Xenopus Oócitos: Métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças Solução em experimentos eletrofisiológicos
31 de dezembro de 2016
Procedimentos otimizados para o isolamento de folículos únicos, microinjeções de RNA citoplasmático, remoção de camadas de células circundantes e expressão de proteínas em oócitos de Xenopus são descritos. Além disso, é apresentado um método simples para mudanças rápidas de solução em experimentos eletrofisiológicos com canais iônicos dependentes de ligantes.
O objetivo geral deste procedimento é expressar novas proteínas, como canais iônicos em oócitos de Xenopus. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave em qualquer campo que exija um sistema de expressão funcional. As principais vantagens das variações dessa técnica são a velocidade, confiabilidade e melhor sobrevida dos oócitos.
Este método pode fornecer informações sobre o funcionamento dos canais iônicos. Além disso, pode ser aplicado ao estudo de qualquer outra proteína. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando percebemos que os métodos clássicos resultavam em uma baixa taxa de sobrevivência de oócitos.
Depois de remover os lóbulos dos ovários das rãs fêmeas de acordo com o protocolo de texto, coloque os lóbulos em solução de Barth modificada estéril suplementada com penicilina e estreptomicina. Corte os lóbulos para permitir o acesso do tecido ao oxigênio. Para destacar os folículos do estágio cinco a seis, use uma pinça para segurar o ovário e, em seguida, abaixe uma alça de platina sobre os folículos e retire suavemente a alça para romper o tecido conjuntivo com o folículo do tecido ovariano.
Separe os oócitos com aparência saudável usando o laço de platina. Use uma pipeta Pasteur de plástico com a ponta cortada em um diâmetro de 1,5 milímetro para transferir folículos selecionados para uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro. Depois de preparar cRNAs para o receptor GABA A e pipetas de microinjeção de acordo com o protocolo de texto, use óleo de parafina e uma seringa de 10 mililitros com uma agulha fina para preencher uma pipeta de microinjeção.
Em seguida, monte a pipeta em um aparelho de microinjeção caseiro. Usando uma pipeta com ponta de plástico estéril, coloque uma gota de solução de mRNA no lado limpo de um pedaço de termoplástico resistente à umidade. Em seguida, mergulhe a ponta da pipeta de injeção na gota e ligue o motor para retrair o êmbolo.
A solução de mRNA deve entrar na pipeta e formar uma interface visível com o óleo. Em seguida, retraia a ponta da pipeta da gota e aplique uma pressão positiva no interior da pipeta de injeção. Uma gota de solução de mRNA deve se formar na ponta da pipeta de injeção.
Usando uma placa de Petri de 60 milímetros com tela de náilon colada no fundo e coberta com MBS para injeção, alinhe os folículos com seus pólos vegetais apontando para cima. Com o micromanipulador, posicione a pipeta de injeção sobre um folículo individual. Insira a agulha de injeção no centro do pólo vegetal e aplique pressão positiva no interior da pipeta para injetar 50 nanolitros de mRNA a uma taxa de fluxo de 0,6 microlitros por minuto.
Aguarde de cinco a 10 segundos antes de remover a ponta da pipeta de injeção do folículo para evitar o escape de RNA mensageiro. Transfira os folículos injetados para uma nova placa de Petri preenchida com dois mililitros de MBS. Coloque o prato em um refrigerador de vinho a 18 graus Celsius.
Incube os folículos injetados por um a sete dias antes da gravação, dependendo da identidade da proteína recém-expressa. Para retirar os folículos, transfira dez folículos injetados para um tubo de vidro de borossilicato contendo 0,5 mililitros de MBS, um miligrama por mililitro de colagenase e 0,1 miligrama por mililitro de inibidor de tripsina. Mergulhe o tubo em banho-maria a 36 graus Celsius e incube os folículos por 20 minutos.
A temperatura aqui é crítica porque um grau a mais pode matar os oócitos. Enxágue os folículos transferindo-os para um segundo tubo contendo um mililitro de MBS em temperatura ambiente e deixe-os no tubo por cerca de dez segundos. Em seguida, transfira os folículos para um terceiro tubo contendo 0,5 mililitros de MBS duplamente concentrado contendo quatro milimolares EGTA e incube as amostras em temperatura ambiente por quatro minutos, ocasionalmente agitando os tubos.
O tempo de incubação de quatro minutos é fundamental para garantir que as camadas foliculares se desprendam do oócito. Enxágue os folículos transferindo-os para outro tubo contendo um mililitro de MBS em temperatura ambiente e deixe-os no tubo por cerca de 10 segundos. Transfira os oócitos para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de MBS.
Em seguida, sob um microscópio estéreo, use um laço de platina para separar os envelopes externos dos folículos, simplesmente empurrando o oócito nu para longe. Armazene os oócitos desnudos até o uso. Neste experimento, oócitos de Xenopus mecanicamente destacados foram microinjetados com revestimento de mRNA para subunidades do receptor GABA A.
Em seguida, as camadas de células foliculares foram removidas. Os oócitos foram clampeados em voltagem a 80 milivolts negativos e expostos a concentrações crescentes de GABA e à presença de THDOC, um potente modulador alostérico positivo do receptor GABA A. Este painel mostra amplitudes de corrente eliciadas dependendo das concentrações de GABA, indicando a sensibilidade dessa combinação de subunidades em relação ao GABA.
A equação utilizada foi I(c)Imax/n)onde c é a concentração de GABA, o EC50 é a concentração de GABA na presença de um THDOC micromolar, provocando uma amplitude de corrente semi-máxima. Imax é a amplitude máxima da corrente. I é a amplitude atual e n é o coeficiente de Hill.
O EC50 do receptor alfa quatro beta dois delta GABA A foi de 0,41 0,12 micromolar e n foi de 0,76 0,04 Uma vez dominadas, as camadas de células foliculares podem ser removidas em meia hora se executadas corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores melhorarem o procedimento de expressão de proteínas em oócitos de Xenopus. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar oócitos de Xenopus cercados por camadas de células foliculares, sua microinjeção com mRNA e subsequente remoção de camadas de células foliculares.
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Visão Geral
Este artigo descreve procedimentos otimizados para o isolamento de folículos individuais e para a realização de microinjeções de RNA citoplasmático em oócitos de Xenopus. Também apresenta um método para mudanças rápidas de solução em experimentos eletrofisiológicos envolvendo canais iônicos ativados por ligantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Eletrfisiologia
Introdução
- Os oócitos de Xenopus são comumente utilizados como um sistema modelo para o estudo da expressão proteica.
- Métodos clássicos frequentemente resultam em baixas taxas de sobrevivência dos oócitos.
- Técnicas aprimoradas podem aumentar a confiabilidade e a velocidade dos experimentos.
- Compreender a função dos canais iônicos é essencial para diversos estudos biológicos.
Objetivo do Estudo
- Expressar novas proteínas, particularmente canais iônicos, em um sistema funcional.
- Fornecer informações sobre o funcionamento de canais iônicos.
- Melhorar as taxas de sobrevivência de ovócitos durante experimentos.
Métodos Utilizados
- Isolamento de folículos individuais de oócitos de Xenopus.
- Microinjeções de RNA no citoplasma.
- Remoção das camadas celulares envolventes.
- Experimentos eletrofisiológicos com mudanças rápidas de solução.
Resultados Principais
- Procedimentos otimizados resultaram em taxas mais altas de sobrevivência de ovócitos.
- Velocidade e confiabilidade aprimoradas na expressão proteica.
- Expressão bem-sucedida de canais iônicos nos ovócitos.
- Compreensão aprimorada da funcionalidade dos canais iônicos.
Conclusões
- Os métodos descritos podem ser aplicados a diversas proteínas além dos canais iônicos.
- Essas técnicas representam um avanço significativo no estudo de sistemas de expressão funcional.
- Pesquisas futuras podem aproveitar esses métodos para responder questões biológicas mais amplas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Otimizado Xenopus protocolos de microinjeção em ovócitos e remoção de células foliculares permitem expressão funcional robusta de canais iônicos e proteínas de membrana, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico&D. O baixo fundo endógeno do canal do sistema e a troca rápida de solução facilitam ensaios eletrofisiológicos quantitativos, aumentando a confiança preditiva na identificação e triagem de compostos líderes. Esses métodos agilizam a transição da hipótese molecular para a leitura funcional, reduzindo a ambiguidade biológica em pontos críticos de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação funcional de canais iônicos e transportadores candidatos em um sistema controlado.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao isolar a atividade específica da proteína do ruído de fundo endógeno.
- Facilita a avaliação quantitativa da farmacologia de receptores ativados por ligantes para validação de alvos.
- Oferece uma plataforma para testes rápidos de hipóteses e triagem de portfólios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Oferece preparação reprodutível e escalonável de ovócitos para ensaios eletrofisiológicos subsequentes.
- Permite medições padronizadas e quantitativas de corrente para triagem de compostos.
- Apóia a prontidão do ensaio para avaliação de alto rendimento de moduladores de canais.
- Permite reutilização da plataforma para diversos alvos de proteínas de membrana.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha leituras funcionais com a farmacologia de canais iônicos relevantes para a doença, quando apropriado.
- Oferece continuidade do descobrimento molecular à validação pré-clínica da função do canal.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados eletrofisiológicos quantitativos.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais para alvos de canais iônicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esses protocolos otimizados de oócitos de Xenopus posicionam a expressão funcional e a análise eletrofisiológica na interface entre a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a pesquisa pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes baseados em hipóteses da função e farmacologia de proteínas de membrana.
- Triagem: Fornece medições quantitativas e reprodutíveis de corrente para avaliação de compostos.
- Análises: Permite o cálculo de EC50, coeficiente de Hill e correntes máximas para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas moleculares a modelos pré-clínicos para alvos de canais iônicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e adaptável para estudos diversos de expressão proteica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Melhora a padronização, reprodutibilidade e produtividade dos ensaios funcionais.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas de canais iônicos e transportadores.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microinjeção, manipulação de ovócitos e registro eletrofisiológico.
- Exige acesso a instrumentação especializada para clamp de voltagem e troca de soluções.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação de ovócitos e ensaios.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes classes de proteínas ou tipos de ligantes.
- Os parâmetros de temperatura e incubação são críticos para a viabilidade dos ovócitos e o sucesso do ensaio.
