Name: Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Aprenda a identificar proteínas que interagem com cofatores nucleares usando imunoprecipitação e análise LC-MS/MS em células HEK 293. Este método revela redes de regulação transcricional.

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Este estudo foi apoiado pela Fundação Astellas para Pesquisa em Distúrbios Metabólicos (HT), pela Takeda Science Foundation (HT) e pela Sociedade Japonesa para a Promoção de Bolsas de Ciência para Jovens Cientistas (B) para HT.

1. A transfecção <ol><li> Semente células HEK293 em placas de cultura de 100 mm (2 x 10 6 células / prato). Cultura das células em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 100 ug / ml de estreptomicina, e 100 unidades / ml de penicilina. Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 5% CO 2 e 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, transfectar as células com 10 ug de plasmídeo ARIP4 marcado com FLAG, utilizando 40 ul de reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante 11. </li></ol> 2. Extracção de Proteína <ol><li> Aproximadamente 36 h após a transfecção, lavar as células com PBS gelado e colheita das células utilizando um raspador. Transferir as células em uma mltube 1,5 e centrifuga-se que em 8000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5x o volume da pelota de tampão de KCl 0,4 (tampão de elevado teor de sal: Tris-HCl 20 (pH 8,0), 0,4 M de KCl, MgCl2 5 mM, 10% de glicerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, cocktail inibidor de protease 1x). Girar-se a mistura durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 17.700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante (extracto de célula total) para um novo tubo de 2 mL e adicionar 3x o volume inicial de 0 M de tampão de KCl (tampão de diluição: Tris-HCl 20 (pH 8,0), MgCl2 5 mM, glicerol a 10%, 0,1% de NP-40, 10 mM β-mercaptoetanol, 1x mistura de inibidores de protease). </li><li> Realizar uma outra centrifugação (17700 xg durante 10 min a 4 ° C) e transferir o sobrenadante (extracto de célula total) para um novo tubo de 2 mL. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol><li> Durante a centrifugação (2.4), lavar 50 ul de pérolas de anti-Flag com PBS, glicina-cloridrato de 0,1 M, e em seguida, 1 M de Tris-cloridrato, seguido de lavagem duas vezes com tampão de 0,1 M de KCl (tampão de baixa salinidade: Tris 20 mM HCl (pH 8,0), 0,1 m de KCl, 5 mM de MgCl2, 10% de glicerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptoetanol, 1x mistura de inibidores de protease). A centrifugação durante este processo de lavagem é realizado a 2000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Misturar 50 ul de pérolas de FLAG com os extractos de células completas e rodar suavemente a mistura durante 4 h a 2-4 ° C (1% de extracto de células completas a partir do passo 2.4, também deve ser mantida a -80 ° C para uso futuro como uma entrada). </li><li> Transferir a amostra a uma coluna de rotação Micro (queda de gravidade). Mantenha o flow-through em um tubo de 1,5 ml, congelá-lo usando nitrogênio líquido, e armazená-lo a -80 ° C (verificar os níveis de proteína tanto da entrada e flow-through utilizando análise de Western blot). </li><li> Adicionar 1 ml de tampão 0,1 M KCl (tampão de baixo teor de sal) para lavar as contas Flag (gota gravidade). </li><li> Repetir o passo 3.4, pelo menos, quatro vezes mais (para um total de cinco lavagens). </li></ol> 4. eluição <ol><li> Colocar a coluna em um tubo de 1,5 mL e centrifuga-se que a 2.000 xg durante 1 min; os grânulos irá secar. </li><li> Tapar o fundo doa coluna. </li><li> Adicionar 50 ul (igual ao volume de esferas de FLAG) de M de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5). </li><li> Agitar suavemente a mistura durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Colocar a coluna para um novo tubo de 1,5 mL e centrifuga-se que a 2.000 xg durante 1 min. </li><li> A solução eluída é neutralizada com 10 ul de Tris-HCl 1 M (pH 8,0); misturar bem por pipetagem ou utilizando uma máquina de vórtice. </li></ol> 5. A alquilação e tripsinização <ol><li> Adicionar 50 ul de 100 mM NH 4 HCO 3, 10 ul de CH3CN, e 2 ul de ditiotreitol à mistura (112 ul de volume total). </li><li> Incubar a amostra durante 30 min a 56 ° C. </li><li> Colocar a amostra à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Adicionam-se 10 ul de 333 mM de iodoacetamida à amostra e incubar no escuro durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de tripsina (33 ng / ul) à mistura e incubar durante a noite a 37 ° C. </li></ol><ol><li> Seguindo tripsinização durante a noite, transportar o produto final a uma LC-MS instalação / MS ou a um laboratório de espectrometria de massa de terceiros para análise 12. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
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<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

transfecção eficiente é essencial para obter um resultado bem sucedido com este protocolo. Assim, recomendamos o uso de análise de Western blot para determinar os níveis de proteína FLAG-marcadas imunoprecipitadas. Esta etapa permite que os usuários para verificar se a sua proteína de interesse é adequadamente overexpressed e, além disso, que o IP foi realizada com sucesso. Os níveis de proteína marcada com Flag também deve ser verificado antes da análise por espectrometria de massa. Uma amo...

interacções proteína-proteína desempenham um papel importante em muitas funções biológicas. Como tal, estas interacções têm sido implicados na transdução de sinal; transporte de proteínas através das membranas celulares; metabolismo celular; e vários processos nucleares, incluindo a replicação do ADN, reparação de danos do ADN, a recombinação e a transcrição 1, 2, 3, 4. Identificar as proteínas envolvidas nestas interacções é, portanto, fundamental para o avanço da nossa compreensão destes processos celulares. A imunoprecipitação (IP) é uma técnica validado e utilizado para analisar interacções proteína-proteína. A fim de facilitar a identificação de proteínas co-imunoprecipitada, a espectrometria de massa é frequentemente utilizada 5, 6, 7, 8,9. Ao direccionar um membro conhecido de um complexo de proteína com um anticorpo, é possível isolar o complexo de proteína e, subsequentemente, para identificar os seus componentes desconhecidos através de análise de espectrometria de massa. ARIP4 (proteína-receptor de androgénio interagindo 4), um coregulator transcricional, interage com as proteínas nucleares do receptor, a fim de activar ou reprimir seus promotores-alvo de uma forma dependente do contexto 9, 10. Para melhor compreender os mecanismos reguladores da transcrição que regulam estes factores nucleares, nós descrevemos um método global para purificar e identificar proteínas que interagem ARIP4 usando o sistema de LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamina 2000 Reagente de Transfecção</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel Inibidor de Protease (sem EDTA) (100x)</td> <td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Colunas</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

uma proteína método de preparação para a identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando lc-ms / ms análise

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Os correguladores transcricionais são vitais para a regulação transcricional eficiente da estrutura da cromatina nuclear. Os correguladores desempenham uma variedade de papéis na regulação da transcrição. Isso inclui a interação direta com fatores de transcrição, a modificação covalente de histonas e outras proteínas e a alteração ocasional da conformação da cromatina. Assim, estabelecer métodos relativamente rápidos para identificar proteínas que interagem dentro dessa rede é crucial para melhorar nossa compreensão dos mecanismos regulatórios subjacentes. A identificação de parceiros de ligação a proteínas mediada por LC-MS/MS é uma técnica validada usada para analisar interações proteína-proteína. Ao imunoprecipitar um membro previamente identificado de um complexo proteico com um anticorpo (ocasionalmente com um anticorpo para uma proteína marcada), é possível identificar suas interações proteicas desconhecidas por meio de análise de espectrometria de massa. Aqui, apresentamos um método de preparação de proteínas para a identificação de alto rendimento mediada por LC-MS / MS de interações proteicas envolvendo cofatores nucleares e seus parceiros de ligação. Este método permite uma melhor compreensão dos mecanismos regulatórios transcricionais dos fatores nucleares alvo.

Foram identificados um sinal forte ARIP4, cerca de 160 kDa, bem como aqueles de uma amostra de controlo simulado e várias outras proteínas desconhecidas (Figura 1). A análise por LC-MS / MS identificou ambos os péptidos complexos ARIP4 e os potenciais co-factores peptídicos dentro da fracção de grânulos de bandeira (Tabela 1). p62 (Sequestosome1), um cofactor ARIP4 conhecido foi 11 identificada na análise (Tabela 1),</stro...

Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.

Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas que interagem com um Cofator Nuclear utilizando análise por LC-MS/MS. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave relacionadas aos mecanismos transcricionais na área de regulação gênica. A principal vantagem dessa técnica é que podemos identificar as proteínas que interagem com um cofator nuclear.Além disso, este método permite-nos compreender melhor os mecanismos reguladores transcricionais dos fatores nucleares alvo. Colete as células HEK 293 que expressam ARIP4 com marcação flag 36 horas após a transvecção, lavando a camada celular com PBS frio e coletando as células com um raspador celular. Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro e, em seguida, centrifugue a 8000g durante dois minutos a quatro graus Celsius.Aspire o sobrenatante e re-suspenda o pellet celular em cinco vezes o volume do pellet de Tamp&atilde;o de Alta Salinidade. Incube a mistura sob rota&ccedil;&atilde;o por 20 minutos a quatro graus Celsius. Ap&oacute;s 20 minutos de rota&ccedil;&atilde;o, centrifugue o tubo a 17.700g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, transfira os sobrenadantes para um novo tubo de dois mililitros e adicione tampão de diluição até três vezes o volume do sobrenadante. Realize uma nova centrifugação e, então, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros. Durante a centrifugação de 10 minutos, lave 50 microlitros de microesferas anti-flag com PBS.Em seguida, centrifugue o tubo a 2000g por um minuto a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e repita as etapas de lavagem primeiro com cloreto de glicina 1 molar e depois com cloreto de tris 1 molar. Em seguida, lave duas vezes com o tampão de baixa salinidade.Em seguida, misture 50 microlitros de microesferas lavadas com extratos de células inteiras. Incube a mistura em rotação suave por quatro horas a dois a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma ponta rombuda para transferir a amostra para uma coluna de microfiltração e permita que a solução escorra para um tubo de 1,5 mililitro.Congele rapidamente o fluxo passante em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius. Em seguida, lave as microesferas com anticorpo anti-FLAG com o tampão de baixa salinidade cinco vezes. Para a eluição, coloque a coluna em um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 2000g por um minuto para secar as microesferas.Tampe a parte inferior da coluna e, em seguida, adicione 50 microlitros de cloreto de glicina 1 molar. Agite suavemente a mistura por 10 minutos à temperatura ambiente. Após 10 minutos, coloque a coluna em um novo tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 2000g por um minuto.Neutralize a solução eluída com 10 microlitros de cloreto de tris um molar e misture bem por pipetagem e vortex. Adicione 50 microlitros de bicarbonato de amônio 100 milimolar. 10 microlitros de acetonitrila, dois microlitros de ditiotreitol e 50 microlitros da amostra neutralizada.Incube por 30 minutos a 56 graus Celsius. Após a incubação, deixe a amostra em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros de iodoacetamida 333 milimolar à amostra e incube no escuro por 30 minutos a 37 graus C. Adicione 10 microlitros de tripsina à mistura e incube durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, transporte o produto final para uma instalação de CL-EM/EM ou para um laboratório terceirizado de espectrometria de massas para análise. Esta imagem mostra a coloração com prata de ARIP4 marcado com epítopo flag expresso em células HEK 293 após imunoprecipitação com um anticorpo específico para flag e separação por eletroforese. Como controle, realizou-se uma purificação simulada em células HEK 293 que não expressavam proteínas exógenas.Utilizando nosso método, é possível identificar cofatores nucleares putativos por meio de seu fator de transcrição de interesse e aprofundar ainda mais a compreensão dos mecanismos regulatórios da transcrição.

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