouse na câmara de imagem com o abdômen aberto voltado para a câmera e a cabeça apontando para a parte de trás do instrumento. Centralize o órgão de interesse na mira da caixa de luz verde. Lave bem o borrifador e o bico do conjunto do nebulizador e, em seguida, encha o frasco com a solução de nitrato de cério de amônio.

Coloque o nebulizador na câmara de imagem com o bico de pulverização direcionado para o local da imagem. Certifique-se de que a câmera esteja desobstruída, os cabos não estejam emaranhados e pelo menos 40 centímetros do cabo remoto estejam na câmara. Feche a câmara e inicie a sequência de imagem.

Quando o obturador abrir com um clique, alterne o botão três vezes para pulverizar três rajadas do agente oxidante no local da imagem. Após a imagem, remova o conjunto do nebulizador e enxágue bem o bico de pulverização para evitar a cristalização do nitrato de cério de amônio. Para imagens e quantificação subsequentes de órgãos individuais, remova o mouse do instrumento e excise os órgãos internos a partir da cavidade corporal aberta.

Corte a pele da perna traseira para extirpar amostras de tecido muscular. Se o órgão de interesse for o fígado, rim ou baço, corte o órgão ao meio longitudinalmente. Em seguida, coloque o órgão em uma placa de Petri ou pedaço de cartolina preta.

Visualize cada órgão da mesma forma que o animal inteiro, enxaguando o bico de pulverização após cada sequência. Neste procedimento, os camundongos foram injetados com um agente de imagem à base de rutênio e o tecido de interesse pulverizado com um oxidante para induzir a quimioluminescência. A concentração mínima detectável do agente de imagem foi determinada em 6,9 picomoles por centímetro quadrado nessas condições.

As imagens de quimioluminescência em luz branca dos órgãos de interesse foram obtidas com um leitor de bioluminescência. O sinal de quimioluminescência foi predominantemente observado nos rins após injeção intravenosa, indicando eliminação renal do cátion tris(bypiridina)rutênio(II) hidrofílico. A relação sinal-ruído do agente de imagem versus PBS sozinho foi de 27:1 nos rins e 21:1 no fígado.

Os linfonodos poplíteos de camundongos também foram avaliados com uma injeção subcutânea de uma solução mais concentrada do agente de imagem à base de rutênio. Os linfonodos contendo o agente de imagem mostraram uma radiância significativamente maior do que os linfonodos contendo PBS sozinho. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de excluir a luz ambiente e evitar a contaminação com rutênio tris bpy. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da imagem biomolecular explorarem estados de doenças como o câncer em camundongos. Embora esse método possa fornecer informações sobre questões que não eram acessíveis pelas técnicas tradicionais de imagem óptica, qualquer questão que possa ser investigada com técnicas tradicionais pode ser abordada com quimioluminescência.