Name: Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em Drosophila gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: Aprenda a capturar imagens de gastrulação em Drosophila para estudar construção apical e movimentos celulares em desenvolvimento embrionário. Esta técnica permite analisar dinâmicas celulares em tempo real.

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Este estudo foi apoiado pela Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), Takeda Science Foundation (HT) e MEXT-Supported Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (HT).

NOTA: As moscas transgénicas usadas neste estudo incluem as seguintes: DE-CAD :: GFP 10. 1. Preparação da Apple Placa <ol><li> Prepara-se uma mistura de 12,5 g de agar, 125 mL de 100% disponível comercialmente sumo de maçã, 12,5 g de glucose, e 375 mL de H 2 O. Aquecer a mistura em um forno de microondas e coloque em uma placa de cultura de células a 3 cm. Armazenar a mistura a 4 ° C para uso futuro. </li><li> Depois de preparar o prato de maçã, adicione uma camada fina de pasta de levedura amassado em cima dela para permitir que as moscas colocar ovos. </li></ol> 2. Embrião Elaboração e protocolo Imagens ao vivo <ol><li> Coloque cerca de 50 moscas (25 homens e 25 mulheres) em uma garrafa para acasalar e, posteriormente, põem ovos durante a noite em uma placa de maçã coberta em levedura amassado. Ajuste a placa do sumo de maçã na boca da garrafa. Mantenha o frasco de cabeça para baixo em uma incubadora. Enrole os frascos plásticos Stock Drosophila com folha de alumínio para solicitar the voa para pôr mais ovos. </li><li> Na manhã seguinte, substituir a placa de suco de maçã velha por uma nova. </li><li> Deixe que as moscas depositam ovos para 3 a 4 h envolvendo a garrafa com folha de alumínio. </li><li> Três a quatro horas mais tarde, recolher os embriões em um coador de embrião a partir da placa de suco de maçã com uma escova ou algodão ruim e lavá-los com PBS. Lavar os embriões mais 2 a 3 vezes com PBS, em 12 poços de cultura de pratos. </li><li> Dechorionate os embriões com 50% de branqueador durante 5 min em 12 poços de cultura de pratos. </li><li> Seguindo o processo dechorionation, lavar os embriões mais 2 a 3 vezes com PBS. </li><li> Transferir os embriões para uma placa de cultura de células de 3 cm, que inclua PBS e selecione o estágio 5 embriões sob o microscópio com base no nível de transparência nas suas fronteiras. Pipetar os embriões em estágios usando uma ponteira 200 mL. </li><li> Em seguida, coloque dois embriões selecionados em uma lamela de vidro, e remover o excesso de PBS com papel de tecido fino torcido. Orientar os embriões lado dorsal em cimaa lamela usando um lenço de papel fino torcido. Depois disso, coloque os embriões para a lamela de vidro com graxa de silicone usando uma agulha fina e papel de tecido trançado. </li><li> Adicionar uma pequena gota de óleo de hidrocarbonetos halogenados 700 sobre os embriões e colocar a lamela contendo os embriões de cabeça para baixo sobre a corrediça recuada, deixando um espaço na parte inferior da corrediça. </li><li> Examinar os embriões usando um sistema confocal de imagem, um 488 de laser / Argon, e um objetivo de imersão em óleo (63X). NOTA: A identificação do embrião no estágio de desenvolvimento adequada é importante para capturar imagens do evento gastrulação. Sob essas condições, observar quase todos os embriões se desenvolvem normalmente até, pelo menos, estágio 14. O embrião analisados ​​podem ser cultivadas ainda mais para se desenvolver como um adulto. </li></ol>

<ol><li>Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+half+of+the+Drosophila+E-cadherin+extracellular+region+is+dispensable+for+many+cadherin-dependent+events+but+required+for+ventral+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation.</a> Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).</li>
<li>Oda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+structural+and+functional+diversity+of+cadherin+at+the+adherens+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction.</a> J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).</li>
<li>Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+in+embryonic+development+and+tumor+growth+integrative+cues+through+molecular+to+multicellular+interplay+and+evolutionary+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives.</a> Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+Epithelial+to+mesenchymal+and+back+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).</li>
<li>Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+the+Crossroads+between+EMT+and+Stemness+in+the+Context+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer.</a> J. Clin. Med. 5 (3), (2016).</li>
<li>Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial-mesenchymal+transition+through+epigenetic+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications.</a> Mol. Cancer. 15, (2016).</li>
<li>Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-induced+disruption+of+Nanog+expression+results+in+reduced+proliferation%2C+invasiveness+and+migration%2C+increased+chemosensitivity+and+reversal+of+EMT+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells.</a> Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+is+dispensable+for+metastasis+but+induces+chemoresistance+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer.</a> Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed%2C+efficient%2C+and+versatile+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+genomic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Embora tenhamos relatado anteriormente um procedimento semelhante para capturar imagens ao vivo do processo de gastrulação em Drosophilla1, o método que descrevemos aqui é detalhado e fácil de rastrear a expressão endógena de caderina e, portanto, é bastante útil para a triagem genética dos principais fatores envolvidos na gastrulação. Para maximizar o sucesso com este procedimento de imagem, é essencial usar uma lâmina recuada. A pressão mecânica às vezes causa morte embrionária. Portanto, também é i...

Gastrulação é o primeiro conjunto de eventos morfologicamente dinâmicas que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário de animais multicelulares, tais como Drosophila 1,2. Curiosamente, a evidência emergente sugere que este processo é regulado através da interação entre os mecanismos mecânicos e moleculares 3. Além disso, o epitelial para mesenquimal (EMT), que é um processo crucial para a gastrulação, também está implicado em processos de doenças humanas, tais como metástases de cancro 4-8. Como tal, muitos genes que controlam a constrição apical também são conhecidos por serem factores fundamentais para o EMT observado na metástase do câncer 9. Assim, constrição apical no momento da gastrulação é um excelente modelo para investigar os mecanismos de regulação acima referidas e para aumentar a nossa compreensão da metástase do cancro. A vantagem desta técnica é que podemos observar o movimento celular no momento da gastrulação em tempo real e, por conseguinte, que serácapaz de rastrear os genes envolvidos na gastrulação, bem como metástase do cancro. Embora relativamente desconhecido, adesão célula-célula é pensada para desempenhar um papel central na constrição apical 1. Genética de Drosophila é bem adequado para investigações de células individuais de nível explorando mecanismos moleculares reguladoras. Este modelo vai permitir-nos descobrir a importância da constrição apical durante a gastrulação. Além disso, este método pode ser utilizado para rastrear os genes envolvidos em metástase do cancro. Captura de imagens ao vivo de Drosophila gastrulação permitiu-nos ainda mais para compreender em maior detalhe os mecanismos moleculares que regulam rearranjo de tecidos. Aqui, nós fornecemos uma descrição abrangente de um método simples para alcançar este objectivo.

<table><tbody><tr><td>Óleo de halocarbono 700</td><td>Sigma</td><td>MKBH 5726</td><td></td></tr><tr><td>Graxa a vácuo Silicone</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de vidro&nbsp;</td><td>Matsunami vidro</td><td>Espessura No1</td><td>24 - 36 mm</td></tr><tr><td>Embrião stariner</td><td>Corning</td><td>Corning3477</td><td></td></tr><tr><td>Plástico Drosophilla Stock Garrafas</td><td>Hitec</td><td>MKC-100</td><td></td></tr><tr><td>DE-Caderina knock-in moscas</td><td></td><td></td><td>REF (10)</td></tr></tbody></table>

imagiologia de alteração forma celular e movimento celular em drosophila gastrulação usando reporter de-caderina moscas transgénicas

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulação é o primeiro conjunto de eventos morfologicamente dinâmicas que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário de animais multicelulares, tais como Drosophila. Esta alteração morfológica é também reconhecido como epitelial para mesenquimal (EMT). A desregulação de EMT está associada com fibrose e metástases do cancro. Há uma evidência emergente de que EMT é controlado por um número de mecanismos moleculares. Como tal, muitos genes-chave que controlam a constrição apical também são conhecidos por serem fatores importantes na EMT observado na metástase do câncer. Como EMT durante Drosophila gastrulação, as células epiteliais podem ser induzidas a alterar a sua forma e ser reprogramadas de modo a redireccionar o destino celular no sentido de vários outros tipos de células. Aqui nós fornecemos um método de imagem robusta de Drosophila gastrulação para ensaiar o início de movimentos celulares morfogenéticos e identificação destino celular durante esta fase do desenvolvimento embrionário. Usando este método, identificamos cEll rearranjo no momento da gastrulação e demonstrar a importância de constrição apical durante a gastrulação utilizando GFP marcado DE-caderina.

Aqui, vamos mostrar os eventos gastrulação do embrião Drosophila e uma visão geral do processo de preparação do embrião (Figura 1). As membranas celulares são marcados utilizando DE-caderina :: GFP e imagem ao vivo dos movimentos de células é realizada no momento da gastrulação em Drosophila (Figura 2). Desde moscas DE-caderina GFP permitem visualizar junções de aderência celular, somos capazes de traçar a forma da célula apical e movimentos usa...

Aqui descrevemos um procedimento para capturar imagens ao vivo da gastrulação de Drosophila. Isso nos permitiu entender melhor a constrição apical envolvida no desenvolvimento inicial e analisar melhor os mecanismos que governam os movimentos celulares durante a modificação da estrutura do tecido.

Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em Drosophila gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

O objetivo geral deste procedimento é entender melhor a forma e o movimento celular durante a gastrulação de Drosophila. Aqui fornecemos um método de medição robusto da gastrulação de Drosophila, para testar o início do movimento celular morfogenético, durante este estágio de desenvolvimento embrionário. A principal vantagem desta técnica é que, o rearranjo celular no momento da gastrulação, pode ser identificado juntamente com a constrição apical, durante a gastrulação.Para iniciar o experimento, prepare uma mistura de 375 mililitros de água. 125 mililitros de suco de maçã 100% disponível comercialmente. 12,5 gramas de ágar.12,5 gramas de glicose. Em seguida, aqueça a mistura no micro-ondas, até que o ágar derreta. E despeje em um prato de cultura de células de três centímetros.Armazene a mistura a 4 graus Celsius, para uso futuro. Depois de preparar o prato de maçã, adicione uma fina camada de pasta de fermento amassada por cima, para permitir que as moscas ponham ovos. Coloque 25 moscas machos e 25 fêmeas em uma garrafa em um prato de maçã coberto com fermento amassado.Embrulhe as garrafas plásticas de estoque de Drosophilas com papel alumínio para estimular as moscas a botar mais ovos. Mantenha a garrafa de cabeça para baixo em uma incubadora durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o prato de suco de maçã por um novo.Em seguida, embrulhe a garrafa com papel alumínio e deixe as moscas botarem ovos por três a quatro horas. Depois que as moscas botarem ovos, solte-os do prato com um cotonete. Colete os embriões em uma peneira e lave-os com solução salina tamponada com fosfato, ou PBS.Lave os embriões mais três vezes com PBS, em placas de cultura de 12 poços. Descorionate os embriões com 50% de alvejante, em placas de cultura de 12 poços. Após o processo de descorionação, lave os embriões mais três vezes com PBS.Transfira os embriões para uma placa de cultura de células de três centímetros contendo PBS. E selecione embriões em estágio cinco ao microscópio, com base no nível de transparência em suas bordas. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, colete os embriões estadiados.Em seguida, coloque dois embriões selecionados em uma lamínula de vidro e remova o excesso de PBS com papel de seda. Com um papel de seda finamente torcido, oriente o lado dorsal dos embriões até a lamínula. Em seguida, prenda os embriões à lamínula de vidro com graxa de silicone usando uma agulha fina.Adicione uma pequena gota de óleo de carbono oco 700 nos embriões e coloque a lamínula contendo os embriões de cabeça para baixo na lâmina recuada. Deixando algum espaço na parte inferior do slide. Em seguida, cole a lamínula na corrediça.Finalmente, examine os embriões usando um sistema de imagem confocal, um laser de argônio 488 e uma objetiva de imersão em óleo. Imagens de lapso de tempo foram capturadas de imagens ao vivo, usando DE-caderina GFP do movimento celular ao longo de 500 segundos, para analisar as áreas apicais de células individuais, de Drosophila durante a gastrulação. Aos 500 segundos, a constrição apical e a invaginação são claramente visíveis.Usando nosso método. Podemos entender ainda os mecanismos moleculares da gastrulação de Drosophila, bem como a transição epitelial para mesenquimal, envolvida na metástase do câncer.

imaging-cell-shape-alteration-cell-movement-drosophila-gastrulation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui nós descrevemos um protocolo para analisar a migração de células gliais no olho Drosophila desenvolvimento, utilizando análise microscópica ao vivo emparelhado com GFP tag células gliais.

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Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Aqui apresentamos um protocolo de montagem para...

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Desenvolvimento precoce da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é caracterizada por uma série de alterações nas células forma que são adequados para abordagens de imagem. Este artigo irá descrever as ferramentas básicas e métodos necessários para geração de imagens ao vivo confocal de embriões Drosophila, e incidirá sobre uma mudança a forma da célula chamada celularização.

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Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

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o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

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Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Aqui, um protocolo é apresentado para imagens ao vivo de longo prazo da perna de Drosophila durante o estágio de pupa, envolvendo a remoção completa do pupário. Este protocolo também pode ser aplicado a outros tecidos.

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Aprenda a capturar imagens de gastrulação em Drosophila para estudar construção apical e movimentos celulares em desenvolvimento embrionário. Esta técnica permite analisar dinâmicas celulares em tempo real.

Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em Drosophila gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas (Vídeo) | JoVE Journal

Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em Drosophila gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas

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