Xenopus Oócitos: Métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças Solução em experimentos eletrofisiológicos
December 31st, 2016
Procedimentos otimizados para o isolamento de folículos únicos, microinjeções de RNA citoplasmático, remoção de camadas de células circundantes e expressão de proteínas em oócitos de Xenopus são descritos. Além disso, é apresentado um método simples para mudanças rápidas de solução em experimentos eletrofisiológicos com canais iônicos dependentes de ligantes.
O objetivo geral deste procedimento é expressar novas proteínas, como canais iônicos em oócitos de Xenopus. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave em qualquer campo que exija um sistema de expressão funcional. As principais vantagens das variações dessa técnica são a velocidade, confiabilidade e melhor sobrevida dos oócitos.
Este método pode fornecer informações sobre o funcionamento dos canais iônicos. Além disso, pode ser aplicado ao estudo de qualquer outra proteína. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando percebemos que os métodos clássicos resultavam em uma baixa taxa de sobrevivência de oócitos.
Depois de remover os lóbulos dos ovários das rãs fêmeas de acordo com o protocolo de texto, coloque os lóbulos em solução de Barth modificada estéril suplementada com penicilina e estreptomicina. Corte os lóbulos para permitir o acesso do tecido ao oxigênio. Para destacar os folículos do estágio cinco a seis, use uma pinça para segurar o ovário e, em seguida, abaixe uma alça de platina sobre os folículos e retire suavemente a alça para romper o tecido conjuntivo com o folículo do tecido ovariano.
Separe os oócitos com aparência saudável usando o laço de platina. Use uma pipeta Pasteur de plástico com a ponta cortada em um diâmetro de 1,5 milímetro para transferir folículos selecionados para uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro. Depois de preparar cRNAs para o receptor GABA A e pipetas de microinjeção de acordo com o protocolo de texto, use óleo de parafina e uma seringa de 10 mililitros com uma agulha fina para preencher uma pipeta de microinjeção.
Em seguida, monte a pipeta em um aparelho de microinjeção caseiro. Usando uma pipeta com ponta de plástico estéril, coloque uma gota de solução de mRNA no lado limpo de um pedaço de termoplástico resistente à umidade. Em seguida, mergulhe a ponta da pipeta de injeção na gota e ligue o motor para retrair o êmbolo.
A solução de mRNA deve entrar na pipeta e formar uma interface visível com o óleo. Em seguida, retraia a ponta da pipeta da gota e aplique uma pressão positiva no interior da pipeta de injeção. Uma gota de solução de mRNA deve se formar na ponta da pipeta de injeção.
Usando uma placa de Petri de 60 milímetros com tela de náilon colada no fundo e coberta com MBS para injeção, alinhe os folículos com seus pólos vegetais apontando para cima. Com o micromanipulador, posicione a pipeta de injeção sobre um folículo individual. Insira a agulha de injeção no centro do pólo vegetal e aplique pressão positiva no interior da pipeta para injetar 50 nanolitros de mRNA a uma taxa de fluxo de 0,6 microlitros por minuto.
Aguarde de cinco a 10 segundos antes de remover a ponta da pipeta de injeção do folículo para evitar o escape de RNA mensageiro. Transfira os folículos injetados para uma nova placa de Petri preenchida com dois mililitros de MBS. Coloque o prato em um refrigerador de vinho a 18 graus Celsius.
Incube os folículos injetados por um a sete dias antes da gravação, dependendo da identidade da proteína recém-expressa. Para retirar os folículos, transfira dez folículos injetados para um tubo de vidro de borossilicato contendo 0,5 mililitros de MBS, um miligrama por mililitro de colagenase e 0,1 miligrama por mililitro de inibidor de tripsina. Mergulhe o tubo em banho-maria a 36 graus Celsius e incube os folículos por 20 minutos.
A temperatura aqui é crítica porque um grau a mais pode matar os oócitos. Enxágue os folículos transferindo-os para um segundo tubo contendo um mililitro de MBS em temperatura ambiente e deixe-os no tubo por cerca de dez segundos. Em seguida, transfira os folículos para um terceiro tubo contendo 0,5 mililitros de MBS duplamente concentrado contendo quatro milimolares EGTA e incube as amostras em temperatura ambiente por quatro minutos, ocasionalmente agitando os tubos.
O tempo de incubação de quatro minutos é fundamental para garantir que as camadas foliculares se desprendam do oócito. Enxágue os folículos transferindo-os para outro tubo contendo um mililitro de MBS em temperatura ambiente e deixe-os no tubo por cerca de 10 segundos. Transfira os oócitos para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de MBS.
Em seguida, sob um microscópio estéreo, use um laço de platina para separar os envelopes externos dos folículos, simplesmente empurrando o oócito nu para longe. Armazene os oócitos desnudos até o uso. Neste experimento, oócitos de Xenopus mecanicamente destacados foram microinjetados com revestimento de mRNA para subunidades do receptor GABA A.
Em seguida, as camadas de células foliculares foram removidas. Os oócitos foram clampeados em voltagem a 80 milivolts negativos e expostos a concentrações crescentes de GABA e à presença de THDOC, um potente modulador alostérico positivo do receptor GABA A. Este painel mostra amplitudes de corrente eliciadas dependendo das concentrações de GABA, indicando a sensibilidade dessa combinação de subunidades em relação ao GABA.
A equação utilizada foi I(c)Imax/n)onde c é a concentração de GABA, o EC50 é a concentração de GABA na presença de um THDOC micromolar, provocando uma amplitude de corrente semi-máxima. Imax é a amplitude máxima da corrente. I é a amplitude atual e n é o coeficiente de Hill.
O EC50 do receptor alfa quatro beta dois delta GABA A foi de 0,41 0,12 micromolar e n foi de 0,76 0,04 Uma vez dominadas, as camadas de células foliculares podem ser removidas em meia hora se executadas corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores melhorarem o procedimento de expressão de proteínas em oócitos de Xenopus. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar oócitos de Xenopus cercados por camadas de células foliculares, sua microinjeção com mRNA e subsequente remoção de camadas de células foliculares.
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Visão Geral
Este artigo descreve procedimentos otimizados para isolar folículos únicos e realizar microinjeções de RNA citoplasmático em oócitos de Xenopus. Também apresenta um método para mudanças rápidas de solução em experimentos eletrofisiológicos envolvendo canais iônicos ligados a ligandos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Eletrofisiologia
Fundamentos
- Os oócitos de Xenopus são comumente usados como um sistema modelo para estudar a expressão de proteínas.
- Métodos clássicos frequentemente resultam em baixas taxas de sobrevivência dos oócitos.
- Técnicas aprimoradas podem aumentar a confiabilidade e a velocidade dos experimentos.
- Compreender a função dos canais iônicos é crucial para vários estudos biológicos.
Objetivo do Estudo
- Expressar novas proteínas, particularmente canais iônicos, em um sistema funcional.
- Fornecer insights sobre o funcionamento dos canais iônicos.
- Melhorar as taxas de sobrevivência dos oócitos durante os experimentos.
Métodos Utilizados
- Isolamento de folículos únicos de oócitos de Xenopus.
- Microinjeções de RNA citoplasmático.
- Remoção das camadas celulares circundantes.
- Experimentos eletrofisiológicos com mudanças rápidas de solução.
Principais Resultados
- Procedimentos otimizados resultaram em maiores taxas de sobrevivência dos oócitos.
- Velocidade e confiabilidade aprimoradas na expressão de proteínas.
- Expressão bem-sucedida de canais iônicos nos oócitos.
- Melhoria na compreensão da funcionalidade dos canais iônicos.
Conclusões
- Os métodos descritos podem ser aplicados a várias proteínas além dos canais iônicos.
- Essas técnicas representam um avanço significativo no estudo de sistemas de expressão funcional.
- Pesquisas adicionais podem aproveitar esses métodos para questões biológicas mais amplas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Optimized Xenopus oocyte microinjection and follicular cell removal protocols enable robust functional expression of ion channels and membrane proteins, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The system's low endogenous channel background and rapid solution exchange facilitate quantitative electrophysiological assays, enhancing predictive confidence for lead identification and screening. These methods streamline the transition from molecular hypothesis to functional readout, reducing biological ambiguity at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate ion channels and transporters in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating protein-specific activity from endogenous background.
- Facilitates quantitative assessment of ligand-gated receptor pharmacology for target validation.
- Provides a platform for rapid hypothesis testing and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, scalable preparation of oocytes for downstream electrophysiological assays.
- Enables standardized, quantitative current measurements for compound screening.
- Supports assay readiness for high-throughput evaluation of channel modulators.
- Allows platform reuse for diverse membrane protein targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant ion channel pharmacology when appropriate.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of channel function.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative electrophysiological data.
- Supports translational biomarker development for ion channel targets.
Pipeline & Workflow Integration
These optimized Xenopus oocyte protocols position functional expression and electrophysiological analysis at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of membrane protein function and pharmacology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative current measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables EC50, Hill coefficient, and maximal current calculations for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models for ion channel targets.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse protein expression studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput of functional assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ion channel and transporter programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, oocyte handling, and electrophysiological recording.
- Demands access to specialized instrumentation for voltage clamp and solution exchange.
- Necessitates cross-team standardization of oocyte preparation and assay protocols.
- Adaptation may be needed for different protein classes or ligand types.
- Temperature and incubation parameters are critical for oocyte viability and assay success.
