Name: Avaliação ultra-sonografia do fluxo-mediada dilatação das artérias braquial e femoral superficial em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a avaliar a função endotelial vascular em ratos por meio da dilatação mediada por fluxo das artérias braquial e femoral superficial usando ultrassonografia não invasiva. Este método permite medições repetidas sem sacrifício animal.

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Todas as imagens de animais foram realizadas no Small Animal Imaging Core Facility, Universidade de Utah.
Este estudo foi financiado em parte por doações do National Institutes of Health (R21 AG043952, R01 AG040297, K01 AG046326, K02 AG045339 e R01 DK100505).

Todos os procedimentos com animais conformes à Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 14 e foram aprovados pela Universidade de Utah e Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Animal Care e Use. 1. Preparação de animais <ol><li> Coloque o animal na câmara de indução anestésica contendo 3% de isoflurano em 100% de oxigênio. Deixar o animal na câmara de indução até que não responde a estímulos externos. </li><li> Remover o animal da câmara de indução e colocá-lo em uma mesa de exame aquecida equipado com eletrocardiograma (ECG) eletrodos. Manter a anestesia em 3% de isoflurano em 100% de oxigénio. artéria femoral superficial braquial e febre aftosa não podem ser realizadas simultaneamente. Por isso, as instruções de preparação para cada medição estão listados abaixo. </li></ol> 2. Preparação da artéria braquial <ol><li> Posicione o supino animais e conter o membro superior esquerdo e cada membro inferior do umimal para a mesa de exame com fita cirúrgica. </li><li> Restringir o membro superior direito do animal, de modo que a porção inferior do membro superior está ligeiramente elevada (~ 0,2-0,5 cm) acima da plataforma. </li><li> Aplicar agente depilatório (por exemplo, Nair) para membro superior direito do animal para remover o cabelo. </li><li> Posicionar um manguito oclusão (10 mm de diâmetro de lumen oclusor vascular standard) na distal do membro superior direito até o cotovelo. Não descanse o oclusor na plataforma, como a inflação / deflação irá mover o membro e perturbar as imagens de ultra-som. </li><li> Defina a máquina de ultra-som para o modo B utilizando o teclado ultra-som. </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de gel de ultra-som para o membro superior do animal, proximal ao canhão de oclusão. </li><li> alinhar manualmente um transdutor de ultra-alta frequência linear ligado a um suporte estereotáxica com o membro superior. A artéria braquial deve ser visível 2-3 mm de profundidade. </li><li> Para confirmar que a artéria braquial, não a veia braquial, está sendotrabalhada, mude para PW-mode usando o teclado ultra-som. A artéria terá fluxo de sangue pulsátil, em oposição à veia adjacente que terá o fluxo sanguíneo contínuo. </li></ol> 3. femoral superficial Preparação Artéria <ol><li> Posicione o supino animais e restringir os membros superiores e do membro inferior esquerdo para a mesa de exame com fita cirúrgica. </li><li> Restringir o membro inferior direito do animal para uma posição elevada (~ 0,5-1 cm) acima da plataforma usando uma almofada (por exemplo, toalhas de papel dobradas). </li><li> Aplicar agente depilatório (por exemplo, Nair) para a direita do animal membro inferior para remover o cabelo. Após a depilação a veia femoral deve ser claramente visível na parte interna da coxa superior. </li><li> Posicionar um manguito oclusão (10 mm de diâmetro de lumen oclusor vascular standard) proximal ao tornozelo direito. Não descanse o oclusor na plataforma, como a inflação / deflação irá mover o membro inferior e perturbar as imagens de ultra-som. </li><li> Defina a máquina de ultra-som paraB-mode. </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de gel de ultra-som para o membro inferior do animal, proximal ao canhão de oclusão. </li><li> alinhar manualmente um transdutor de ultra-alta frequência linear ligado a um suporte estereotáxico com a veia femoral, o qual é visível através da pele. A artéria femoral superficial deve ser visível &lt;1 mm de profundidade. </li><li> Para confirmar que a artéria femoral superficial, não a veia femoral, está sendo trabalhada, mude para PW-mode. A artéria terá fluxo de sangue pulsátil, em oposição à veia adjacente que terá o fluxo sanguíneo contínuo. </li></ol> 4. Linha de Base Fase <ol><li> Otimizar a imagem em modo B, semelhante à forma como seria feito em humanos 15. Certifique-se que uma imagem horizontal, longitudinal do navio com íntima-média visualizadas em ambas as paredes é observado. Otimizar a imagem, ajustando ligeiramente a colocação de sonda de ultra-som para garantir que o máximo da artéria possível é visível na janela de captura.<ol><li> Alternativamente, ajuste as configurações de ultra-som para obter uma melhor imagem, alterando o brilho / contraste, zonas focais, frequência, faixa dinâmica e densidade de linha. Há outras maneiras de otimizar a imagem de ultra-som, mas descrição detalhada daqueles estão fora do âmbito deste protocolo. </li></ol></li><li> Após a otimização de imagens da artéria, ligue ECG-gating para exibir apenas as imagens capturadas durante a onda R para garantir que apenas um quadro de diâmetro é coletado são durante cada porção diastólica de um ciclo cardíaco. NOTA: ECG-gating está disponível na máquina de ultra-som usado neste protocolo, selecionando ECG-gating sob a opção de configurações fisiológicas, no entanto, esse recurso pode não estar disponível em todas as máquinas de ultra-som. ECG-gating deve ser ligada depois de que a imagem é optimizada, uma vez que é difícil obter uma imagem a taxas de quadro mais baixas (ou seja, uma vez por onda R). Sem ECG-gating, a combinação de um elevado ritmo cardíaco em ratos e a exigência de um elevado quadrotaxa para capturar a parte diastólica do ciclo cardíaco permite apenas ~ 10-20 clipes segundo. O tamanho pesado e quantidade de dados em cada clipe aumenta a carga análise substancialmente. </li><li> A ficha 60 segundos de dados de base usando modo-B. NOTA: A máquina de ultra-sons é sempre a gravação, no entanto, nem todas as imagens são armazenadas na máquina de ultra-sons, como há um limite no número de quadros que podem ser gravadas em um clipe de ultra-som. A duração do clipe (ou seja, número de quadros) pode ser ajustado nas configurações. Sugere-se a ser definido para o número máximo de quadros por clipe. Quando a gravação é no final de um clipe (isto é, o número máximo de quadros atingido), a gravação continua, mas o clipe de rolos para a frente capturar os quadros mais recentes. Neste caso, os quadros anteriores que foram capturados fora do limite máximo do quadro são subsequentemente eliminado. Embora estes meandros na gravação diferem entre máquinas, pode ser necessário o ajuste de tempo de gravação. </li><li> Switch para PW-mode. Colocar o cursor no meio do lúmen. portões de exemplo irá ser automaticamente colocado em referência ao cursor, mas pode ser ajustado para a largura usando o teclado de ultra-som. Manter um ângulo de insonação de ≤ 60 °. <ol><li> Ajustar o ângulo de insonação, alterando o ângulo do feixe de Doppler. Fazer ajustes finos para o ângulo usando o teclado ultra-som. Se nenhuma dessas proporcionar um ângulo apropriado para a medição, ajustar manualmente a sonda de ultra-som através da inclinação da artéria para um ângulo mais ideal. Se é realizado qualquer ajuste do ângulo de ultra-som, recuperar imagens no modo B. </li></ol></li><li> Gravar 10 segundos de dados de velocidade. </li></ol> 5. fase de oclusão <ol><li> Inflar a prótese vascular utilizando uma seringa de 10 ml cheia de ar. Para manter constante a pressão de ar na oclusão vascular, dobrar o tubo e colocar a si própria um grampo da pasta no tubo dobrado. </li><li> Mudar para PW-mode para confirmar a oclusão manguito, como evidenciado pelauma grande redução na velocidade do sangue. </li><li> Mudar para dados em modo B e recordes em 60 clipes segundo, até que 4:45 min de oclusão. </li><li> Mudar para PW-mode. Mantenha um registro de frequência cardíaca e o tempo de cada clipe de ultra-som para análise. </li></ol> 6. Fase hiperêmica <ol><li> Solte a braçadeira durante a gravação em PW-mode, removendo o grampo da pasta a partir do tubo dobrado. Grave 5 segundos antes e 5 segundos após liberação do manguito. </li><li> Mudar para dados em modo B e recordes em 60 clipes segundos até 3 minutos após a oclusão. Mantenha um registro de frequência cardíaca e o tempo de cada clipe de ultra-som para análise. </li><li> Após a conclusão da febre aftosa remover o animal da mesa de exame e monitorar até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li></ol> 7. Análise <ol><li> Para a análise, o ultra-som de exportação como arquivos DICOM a um computador offline equipado com software de detecção de bordas, o que permite imparcial dissuadirminação do diâmetro da artéria em cada quadro. Análise é possível na máquina de ultra-som, no entanto, não é recomendado, porque é extremamente demorada e sujeita a influência do pesquisador. </li><li> Analisar dados diâmetro da artéria em 60 segundos segmentos durante a fase de linha de base e oclusão, e em 10 segundos segmentos durante a fase de hiperemia. </li><li> Analisar dados de velocidade do sangue, utilizando as capacidades de análise de fluxo do software de detecção de borda automatizado. Determinar velocidade do sangue média medindo 5 ou mais formas de onda consecutivos de aparência uniforme durante as fases iniciais e oclusão. Determinar velocidade do sangue média durante a hiperemia reativa para velocidades de sangue imediatamente após a liberação do manguito. A forma de onda com a mais alta velocidade do sangue é considerada velocidade do sangue de pico. </li></ol>

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</ol>

No presente estudo, a medição não invasiva da febre aftosa foi demonstrado no braquial e femoral superficial de ratos. Semelhantes aos seres humanos 6, após um período de oclusão de 5 min, houve um rápido aumento na velocidade do sangue (isto é, hiperemia reactiva) aumentando assim a velocidade de corte na parede arterial que resultou na vasodilatação posterior da artéria. Febre aftosa foi observado em ambos os braquial e femoral superficial. Além disso, houve uma forte relação de febre aftosa entre as artéri...

O endotélio vascular é uma monocamada celular que reveste o lúmen das artérias e é um importante regulador da função vascular. Existem numerosas moléculas libertadas do endotélio que resultam na modulação do diâmetro do vaso sanguíneo. Entre estas moléculas, o óxido nítrico (NO), parece ser a molécula vasodilatadora primário libertado do endotélio vascular em resposta a estímulos (por exemplo, insulina, acetilcolina, ou mudanças na tensão de corte) 1. No endotélio vascular, o NO é produzido pela enzima NO-sintase endotelial (eNOS) e é subsequentemente libertado a partir de células endoteliais 2. NO difunde-se para o músculo liso vascular, onde causa o relaxamento e aumento da embarcação diâmetro 3. A disfunção endotelial pode ser avaliada de forma não invasiva em seres humanos, utilizando a técnica de dilatação 4,5 mediada pelo fluxo (FMD). Febre aftosa foi proposta para representar de um bioensaio funcional para endotélio-derivadoBiodisponibilidade em humanos, e é normalmente avaliado em de artéria braquial ou femoral superficial em resposta à hiperemia reativa na sequência de um ~ 5 min oclusão de membro 6. Hiperemia reativa aumenta forças laminar de cisalhamento que são transduzidas para a célula endotelial 7, sinalizando a liberação de NO 8. Apesar de nos últimos anos, a proporção de vasodilatação iniciado pela libertação de NO foi debatido 9,10, febre aftosa é indicativo de dilatação dependente do endotélio e consistentemente foi demonstrado prevenir eventos cardiovasculares 11-13. Até à data, milhares de estudos têm utilizado a técnica da febre aftosa para medição não invasiva da função endotelial em humanos. Considerando a recente mudança de foco para pesquisa translacional, diretrizes para a medição não invasiva da febre aftosa em roedores seria extremamente valioso. Mantendo-se com uma abordagem translacional, este protocolo foi estabelecido para a medição de febre aftosa em braquial e supeartérias femorais rficial de ratos, como esses sites são mais comumente medida em seres humanos. Este protocolo resulta em uma resposta robusta e reproduzível febre aftosa em ratos, no entanto, a medição da febre aftosa em ratos é tecnicamente exigente e pode ser difícil para outros pesquisadores para replicar sem demonstração em vídeo. Portanto, o seguinte artigo irá demonstrar um método para a medição não invasiva da febre aftosa no braquial e femoral superficial de ratos.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Imagem de Micro-Ultrassom de Alta Resolução Vevo 2100</td><td>VisualSonics, Toronto, ON,</td> CAN <td></td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de Matriz Linear de Ultra-Alta Frequência MicroScan - MS-700 30-70 MHz</td><td>VisualSonics, Toronto, ON, CAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station</td><td>VisualSonics, Toronto, ON, CAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de gel Thermasonic</td><td>Parker Laboratories, Fairfield, NJ, EUA</td><td>82-03</td><td>Creme de</td></tr><tr><td>eletrodo Signacreme</td> opcional <td>Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA</td><td>17-05</td><td></td></tr><tr><td>Fita cirúrgica Transpore</td><td>3M, Maplewood, MN, USA</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório (e.g., Nair)</td><td>Fornecimento</td><td></td><td></td>geral</tr><tr><td>Cotonetes Fornecimento</td><td></td><td></td><td></td>geral</tr><tr><td>Gel de ultrassom</td><td>Fornecimento geral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oclusor vascular padrão, diâmetro do lúmen de 10 mm</td><td>Aparelho Harvard, Holliston, MA, EUA</td><td>62-0115</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml com ponta Luer-Lok</td><td>Fornecimento</td><td></td> Geral <td>Usado para aparelho de manguito de oclusão</td></tr><tr><td>Paperclip</td><td>General Supply</td><td></td><td>Usado para aparelho de manguito de oclusão</td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica &ndash; calibre 18&nbsp;</td><td>Fornecimento</td><td></td> geral <td>Usado para aparelho de manguito de oclusão</td></tr><tr><td>Clipe de fichário médio Fornecimento</td><td></td><td></td> geral <td>Usado para aparelho de manguito de oclusão</td></tr></tbody></table>

avaliação ultra-sonografia do fluxo-mediada dilatação das artérias braquial e femoral superficial em ratos

Ultrasound Assessment of Flow-Mediated Dilation of the Brachial and Superficial Femoral Arteries in Rats

A vasodilatação arterial para aumentos na taxa de cisalhamento da parede é indicativa da função endotelial vascular. Em humanos, a medição não invasiva da função endotelial pode ser alcançada empregando a técnica de dilatação mediada por fluxo, normalmente realizada na artéria braquial ou femoral superficial. Resumidamente, um manguito de pressão arterial colocado distal a uma sonda de ultrassom é inflado a uma pressão suprasistólica, o que resulta em isquemia do membro. Após 5 min de oclusão, o manguito é desinsuflado, resultando em hiperemia reativa e aumento da taxa de cisalhamento da parede que sinaliza a liberação de moléculas vasodilatadoras do endotélio, provocando vasodilatação. Apesar dos milhares de estudos que realizam dilatação mediada por fluxo em humanos, surpreendentemente, nenhum estudo realizou essa técnica de forma não invasiva em ratos vivos. Considerando a recente mudança de foco para a pesquisa translacional, o estabelecimento de diretrizes para medição não invasiva da dilatação mediada por fluxo em ratos e outros roedores seria extremamente valioso. No artigo a seguir, é apresentado um protocolo para a mensuração não invasiva da dilatação fluxo-mediada nas artérias braquial e femoral superficial de ratos, uma vez que esses locais são mais comumente medidos em humanos.

dilatação mediada por fluxo foi realizada no braquial e artéria femoral superficial de 8 ratos Wistar. Posicionamento de um rato é mostrada na Figura 1. Imagens de ultra-sons representativos da artéria femoral superficial são mostrados na Figura 2. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54762/54762fig1.jpg" /> Figur...

avaliação não-invasiva da função endotelial em humanos pode ser determinado pela técnica de dilatação mediada pelo fluxo. Apesar de milhares de estudos têm utilizado esta técnica, nenhum estudo realizado esta técnica não-invasiva em ratos. O seguinte artigo descreve a medição não invasiva de dilatação mediada pelo fluxo no braquial e artérias femorais superficiais de ratos.

Avaliação ultra-sonografia do fluxo-mediada dilatação das artérias braquial e femoral superficial em Ratos

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar de forma não invasiva a função endotelial vascular em ratos vivos por meio da medição da dilatação mediada pelo fluxo nas artérias braquial e femoral superficial. Os métodos descritos permitem a avaliação da função arterial e endotelial sem instrumentação ou sacrifício do animal, possibilitando aos pesquisadores realizar múltiplas medições ao longo do tempo durante uma intervenção em um único rato. Geralmente, indivíduos novos neste protocolo enfrentam dificuldades porque a imagem por ultrassom é desafiadora, mas especialmente em ratos, devido ao tamanho anatômico das artérias.Após anestesiar o animal, posicione-o em posição supina sobre a mesa de exame e aplique pomada oftálmica. Imobilize cada membro superior e cada membro inferior à mesa com fita cirúrgica. Em seguida, use creme depilatório no membro superior direito para expor a pele.No mesmo membro, posicione uma braçadeira padrão de oclusão vascular de 10 milímetros. Mantenha o ocludor fora da plataforma, pois o membro pode se mover e comprometer a imagem quando o ocludor for utilizado. Em seguida, configure o aparelho de ultrassom no modo B.Em seguida, aplique uma pequena quantidade de gel ultrassônico sobre a artéria braquial. Alinhe manualmente um transdutor linear de matriz com frequência ultraelevada, acoplado a um suporte estereotáxico, com o membro superior. A artéria braquial deve ser visível a cerca de três a cinco milímetros de profundidade.Para confirmar que a artéria e não a veia está sendo visualizada, mude para o modo PW. A artéria apresenta um fluxo sanguíneo pulsátil, ao contrário da veia adjacente, que possui um fluxo sanguíneo contínuo. Prepare o animal como antes, mas agora eleve o membro inferior direito.Em seguida, aplique e remova o creme depilatório e observe a veia femoral, que é visível a olho nu. Neste preparo, coloque o manguito de oclusão próximo ao tornozelo direito sem apoiar o manguito sobre a plataforma. Em seguida, configure a máquina de ultrassom no modo B.Aplicar uma pequena quantidade de gel ultrassônico proximal ao manguito de oclusão e alinhar manualmente um transdutor linear de frequência ultraelevada, acoplado a um suporte estereotáxico, com a veia femoral. A artéria femoral superficial deve ser visível a cerca de um a dois milímetros de profundidade. Utilizar o modo PW para confirmar que não se trata da veia femoral.A artéria apresenta um fluxo sanguíneo pulsátil, ao contrário da veia adjacente, que possui um fluxo sanguíneo contínuo. Para otimizar a imagem em modo B, primeiramente assegure-se de observar uma imagem longitudinal horizontal do vaso. Em seguida, faça pequenos ajustes na colocação da sonda de ultrassom para maximizar a visualização da artéria.Outras estratégias padrão de otimização também podem ser utilizadas. Após otimizar a imagem, ative a opção de sincronização com o ECG para que apenas as imagens capturadas durante a onda R sejam exibidas. Em seguida, certifique-se de que apenas um quadro de diâmetro seja coletado durante cada porção diastólica de cada ciclo cardíaco.Sem o sincronismo com o ECG, a combinação de uma frequência cardíaca elevada em ratos e uma alta taxa de quadros para capturar apenas o diâmetro diastólico permite somente clipes de 10 a 20 segundos. O número de clipes e a quantidade de dados aumentam substancialmente a carga de análise. Agora, defina o comprimento da gravação do clipe para o número máximo de quadros por clipe, ou pelo menos 10 a 20 quadros a mais por clipe do que a frequência cardíaca do rato por minuto.Em seguida, registre 60 segundos de dados de linha de base no modo B. Depois, mude para o modo PW. Em seguida, posicione o cursor no centro da luz.Como os intervalos de amostragem serão posicionados automaticamente em relação ao cursor, ajuste a largura utilizando o teclado do ultrassom. Em seguida, ajuste o ângulo de insonação para não mais que 60 graus alterando o ângulo do feixe Doppler e, depois, faça ajustes finos com o teclado do ultrassom. Para mais ajustes, incline a sonda para um ângulo mais ideal.Agora, no modo PW, com o ângulo de insonação corretamente ajustado, defina o tempo de gravação do clipe para 10 segundos e grave 10 segundos de dados de velocidade. Para começar, infle o oclusor vascular utilizando uma seringa de 10 mililitros cheia de ar. Em seguida, dobre o tubo sobre si mesmo e feche o ar com um grampo de papel.No modo PW, confirme a oclusão do manguito. Deve haver uma redução evidente na velocidade sanguínea. Em seguida, mude para o modo B e ajuste o comprimento do clipe para 60 segundos.Registre os dados até que a obstrução esteja em vigor há quatro minutos e 45 segundos. Anote a frequência cardíaca no início e no final de cada registro, bem como o tempo total de cada registro. Após quatro minutos e 45 segundos, mude para o modo PW e grave por cinco segundos.Em seguida, solte o manguito e registre por cinco segundos antes e após a liberação do manguito. Ao alternar entre os modos de ultrassom durante a liberação do manguito, a imagem pode se deslocar, exigindo ajuste imediato da sonda de ultrassom. Praticar a realização desta etapa deve melhorar sua eficiência e confiança nesse procedimento.Agora, retorne ao modo B e grave os dados em clipes de 60 segundos durante três minutos. Após iniciar cada clipe, anote a frequência cardíaca e o horário. Após o teste, retire o animal da mesa de exame e monitore-o até que tenha recuperado consciência suficiente para manter a decúbito esternal.O procedimento descrito foi utilizado para estudar a DMF nas artérias braquial e femoral superficial de oito ratos Lister. A análise mostrou que há uma resposta vasodilatadora semelhante entre as artérias braquial e femoral superficial quando expressa como uma porcentagem de alteração em relação à linha de base. A alteração absoluta em relação à linha de base foi significativamente maior na artéria braquial, o que provavelmente se deveu às diferenças significativas de tamanho entre os vasos.Apesar disso, existe uma forte relação linear entre a FMD da artéria braquial e da artéria femoral superficial quando expressa como uma porcentagem ou mudança absoluta em relação à linha de base. Outras variáveis cardiovasculares também foram medidas durante as fases de linha de base, oclusão e hiperêmica. Após a normalização em relação ao estímulo de cisalhamento, a vasodilatação em resposta à taxa de cisalhamento de pico foi maior na artéria braquial do que na artéria femoral superficial.Isso também foi verdadeiro para a FMD, expressa como uma mudança absoluta em relação à linha de base após a normalização pela taxa de cisalhamento máxima. No entanto, houve uma forte relação linear entre a FMD percentual e absoluta, normalizada pela taxa de cisalhamento máxima. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em 20 a 30 minutos.Ao realizar esta técnica, é importante acompanhar o tempo e manter o mesmo local da imagem. Adaptamos esta técnica de estudos em humanos para ser realizada em ratos. Após seu desenvolvimento em humanos, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da fisiologia cardiovascular explorassem a relação entre a função arterial e endotelial e sua relação com doenças cardiovasculares clínicas.

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Medicine

Medicina

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