Name: Xenopus Oócitos: Métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças Solução em experimentos eletrofisiológicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda microinjeção de RNA e remoção de camadas foliculares em oócitos de Xenopus para eletrofisiologia. Este método otimizado melhora a sobrevivência celular e permite expressão funcional de canais iônicos.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa da Swiss National Science Foundation 315230_156929/1. M.C.M. é bolsista (Beca Chile Postdoctorado da CONICYT, Ministerio de Educación, Chile).

Experiências com animais foram aprovados pelo comitê local do cantão de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15). 1. Preparação de Xenopus Os oócitos <ol><li> Manter rãs (Xenopus laevis) em uma de 12 h / 12 h de luz / escuro no ciclo de água, que é estritamente mantida a 20 ° C. </li><li> Retire os lobos dos ovários de rãs do sexo feminino 9. NOTA: A remoção dos lóbulos é um estímulo para a regeneração, e muitas vezes a qualidade dos oócitos melhora com a cirurgia. O oócito é coberto por uma camada vitelino, uma camada de células do folículo, e tecido conjuntivo contendo os vasos sanguíneos 21. Toda a estrutura é denominado o &quot;folículo.&quot; </li><li> Coloque os lobos dos ovários, que são densamente embalado com os folículos contendo os oócitos em estéreis de Barth Saline 7 (MBS) suplementado com penicilina e estreptomicina (NaCl 88 mM, KCl 1 mM, 2,4 mMNaHCO3, MgSO4 0,82 mM, CaCl 0,41 mM de 2, Ca 0,33 mM (NO 3) 2, 10 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazina; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / mL de penicilina, e 100 ug / mL de estreptomicina). </li><li> Single-out fase V-VI 21 folículos. Segurar o lóbulo ovário com uma pinça. Diminuir a ansa de platina (Figura 1) ao longo dos folículos e suavemente retirar o circuito para perturbar o tecido conjuntivo contendo o folículo do tecido do ovário. NOTA: Fase V-VI 21 folículos são caracterizados por seu tamanho (1,0-1,2 mm de diâmetro), e pelo bom contraste entre o hemisfério animais pigmentada escura e do hemisfério vegetal amarelada. </li><li> Transferir apenas folículos saudáveis de aspecto (isto é perfeitamente esféricas e com pigmentação intacta) para uma placa de Petri de diâmetro de 35 milímetros por meio de uma pipeta de Pasteur de plástico (cortar a parte de trás até um diâmetro de 1,5 milímetros de abertura). </li></ol> Nota: O sistema de microinjeção aqui descrito é derivado do que a relatada por Kressmann e Birnstiel 22. <ol><li> Prepare ARNc a partir dos respectivos ADNc que codificam para as subunidades da α 4 β 2 δ receptor GABA A por transcrição in vitro, a adição de um poli (A +) de cauda, e quantificação de ARN por electroforese em gel de 23. </li><li> Prepare pipetas de microinjecção de capilares de vidro de borossilicato (1,0 mm de diâmetro externo (OD), diâmetro interno de 0,58 mm (ID), 100 mm de comprimento) utilizando um extractor de micropipeta. Romper as pontas dos capilares de vidro sob um microscópio usando um micromanipulador e microfilamentos para criar um diâmetro da ponta de 12 - 15 um, com uma ponta chanfrada. </li><li> Backfill as pipetas de microinjeção com óleo de parafina utilizando uma seringa de 10 ml, e depois montar a pipeta de microinjeção para um micr homebuiltoinjection aparelho (Figura 2). NOTA: O aparelho de injecção de óleo hidráulico homebuilt consiste de um motor da grade controlado por um interruptor de pedal. Um interruptor adicional muda o modo de viragem do motor. Este motor acciona um parafuso micrômetro (0,5 mm / volta) que avança ou retrai o êmbolo de uma seringa de vidro de 10 mL. A injecção é a uma velocidade de cerca de 3 rpm e uma volta de 0,5 corresponde a uma injecção de nL 50 em um folículo. A ponta da seringa está ligada ao tubo de politetrafluoretileno de paredes espessas que está ele próprio ligado à agulha de injecção por um período muito curto de tubagem Tygon peça. O capilar de injecção é mantida por um mandril que é controlada por um micromanipulador. O sistema inteiro é preenchido com óleo de parafina. As bolhas de ar devem ser evitados, uma vez que irá prejudicar o sistema de injeção. A configuração é iluminada com uma fonte de luz fria. Um estereomicroscópio é necessário para controlo óptico. Folículos são visualizados sob luz fria com um stereomicroscope (40X). Desempenho da instalação de injecção é testado pela injecção de marcador radioactivo em oócitos de Xenopus. Um volume de 45 - 55 nL deve ser administrada por injecção. </li><li> Com uma pipeta com uma ponta de plástico estéril, testar a configuração, colocando uma gota de água estéril para o interior limpo de um termoplástico resistente à umidade (2 x 2 cm). Imergir a ponta da pipeta de injecção para esta gota, e, em seguida, ligar o motor para retrair o êmbolo (pressão negativa no interior da pipeta de injecção). NOTA: A água deve inserir a pipeta e formam uma interface com o óleo visível. </li><li> Retrair a ponta da pipeta a partir da gotícula e aplicar pressão positiva para o interior da pipeta de injecção. Uma gota de água deve formar-se a ponta da pipeta de injecção. </li><li> Preparar para a injecção dos folículos, alinhando-as com os pólos vegetais que aponta para cima nos interstícios de uma malha de nylon (G: 0,8 mm) coladas à parte inferior de um Peprato de tri (60 mm) coberto com MBS. </li><li> Dispensar 2 mL de mRNA usando uma pipeta com uma ponta de plástico estéril para o interior de um termoplástico limpo. Tome-se o ARNm para a pipeta de injecção por aplicação de pressão negativa para o interior da pipeta de injecção. </li><li> Posicionar a pipeta de injeção mais de um folículo individual usando o micromanipulador. </li><li> Inserir a agulha de injecção no centro do pólo vegetal e injectar 50 nL de ARNm a uma taxa de fluxo de 0,6 mL / min através da aplicação de pressão positiva para o interior da pipeta. Espere 5 - 10 s antes de remover a ponta de injecção pipeta a partir do folículo para evitar mRNA fuga. NOTA: O ARNm deve ser injectado no pólo vegetal (amarelado) para evitar a injecção para dentro do núcleo, que está localizado no hemisfério animal. </li><li> Transferir os folículos injetados para uma nova placa de Petri (35 mm) carregada com 2 mL de MBS. Coloque o prato em um refrigerador de vinho fixada em 18 ° C. Incubar os folículos injetados para 1 -7 d antes da gravação, em função da identidade da proteína expressa recentemente. </li></ol> 3. decapagem dos folículos (Figura 3) NOTA: Como mencionado acima, o oócito coberta por uma camada vitelino, as células do folículo e do tecido conjuntivo, o qual contém os vasos sanguíneos 24, é conhecido como um &quot;folículo.&quot; Todas as camadas, excepto para a camada de vitelina, que proporciona estabilidade mecânica sem impedir o acesso das soluções para a superfície da célula, deve ser removido antes de experiências electrofisiológicas. O folículo, sem as camadas de células circundantes tenha sido previamente denominado um oócito &quot;arruinado&quot; 25. Este passo é normalmente realizada no mesmo dia que as experiências electrofisiológicas. <ol><li> Transferência de dez folículos injectado para um tubo de vidro de borosilicato contendo 0,5 mL de MBS, 1 mg / mL de colagenase, e 0,1 mg / mL de inibidor de tripsina. Mergulha-se o tubo num banho de água mantido a 36 ° C. incubar afolículos durante 20 minutos e agitar os tubos ocasionalmente. </li><li> Lavar os folículos, transferindo-os para um segundo tubo contendo 1 ml de MBS à TA. Deixá-los no tubo durante cerca de 10 s. </li><li> Transferir os folículos com um terceiro tubo contendo 0,5 ml de MBS duplamente concentrada contendo 4 mM de etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetra-acético (EGTA), e incubar durante 4 min a RT. Agitar o tubo de vez em quando. NOTA: A solução hipertónica (MBS duplamente concentrada) é utilizado para induzir a retracção dos oócitos dentro de camadas de células do folículo, destacando-se, assim, as camadas de células foliculares do oócito; EGTA é adicionado para inibir a actividade da colagenase. </li><li> Lavar os folículos, transferindo-os para um segundo tubo contendo 1 ml de MBS à TA. Deixá-los no tubo durante cerca de 10 s. </li><li> Transferir os oócitos para uma placa de Petri (35 mm de diâmetro) contendo 2 mL de MBS. Sob um microscópio estereoscópico, separar os envelopes exteriores dos folículos porbasta apertar o oócito nua distância utilizando o aro de platina. NOTA: Os envelopes exteriores dos oócitos manter firmemente a placa de cultura e podem ser facilmente separados dos oócitos. Alguns ovócitos espontaneamente perder seus envelopes exteriores e será recuperado como oócitos desnudados. Este procedimento resulta em uma preparação relativamente estável, que mantém a aparência esférica dos oócitos. </li></ol> 4. Rápido Solução Mudança em torno do ovócito <ol><li> Realizar um experimento de fixação de voltagem, como descrito 9,26. </li><li> Mudar a solução de perfusão do sistema alimentado por gravidade, rodando os interruptores de perfusão tal como exigido pela experiência. <ol><li> Aplicar a solução de perfusão de 6 ml / min através de um capilar de vidro com um diâmetro interno de 1,35 mm, a boca do qual é colocado cerca de 0,4 mm a partir da superfície do oócito, para permitir trocas rápidas na concentração de agonista em torno do oócito. NOTA: A taxa de variação foi anteriormente estimativad como 70% em menos de 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os métodos descritos neste artigo desviar os utilizados tradicionalmente 7-9. É padrão para expor os lóbulos do ovário para uma 1 a 2 h colagenase tratamento 8; isolar intactas, oócitos desnudados; e injectar-los com mRNA usando dispositivos de injecção comerciais. Este procedimento clássico tem os seguintes inconvenientes: 1) Os oócitos são susceptíveis de ser danificadas pela longa exposição a altas concentrações de colagenase. 2) Os oócitos desnudados instáveis ​​deve ser armazenada até que o ex...

Oócitos de Xenopus são amplamente utilizados como um sistema de expressão (Referências: 2 - 3, e suas referências). Eles são capazes de montar correctamente e incorporar proteínas de múltiplas subunidades funcionalmente activos nas suas membranas plasmáticas. Usando este sistema, é possível investigar funcionalmente proteínas da membrana por si só ou em combinação com outras proteínas, a fim de estudar as propriedades de mutantes, ou proteínas quiméricas concatenados, e para pesquisar potenciais drogas. Vantagens da utilização de oócitos em relação a outros sistemas de expressão heterólogos incluem o manuseamento simples das células gigantes, a elevada proporção de células que expressam a informação genética estrangeira, o controlo simples do ambiente do oócito por meio de perfusão de banho, e o controlo do potencial de membrana . O inconveniente deste sistema de expressão é a variação sazonal observado em muitos laboratórios 17-20. A razão para esta variaçãoestá longe de ser clara. Além disso, a qualidade dos oócitos é frequentemente observado de variar fortemente. Os métodos tradicionais 7-9 incluíram o isolamento de lóbulos de ovário, a exposição dos lóbulos de ovário de colagenase para algumas horas, a selecção de oócitos desnudados, e a microinjecção de oócitos. Aqui, uma série de procedimentos alternativos, rápidos são informou que nos permitiram trabalhar com este sistema de expressão por mais de 30 anos sem variação sazonal e pouca variação na qualidade do oócito. Os métodos melhorados e modificados descritos aqui para o isolamento de oócitos, microinjecção com ARNc, e a remoção de camadas de células foliculares podem ser utilizados para a expressão de qualquer proteína de escolha no oócito de Xenopus. O método muito simples para modificações solução rápida do meio em volta do oócito pode ser aplicada ao estudo de qualquer receptor ionotrópico e dos transportadores.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; g de penicilina/mL e 100 &mu; g estreptomicina/mL</td></tr> Extrator de micropipetas <tr><td>caseiro</td><td></td><td></td>de<td>laço de fio de platina</td></tr><tr><td></td><td>Seringa Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, Tipo 701N</td></tr><tr><td>Tubo de politetrafluoretileno de parede espessa</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>Óleo de parafina</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Rede de nylon, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; tubo de vidro borosilicato Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td>mais rico</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Grau Padrão</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina tipo I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro</td><td>Jencons (Científico) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1,35 ID mm (para perfusão), empresa alternativa: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Capilar de vidro borossilicato</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1,0 OD x&nbsp; 0,58 ID x 100 Comprimento mm (para microinjeção)&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilar de vidro borossilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Comprimento mm (para grampo de tensão de dois eletrodos)</td></tr><tr><td>&gamma;-Ácido aminobutírico (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alpha;,21-Dihydroxy-5&alpha;-pregnan-20-one (THDOC)</td><td>Motor de grelha Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>Micromotor DC Tipo 2230 com engrenagem Tipo 22/2</td></tr><tr><td>micrômetro parafuso</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de plástico estéril</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oócitos: métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças solução em experimentos eletrofisiológicos

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

A oócitos de Xenopus como um sistema de expressão heteróloga de proteínas, foi primeiramente descrito por Gurdon et ai. 1 e tem sido amplamente utilizadas desde a sua descoberta (Referências: 2 - 3, e suas referências). Uma característica que faz com que o oócito atraente para expressão do canal estrangeira é o pobre abundância de canais de iões endógenos 4. Este sistema de expressão tem se mostrado útil para a caracterização de muitas proteínas, entre eles, canais iónicos dependentes de ligandos. A expressão de receptores de GABAA em oócitos de Xenopus e sua caracterização funcional é aqui descrita, incluindo o isolamento de oócitos, micro-injecções com ARNc, a remoção das camadas de células foliculares, e alterações solução rápida em experiências electrofisiológicas. Os procedimentos foram otimizados neste laboratório 5,6 e desviar os utilizados rotineiramente 7-9. Tradicionalmente, os oócitos são desnudados preparadocom um tratamento prolongado colagenase de lóbulos de ovário à TA, e estes são desnudados oócitos microinjectados com ARNm. Usando os métodos optimizados, proteínas de membrana diferentes foram expressos e estudada com este sistema, tais como os receptores recombinantes GABA A, os canais de cloreto 10-12 recombinantes humanos de tripanosomas, 13 canais de potássio 14, e um transportador 15 de mio-inositol, 16. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados para a expressão de qualquer proteína de escolha em oócitos de Xenopus, e a mudança rápida solução pode ser utilizada para estudar outros canais iónicos dependentes de ligandos.

Oócitos de Xenopus foram mecanicamente escolhido usando uma ansa de platina (Figura 1). Os oócitos foram micro-injectados com ARNm que codifica para as subunidades GABA A do receptor a 4, P 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / oócito (Figura 2). Após 4 d, camadas de células foliculares foram removidos (Figura 3). Os oócitos foram voltagem fixada em -80 mV e expostos a concentrações crescentes de...

Procedimentos otimizados para o isolamento de folículos únicos, microinjeções de RNA citoplasmático, remoção de camadas de células circundantes e expressão de proteínas em oócitos de Xenopus são descritos. Além disso, é apresentado um método simples para mudanças rápidas de solução em experimentos eletrofisiológicos com canais iônicos dependentes de ligantes.

Xenopus Oócitos: Métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças Solução em experimentos eletrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

O objetivo geral deste procedimento é expressar novas proteínas, como canais iônicos em oócitos de Xenopus. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave em qualquer campo que exija um sistema de expressão funcional. As principais vantagens das variações dessa técnica são a velocidade, confiabilidade e melhor sobrevida dos oócitos.Este método pode fornecer informações sobre o funcionamento dos canais iônicos. Além disso, pode ser aplicado ao estudo de qualquer outra proteína. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando percebemos que os métodos clássicos resultavam em uma baixa taxa de sobrevivência de oócitos.Depois de remover os lóbulos dos ovários das rãs fêmeas de acordo com o protocolo de texto, coloque os lóbulos em solução de Barth modificada estéril suplementada com penicilina e estreptomicina. Corte os lóbulos para permitir o acesso do tecido ao oxigênio. Para destacar os folículos do estágio cinco a seis, use uma pinça para segurar o ovário e, em seguida, abaixe uma alça de platina sobre os folículos e retire suavemente a alça para romper o tecido conjuntivo com o folículo do tecido ovariano.Separe os oócitos com aparência saudável usando o laço de platina. Use uma pipeta Pasteur de plástico com a ponta cortada em um diâmetro de 1,5 milímetro para transferir folículos selecionados para uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro. Depois de preparar cRNAs para o receptor GABA A e pipetas de microinjeção de acordo com o protocolo de texto, use óleo de parafina e uma seringa de 10 mililitros com uma agulha fina para preencher uma pipeta de microinjeção.Em seguida, monte a pipeta em um aparelho de microinjeção caseiro. Usando uma pipeta com ponta de plástico estéril, coloque uma gota de solução de mRNA no lado limpo de um pedaço de termoplástico resistente à umidade. Em seguida, mergulhe a ponta da pipeta de injeção na gota e ligue o motor para retrair o êmbolo.A solução de mRNA deve entrar na pipeta e formar uma interface visível com o óleo. Em seguida, retraia a ponta da pipeta da gota e aplique uma pressão positiva no interior da pipeta de injeção. Uma gota de solução de mRNA deve se formar na ponta da pipeta de injeção.Usando uma placa de Petri de 60 milímetros com tela de náilon colada no fundo e coberta com MBS para injeção, alinhe os folículos com seus pólos vegetais apontando para cima. Com o micromanipulador, posicione a pipeta de injeção sobre um folículo individual. Insira a agulha de injeção no centro do pólo vegetal e aplique pressão positiva no interior da pipeta para injetar 50 nanolitros de mRNA a uma taxa de fluxo de 0,6 microlitros por minuto.Aguarde de cinco a 10 segundos antes de remover a ponta da pipeta de injeção do folículo para evitar o escape de RNA mensageiro. Transfira os folículos injetados para uma nova placa de Petri preenchida com dois mililitros de MBS. Coloque o prato em um refrigerador de vinho a 18 graus Celsius.Incube os folículos injetados por um a sete dias antes da gravação, dependendo da identidade da proteína recém-expressa. Para retirar os folículos, transfira dez folículos injetados para um tubo de vidro de borossilicato contendo 0,5 mililitros de MBS, um miligrama por mililitro de colagenase e 0,1 miligrama por mililitro de inibidor de tripsina. Mergulhe o tubo em banho-maria a 36 graus Celsius e incube os folículos por 20 minutos.A temperatura aqui é crítica porque um grau a mais pode matar os oócitos. Enxágue os folículos transferindo-os para um segundo tubo contendo um mililitro de MBS em temperatura ambiente e deixe-os no tubo por cerca de dez segundos. Em seguida, transfira os folículos para um terceiro tubo contendo 0,5 mililitros de MBS duplamente concentrado contendo quatro milimolares EGTA e incube as amostras em temperatura ambiente por quatro minutos, ocasionalmente agitando os tubos.O tempo de incubação de quatro minutos é fundamental para garantir que as camadas foliculares se desprendam do oócito. Enxágue os folículos transferindo-os para outro tubo contendo um mililitro de MBS em temperatura ambiente e deixe-os no tubo por cerca de 10 segundos. Transfira os oócitos para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de MBS.Em seguida, sob um microscópio estéreo, use um laço de platina para separar os envelopes externos dos folículos, simplesmente empurrando o oócito nu para longe. Armazene os oócitos desnudos até o uso. Neste experimento, oócitos de Xenopus mecanicamente destacados foram microinjetados com revestimento de mRNA para subunidades do receptor GABA A.Em seguida, as camadas de células foliculares foram removidas. Os oócitos foram clampeados em voltagem a 80 milivolts negativos e expostos a concentrações crescentes de GABA e à presença de THDOC, um potente modulador alostérico positivo do receptor GABA A. Este painel mostra amplitudes de corrente eliciadas dependendo das concentrações de GABA, indicando a sensibilidade dessa combinação de subunidades em relação ao GABA.A equação utilizada foi I(c)Imax/n)onde c é a concentração de GABA, o EC50 é a concentração de GABA na presença de um THDOC micromolar, provocando uma amplitude de corrente semi-máxima. Imax é a amplitude máxima da corrente. I é a amplitude atual e n é o coeficiente de Hill.O EC50 do receptor alfa quatro beta dois delta GABA A foi de 0,41 0,12 micromolar e n foi de 0,76 0,04 Uma vez dominadas, as camadas de células foliculares podem ser removidas em meia hora se executadas corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores melhorarem o procedimento de expressão de proteínas em oócitos de Xenopus. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar oócitos de Xenopus cercados por camadas de células foliculares, sua microinjeção com mRNA e subsequente remoção de camadas de células foliculares.

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