Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

O objetivo geral deste protocolo é isolar populações celulares específicas de células estromais derivadas de tecido adiposo e testar sua atividade osteogênica utilizando um ensaio in vivo. O método pode ser usado para responder perguntas fundamentais na área da biologia regenerativa craniofacial, como, por exemplo, como as células-tronco derivadas de tecido adiposo podem ser utilizadas para criar tecido ósseo plenamente funcional em defeitos ósseos danificados. A principal vantagem desta técnica é que as células são rapidamente isoladas de tecido humano fresco, evitando assim que passem tempo em cultura celular, o que é sabido alterar a expressão de genes e de marcadores celulares.

As implicações desta técnica estendem-se a pacientes que apresentam grandes defeitos ósseos, causados por câncer, trauma ou infecção. No futuro, poderá ser possível isolar populações celulares de ASCs e utilizá-las de maneira regenerativa. A demonstração visual desta técnica é fundamental, pois a criação do defeito calvarial é difícil de aprender, principalmente porque o defeito é feito em um crânio com formato abobadado e porque está muito próximo à dura-máter.

Para este protocolo, obtenha gordura subcutânea abdominal, lateral ou da coxa coletada de um doador humano saudável e armazenada em um coletor plástico a vácuo. Adicione ao tecido adiposo um volume igual de PBS estéril e misture com agitação suave durante 30 segundos. Deixe a camada aquosa decantar e, em seguida, remova-a utilizando uma pipeta plástica de 10 mililitros.

Em seguida, decante a gordura para um recipiente plástico grande e adicione um volume igual da mistura de digestão. Limpe o recipiente fechado da gordura com etanol 70%, e feche-o com parafina. Em seguida, agite o recipiente a 180 rotações por minuto, em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, neutralize a digestão duplicando o volume da reação com meio padrão. Centrifugue as células, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 5 mililitros de meio padrão. Depois, passe todas as suspensões através de um filtro de 100 microns para um tubo cônico de 50 mililitros.

Centrifugue o filtrado a quatro graus Celsius por 15 minutos a 300 G. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de eritrócitos à temperatura ambiente. Após a formação da suspensão, deixe por cinco minutos em lise à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue o tubo à temperatura ambiente por 15 minutos e finalize os passos de separação conforme o protocolo descrito no texto.

A classificação celular adequada é essencial para este protocolo. Primeiro, re-suspenda as células em tampão FACS a um milhão de células por 100 microlitros e mantenha-as no gelo. Em seguida, transfira pelo menos 10 milhões de células para um tubo plástico de centrífuga no gelo, identificado como BMPR-1B.

Transfira um milhão de células para um tubo sobre gelo rotulado como não corado e adicione um mililitro de tampão FACS. Rotule as células restantes como não classificadas. Em seguida, adicione o anticorpo ao tubo BMPR-1B e misture com pipetagem suave para homogeneizar.

Deixe esta mistura incubando pelo tempo recomendado pelo fabricante. Em seguida, centrifugue as células para triagem por FACS e ressuspenda-as cuidadosamente em um mililitro de tampão FACS. Depois, repita o procedimento e ressuspenda as células a um milhão de células por mililitro.

Agora, passe as três populações celulares através de filtros celulares de 40 micrômetros para tubos de FACS de vidro. Use 500 microlitros de tampão FACS para remover as últimas células dos filtros. Em seguida, prepare dois frascos de coleta, para as populações positivas e negativas para o anticorpo.

Carregue cada um com dois mililitros de meio padrão de cultura celular, na máquina de FACS, execute primeiro as células não coradas e use os resultados para definir um gate negativo para o marcador fluorescente. Em seguida, utilizando um bico de 100 microns, separe as células coradas para os respectivos tubos contendo meio padrão. Se possível, mantenha esses tubos refrigerados a quatro graus Celsius durante a separação.

Prossiga carregando as células na estrutura conforme descrito no protocolo textual. Após anestesiar o animal, corte os pelos da área cirúrgica e limpe a pele exposta com solução de iodopovidona seguida de etanol 70%, três vezes. Em seguida, cubra o animal com campo cirúrgico, deixando a área cirúrgica exposta.

Agora, utilizando uma lâmina de bisturi 15, faça uma incisão sagital mediana que se estenda pela maior parte do crânio dorsal. Em seguida, com pinça de dentes finos, retrai a pele no lado direito da incisão para expor o osso parietal direito. Prepare a broca com uma ponteira de broca trepanadora esterilizada de quatro milímetros revestida com diamante.

Em seguida, faça um defeito através do osso parietal, mas não estenda o defeito além do osso, mantendo a camada da dura-máter intacta. Agora, coloque um suporte contendo células ou solução controle no defeito e feche a incisão cutânea com ponto contínuo de náilon. Em seguida, prossiga com os protocolos de cuidados pós-operatórios com o camundongo conforme indicado no protocolo textual.

Escaneamentos de micro-TC do defeito no crânio realizados no dia da cirurgia mostram claramente o novo defeito. Escaneamentos repetidos em pontos temporais posteriores mostram que os defeitos semeados com células positivas para BMPR-1B fecham mais rapidamente do que aqueles com células negativas para BMPR-1B ou células não classificadas. Quando a cicatrização é quantificada como uma porcentagem de fechamento completo da ferida, a diferença é facilmente apreciada.

Em seguida, porções dos crânios contendo os defeitos foram descalcificadas e coradas para identificar o novo osso regenerado e o controle de regeneração óssea utilizando a pentacroma de Movat, que distingue a cartilagem do osso e todos os estágios de maturação intermediários. Em comparação com células não classificadas, as células positivas para BMPR-1B tiveram um forte impacto no processo regenerativo, mais notável nas bordas do defeito. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão do potencial clínico que este experimento oferece, ao isolar ASCs específicas do paciente e utilizá-las para curar defeitos ósseos.

Muitos experimentos posteriores podem ser realizados a partir deste para responder ainda mais perguntas sobre a cicatrização óssea, como a utilização de FACS para o isolamento de ASCs com diferentes compromissos de linhagem, microtomografia computadorizada para analisar como diferentes tipos celulares e tecidos cicatrizam ao longo do tempo, e o modelo de defeito craniano neste experimento para gerar ideias para novos experimentos de cicatrização óssea. Não se esqueça de que o trabalho com tecido humano pode ser extremamente perigoso. Certifique-se de tomar as precauções adequadas, incluindo o uso de luvas, proteção ocular e a correta disposição de todos os resíduos perigosos.