Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em Drosophila gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas
29 de dezembro de 2016
Aqui descrevemos um procedimento para capturar imagens ao vivo da gastrulação de Drosophila. Isso nos permitiu entender melhor a constrição apical envolvida no desenvolvimento inicial e analisar melhor os mecanismos que governam os movimentos celulares durante a modificação da estrutura do tecido.
O objetivo geral deste procedimento é entender melhor a forma e o movimento celular durante a gastrulação de Drosophila. Aqui fornecemos um método de medição robusto da gastrulação de Drosophila, para testar o início do movimento celular morfogenético, durante este estágio de desenvolvimento embrionário. A principal vantagem desta técnica é que, o rearranjo celular no momento da gastrulação, pode ser identificado juntamente com a constrição apical, durante a gastrulação.
Para iniciar o experimento, prepare uma mistura de 375 mililitros de água. 125 mililitros de suco de maçã 100% disponível comercialmente. 12,5 gramas de ágar.
12,5 gramas de glicose. Em seguida, aqueça a mistura no micro-ondas, até que o ágar derreta. E despeje em um prato de cultura de células de três centímetros.
Armazene a mistura a 4 graus Celsius, para uso futuro. Depois de preparar o prato de maçã, adicione uma fina camada de pasta de fermento amassada por cima, para permitir que as moscas ponham ovos. Coloque 25 moscas machos e 25 fêmeas em uma garrafa em um prato de maçã coberto com fermento amassado.
Embrulhe as garrafas plásticas de estoque de Drosophilas com papel alumínio para estimular as moscas a botar mais ovos. Mantenha a garrafa de cabeça para baixo em uma incubadora durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o prato de suco de maçã por um novo.
Em seguida, embrulhe a garrafa com papel alumínio e deixe as moscas botarem ovos por três a quatro horas. Depois que as moscas botarem ovos, solte-os do prato com um cotonete. Colete os embriões em uma peneira e lave-os com solução salina tamponada com fosfato, ou PBS.
Lave os embriões mais três vezes com PBS, em placas de cultura de 12 poços. Descorionate os embriões com 50% de alvejante, em placas de cultura de 12 poços. Após o processo de descorionação, lave os embriões mais três vezes com PBS.
Transfira os embriões para uma placa de cultura de células de três centímetros contendo PBS. E selecione embriões em estágio cinco ao microscópio, com base no nível de transparência em suas bordas. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, colete os embriões estadiados.
Em seguida, coloque dois embriões selecionados em uma lamínula de vidro e remova o excesso de PBS com papel de seda. Com um papel de seda finamente torcido, oriente o lado dorsal dos embriões até a lamínula. Em seguida, prenda os embriões à lamínula de vidro com graxa de silicone usando uma agulha fina.
Adicione uma pequena gota de óleo de carbono oco 700 nos embriões e coloque a lamínula contendo os embriões de cabeça para baixo na lâmina recuada. Deixando algum espaço na parte inferior do slide. Em seguida, cole a lamínula na corrediça.
Finalmente, examine os embriões usando um sistema de imagem confocal, um laser de argônio 488 e uma objetiva de imersão em óleo. Imagens de lapso de tempo foram capturadas de imagens ao vivo, usando DE-caderina GFP do movimento celular ao longo de 500 segundos, para analisar as áreas apicais de células individuais, de Drosophila durante a gastrulação. Aos 500 segundos, a constrição apical e a invaginação são claramente visíveis.
Usando nosso método. Podemos entender ainda os mecanismos moleculares da gastrulação de Drosophila, bem como a transição epitelial para mesenquimal, envolvida na metástase do câncer.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um procedimento para capturar imagens vivas da gastrulação de Drosophila, aprimorando nossa compreensão da constrição apical durante o desenvolvimento inicial. A técnica permite uma análise detalhada dos movimentos celulares envolvidos na modificação da estrutura do tecido.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Biologia Celular
Antecedentes
- A gastrulação em Drosophila é uma fase crítica no desenvolvimento embrionário.
- Compreender a forma e o movimento celulares é essencial para entender os processos de desenvolvimento.
- A constrição apical desempenha um papel significativo nos movimentos morfogenéticos.
- Técnicas de imagem em tempo real podem fornecer informações sobre comportamentos celulares dinâmicos.
Objetivo do Estudo
- Melhorar a compreensão dos movimentos celulares durante a gastrulação em Drosophila.
- Desenvolver um método robusto para medir o movimento celular morfogenético.
- Identificar rearranjos celulares e constrição apical durante a gastrulação.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma mistura específica para imagem.
- Imagem em tempo real de embriões de Drosophila durante a gastrulação.
- Análise de movimentos celulares e alterações de forma.
- Identificação de eventos morfogenéticos-chave.
Resultados Principais
- Captura bem-sucedida de imagens vivas da gastrulação de Drosophila.
- Identificação da constrição apical e do rearranjo celular.
- Compreensão aprimorada da dinâmica celular durante o desenvolvimento inicial.
- Metodologia robusta para estudos futuros em biologia do desenvolvimento.
Conclusões
- O procedimento fornece informações valiosas sobre a gastrulação de Drosophila.
- A imagem em tempo real é uma ferramenta poderosa para estudar movimentos celulares.
- Os achados contribuem para a compreensão mais ampla dos processos de desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem em tempo real da alteração da forma celular e do movimento durante a gastrulação de Drosophila fornece uma plataforma robusta para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à transição epitélio-mesenquimal (EMT), um processo implicado na fibrose e na metástase do câncer. Este método permite a visualização em alta resolução da constrição apical e da rearranjo celular, apoiando a confiança preditiva na validação precoce de alvos em vias relacionadas à EMT. A abordagem fortalece a continuidade translacional da biologia do desenvolvimento para estudos mecanicistas relevantes à doença na pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função de genes relacionados à EMT e da dinâmica de vias em um contexto multicelular vivo.
- Apoia a desmistificação biológica por meio da visualização direta de eventos morfogenéticos associados a mecanismos de doenças.
- Facilita a validação funcional de alvos para genes que controlam a constrição apical e as transições de destino celular.
- Oferece confiança preditiva para a priorização de alvos moduladores de EMT em portfólios de oncologia e fibrose.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um sistema de imagem validado para quantificar em tempo real o movimento celular e alterações de forma.
- Permite a medição reprodutível da constrição apical e da reorganização celular como parâmetros quantitativos do ensaio.
- Apoia a padronização de plataformas de triagem fenotípica para compostos que modulam o EMT.
- Prepara sistemas biológicos robustos para fluxos de trabalho de triagem de alto conteúdo em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os processos de EMT no desenvolvimento com modelos relevantes para doenças de metástase e remodelação tecidual.
- Fornece insights mecanicistas que orientam a seleção de biomarcadores translacionais para estudos pré-clínicos.
- Permite o avanço ajustado ao risco de candidatos direcionados ao EMT com base em evidências fenotípicas de células vivas.
- Fortalece a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica em áreas de doenças mediadas por EMT.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de imagem se integra ao continuum de descoberta, desde a fase inicial de testes de hipóteses até o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para alvos relacionados à EMT.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias reguladoras de EMT e morfogenéticos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para forma e movimento celular, permitindo prontidão para ensaios.
- Análises: Fornece dados de imagem de alto conteúdo para análise comparativa de perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta mecanismos de desenvolvimento a modelos de EMT relevantes para doenças, alinhando biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma de imagem reutilizável e adaptável a diversos estudos de EMT e morfogênese.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e a redução de riscos mecanicistas em programas de descoberta direcionados à EMT.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho de imagem padronizados e escaláveis para reprodutibilidade entre projetos.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz riscos biológicos em fases avançadas nas indicações impulsionadas pela EMT.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos moduladores da EMT em diferentes áreas terapêuticas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em imagem viva, microscopia confocal e embriologia de Drosophila.
- Exige acesso a instrumentação avançada de imagem e software analítico para análise de imagens sequenciais no tempo.
- Necessita padronização entre equipes dos estágios embrionários e dos protocolos de imagem para garantir reprodutibilidade.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização das construções repórter e das condições de imagem.
- As limitações práticas incluem restrições na produtividade e a necessidade de manipulação precisa dos embriões.
