Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise
January 24th, 2017
Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.
O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas que interagem com um cofator nuclear usando a análise LC-MS/MS. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas aos mecanismos transcricionais no campo da regulação gênica. A principal vantagem dessa técnica é que podemos identificar as proteínas que interagem com um cofator nuclear.
Além disso, este método nos permite entender melhor os mecanismos regulatórios transcricionais dos fatores nucleares alvo. Colha células HEK 293 que expressam ARIP4 marcado com bandeira 36 horas após a transvecção, lavando a folha de células com PBS gelado e coletando as células com um raspador de células. Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 8000g por dois minutos a quatro graus Celsius.
Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco vezes o volume do pellet de tampão com alto teor de sal. Gire a mistura por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após 20 minutos de rotação, centrifugue o tubo a 17.700g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, transfira os sobrenadantes para um novo tubo de dois mililitros e adicione tampão de diluição a três vezes o volume do sobrenadante. Efectuar outra cetrifugação e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros. Durante a centrifugação de 10 minutos, lave 50 microlitros de contas anti-bandeira com PBS.
Em seguida, centrifugue o tubo a 2000g por um minuto a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e repita as etapas de lavagem primeiro com cloridrato de glicina 1 molar e depois com um cloridrato de tris molar. Em seguida, lave duas vezes com tampão de sal baixo.
Em seguida, misture 50 microlitros de grânulos lavados com extratos de células inteiras. Gire suavemente a mistura por quatro horas a dois a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma ponta embotada para transferir a amostra para uma coluna de micro centrifugação e deixe a solução escorrer para um tubo de 1,5 mililitro.
Congele o fluxo em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, lave as contas da bandeira com tampão de sal baixo cinco vezes. Para eluir, coloque a coluna em um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 2000g por um minuto para secar as contas.
Tampe a parte inferior da coluna e adicione 50 microlitros de cloridrato de glicina 1 molar. Agite suavemente a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente. Após 10 minutos, coloque a coluna em um novo tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 2000g por um minuto.
Neutralizar a solução eluída com 10 microlitros de cloridrato de tris de um molar e misturar bem pipetando e vórtice. Adicione 50 microlitros de bicarbonato de amônio 100 milimolares. 10 microlitros de acetonitrila, dois microlitros de ditiotreitol e 50 microlitros de amostra neutralizada.
Incube por 30 minutos a 56 graus Celsius. Após a incubação, deixar a amostra à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros de iodoacetamida 333 milimolar à amostra e incube no escuro por 30 minutos a 37 graus C.Adicione 10 microlitros de tripsina à mistura e incube durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, transporte o produto final para uma instalação de LC-MS/MS ou para um laboratório de espectrometria de massa terceirizado para análise. Esta imagem mostra a coloração de prata do epítopo da bandeira marcada com ARIP4 expressa em células HEK 293 após precipitação imune com um anticorpo específico da bandeira e separação por eletroforese. Como controle, uma purificação simulada foi realizada em células HEK 293 que não expressavam proteínas exógenas.
Usando nosso método, é possível identificar cofatores nucleares putativos por meio de seu fator transcricional de interesse e melhorar ainda mais nossa compreensão dos mecanismos regulatórios transcricionais.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para purificar proteínas de interação coreguladora usando análise LC-MS/MS. A técnica visa identificar proteínas interagindo com um cofator nuclear, melhorando nossa compreensão dos mecanismos regulatórios transcricionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Regulação Gênica
Fundamentos
- Entender os mecanismos transcricionais é crucial na regulação gênica.
- Identificar interações de proteínas pode revelar insights sobre processos celulares.
- LC-MS/MS é uma ferramenta poderosa para analisar interações de proteínas.
- Este método se concentra em cofatores nucleares e seus papéis regulatórios.
Propósito do Estudo
- Identificar proteínas interagindo com um cofator nuclear.
- Elucidar mecanismos regulatórios transcricionais.
- Fornecer um método confiável para purificação de proteínas.
Métodos Utilizados
- Colheita de células HEK 293 expressando ARIP4 marcada com flag.
- Lavagem das células com PBS gelado.
- Coleta das células usando um raspador celular.
- Centrifugação das células a 8000g por dois minutos a 4°C.
Principais Resultados
- Identificação bem-sucedida de proteínas interagindo com cofatores nucleares.
- Melhor compreensão dos mecanismos transcricionais.
- Demonstração da eficácia do método LC-MS/MS.
- Potenciais aplicações em pesquisa de regulação gênica.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta valiosa para estudar interações de proteínas.
- Contribui para a compreensão mais ampla da regulação gênica.
- Estudos futuros podem se basear nesta técnica para insights adicionais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
