Name: Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda o isolamento rápido de células estromais adiposas com potencial osteogênico para biologia regenerativa craniofacial. Este método permite avaliar a atividade óssea in vivo em defeitos calvários.

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C.D.M. foi apoiado pela Bolsa de Pesquisa Residente do American College of Surgeons (ACS). M.S.H. foi apoiado pela bolsa de treinamento Clinical Fellow do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) TG2-01159. M.S.H., H.P.L. e M.T.L. foram apoiados pelo Prêmio de Bolsa de Pesquisa da Sociedade Americana de Cirurgiões Maxilofaciais (ASMS)/Fundação de Cirurgiões Maxilofaciais (MSF). H.P.L. foi apoiado pela concessão do NIH R01 GM087609 e um presente de Ingrid Lai e Bill Shu em homenagem a Anthony Shu. H.P.L. e M.T.L. foram apoiados pelo Laboratório Hagey de Medicina Regenerativa Pediátrica e pela Fundação Oak. MTL foi apoiado pelas bolsas do NIH U01 HL099776, R01 DE021683-01 e RC2 DE020771. DCW foi apoiado pela concessão do NIH 1K08DE024269, o Laboratório Hagey de Medicina Regenerativa Pediátrica e o Prêmio Acadêmico do Corpo Docente do Instituto de Pesquisa em Saúde Infantil da Universidade de Stanford.

NOTA: As amostras foram obtidas de pacientes que deram consentimento informado. Todos os protocolos foram revistos e aprovados pela Universidade de Stanford Institutional Review Board apropriado. Ao manusear tecidos e células humanos, sempre aderir ao Nível de Biossegurança 2 (BSL2) precauções, conforme especificado pela sua instituição. 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Preparar tampão de FACS: adicionar 10 ml de FBS, 5 ml de poloxâmero 188 e 5 mL de Pen-Strep a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). </li><li> Prepare digerir mistura: Adicionar 0,375 g C. hemolyticum colagenase tipo II em pó e 5 mL Poloxamer 188 a 500 ml de meio / EBSS estéril 199. </li><li> Prepare meio padrão: adicionar 50 ml de FBS e 5 mL Pen-Strep a de 500 mL Dulbecco Modified Eagle Medium. </li></ol> 2. A colheita e isolamento de ASC NOTA: Certifique-se de que as aprovações institucionais adequados estão em vigor para a utilização de tecidos humanos e para isolar hcélulas estaminais uman. Obter abdominal humana, flanco ou coxa gordura subcutânea de um doador saudável passando por lipoaspiração eletiva. Manter a gordura em uma vasilha de sucção de plástico. <ol><li> Adicionar PBS estéril numa proporção de 1: 1 para a gordura no recipiente de plástico original. (Se houver 500 mL de gordura, adicionar 500 mL de PBS). Misturar por agitação suave durante 30 s. Permitir que a camada aquosa para se depositar no fundo (figura 1) e, em seguida, aspirado e descartar a camada aquosa com uma pipeta de 10 ml de plástico ligado à sucção. </li><li> Decantar a gordura em um grande recipiente de plástico e adicionar digerir mistura na proporção de 1: 1. Fechar o recipiente e limpar o exterior com 70% de etanol. Selar a tampa com película de parafina. </li><li> Agita-se este recipiente num agitador orbital a 180 rpm a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Neutraliza-se a digestão por adição de meio padrão numa razão de 1: 1. (Se não houver 1.000 ml de uma mistura de gordura, adicione 1,000 mL meio padrão). </li><li> Distribua a mistura igualmente em um número par de 250 ml de tubos de centrífuga de plástico de centrífuga cónico e a mistura a 300 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ter o cuidado de deixar o pellet intacto. pelotas ressuspender em 5 mL meio padrão para cada tubo cônico. </li><li> Filtra-se a suspensão através de um filtro de 100 microns para um tubo cónico de 50 ml de centrífuga. Em seguida, centrifugar a 300 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 mL de tampão de lise temperatura ambiente RBC. Deixar a mistura em repouso durante 5 min à temperatura ambiente e depois centrifugar a 300 xg durante 15 min à temperatura ambiente (RT). </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 mL de meio padrão. Novamente filtrar através de um filtro de 100 microns para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml. </li><li> Em uma nova mL cônico de 50, adicionar 15 solução polissacarose mL concebido para a separação à base de densidade (ver lista de reagentes). Em seguida, segurando o tubo com um ângulo de 45 °, pipetagem cuidadosa das células para o lado deo tubo de modo que a suspensão de células suavemente camadas no topo da solução polissacarose (Figura 2). NOTA: É importante a células de pipeta sobre a superfície da solução. Não adicionar solução polissacarose a uma suspensão de células como isso vai criar uma mistura irreversível. Da mesma forma, não pipetar as células para o centro da solução polissacarose. </li><li> Centrifugar esta mistura a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Use baixa aceleração (2-3 de 10) e definir a função de freio da centrífuga a zero para esta etapa. NOTA: Três camadas será visível: transparente na parte inferior, nublado no meio e no topo de cor salmão. A camada intermédia contém as células de interesse. </li><li> Usando uma pipeta de 10 retire cuidadosamente a camada média e transferir para um novo tubo cônico de 50 mL. NOTA: É melhor transferir completamente a camada do meio e no processo de tomar algumas das camadas superior e inferior do que deixar para trás um pouco da camada média. </li> &lt;li&gt; Contar as células usando um hemocitômetro e determinar o número de células vivas total. NOTA: De modo geral, utilizar azul de tripano adicionado à mistura de células para uma concentração final de 0,8% para auxiliar na contagem de células. células vivas viáveis ​​não vai ocupar o corante azul e aparecerá branco. </li></ol> 3. FACS de classificação para BMPR-IB Células positivas e preparação de andaimes contendo células <ol><li> Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em tampão de SCAF, a uma concentração de 1 milhão de células por 100 uL (com base na contagem de células feito no passo 2.13). </li><li> Transferir, pelo menos, 10 milhões de células para um tubo de centrífuga de plástico rotulados &quot;BMPR-IB.&quot; Separadamente, a transferência de um milhão de células em 100 ul de tampão de FACS para um tubo de centrífuga de plástico separada marcado &quot;não corado.&quot; Adicionar 1 mL de tampão de FACS para o tubo &quot;não corado&quot;. Manter o restante das células em tampão de SCAF em gelo enquanto as triagem FACS porção do experiment está sendo feito. Rotular essas células &quot;não separados.&quot; Utilizá-los como controlos no final do experimento. </li><li> Adicionar uma quantidade apropriada de um anticorpo de BMPR-IB anti-humano fluorescente para o tubo &quot;BMPR-IB&quot; de acordo com as instruções do fabricante. Pipetar a mistura para cima e para baixo suavemente para distribuir o anticorpo. NOTA: Nós usamos um Humano BMPR-IB / ALK-6 Antibody APC-conjugado a uma diluição de 1:10 (ver lista de reagentes para detalhes). No entanto, os anticorpos de diferentes fabricantes terão diferentes concentrações recomendadas. </li><li> Cubra o balde de gelo de uma forma que impede a entrada de luz. Permitir que a mistura de células / anticorpo para sentar-se durante 30 min (ou de acordo com as instruções do fabricante do anticorpo). NOTA: Se o anticorpo anti-BMPR-IB vem como um anticorpo não conjugado primária que requer um anticorpo secundário, realizar um passo separado de coloração em gelo com o anticorpo secundário de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Centrifugar ambos os tubos a300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não aspirar o sedimento. Ressuspender as células peletizadas em 1 mL de tampão de FACS. Mais uma vez, centrifugar os tubos a 300 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de SCAF até uma concentração de 1 milhão de células por 1 ml. </li><li> Filtra-se a &quot;BMPR-IB,&quot; &quot;não corado,&quot; e &quot;células&quot; não separados através de filtros de 40 micron de células para novos tubos de vidro marcados FACS. Lavar os filtros com 500 ul de tampão de FACS para assegurar que as células não são deixadas para trás no filtro. Além disso, adicione 2 mL meio padrão para dois tubos de centrífuga de plástico separados rotulados como &quot;BMPR-IB-positivo&quot; e &quot;BMPR-IB-negativo.&quot; Use estes dois para recolher as células classificadas na máquina de FACS. </li><li> Na máquina de FACS, as células não coradas utilizar para definir uma porta negativa para o marcador fluorescente. </li><li> Utilizando um bico de 100 micra, de classificação BMPR-IB células positivas e negativas para os respectivos tubos contenção meio padrão. Manter estes tubos refrigerados a 4 ° C durante a classificação, se a máquina FACS tem essa capacidade. NOTA: Por favor, consulte o artigo JOVE 13 por Sharon et al. para um protocolo excelente para separação por FACS. </li><li> Usando um hemocitómetro, contar as células de cada tubo. Centrifuga-se o &quot;BMPR-IB-positiva&quot;, &quot;BMPR-IB-negativo&quot; e &quot;tubos&quot; não separados a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento celular. Em seguida, voltar a suspender as células em meio padrão a uma concentração de 1 milhão de células por 250 uL. </li><li> Obter suportes revestidos com hidroxiapatite pré-cortadas quatro milímetros de PLGA (poli [ácido láctico-co-glicólico]). Colocar cada andaime em um poço de uma placa de 24 poços. Cobrir cada andaime com 50 ul de suspensão de células a partir de um dos três grupos de (i .e, 200.000 células.): Não separados, BMPR-IB-positiva, e BMPR-IB-negativa (Figura 3). NOTA: Por favor,consulte o artigo JOVE 14 por Lo et al. para obter detalhes sobre a construção de andaimes de PLGA. </li><li> Parcialmente encher os vazios circundantes poços com meio padrão (para prevenir a dessecação dos andaimes), cobrir a placa com a tampa, e incubar numa incubadora de cultura de células a 37 ° C durante 30 min. </li></ol> 4. Criação de defeitos na calota craniana e Aplicação do ACS contendo andaime NOTA: Certifique-se de que as aprovações institucionais adequados estão no lugar para a criação de defeitos na calota craniana em ratos vivos. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade de Stanford. <ol><li> Anestesiar um rato nu CD-1 utilizando o gás isoflurano inalado ou um cocktail anestésico de ação longa injetado. <ol><li> Para utilizar o gás sozinho, colocar o rato numa câmara de anestesia e iniciar o fluxo de oxigénio a 2 - 3 L / min, com uma concentração de 2% de isoflurano. Uma vez que o mouse é fully inconsciente, coloque-o de bruços sobre um cobertor com recirculação de água quente com uma almofada absorvente e coloque seu focinho em um cone de nariz anestesia com a mesma concentração de oxigênio e isoflurano. acompanhar atentamente a frequência respiratória e ajustar a concentração de isoflurano, conforme necessário. </li><li> Para usar um cocktail anestésico de longa acção injectado, anestesiar o rato numa câmara de anestesia, como descrito acima e, em seguida, injectar o cocktail de anestésico. Remover o rato da câmara de anestesia e observar seu comportamento. NOTA: O rato pode rapidamente sair da anestesia, mas dentro de vários minutos, deve ser novamente completamente anestesiados sob o efeito da anestesia injectado. Transferir o mouse para um cobertor quente recirculação de água coberto com uma almofada absorvente. NOTA: Para um cocktail anestésico, recomenda-se uma mistura contendo cetamina 10 mg / ml de xilazina e 1 mg / ml em solução salina normal, entregue intraperitonealmente. A dose padrão de esta mistura é300 mL para um rato de 30 g, o que equivale à cetamina 100 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg. Consulte a seção de discussão para obter mais detalhes sobre o anestésico injetável. </li><li> Utilizar um dedo do pé pitada manobra para determinar a profundidade de anestesia. Um rato adequadamente anestesiados não se retrai a pata quando é levemente comprimida pelo cirurgião. </li><li> Aplicar pomada para evitar a dessecação da córnea. </li><li> Administrar 1 mg / kg por via subcutânea buprenorfina SR. NOTA: Fornecer analgesia antes de os resultados da cirurgia no alívio da dor superior. </li><li> Durante todo o procedimento, monitorar a frequência respiratória do mouse. NOTA: Um rato devidamente anestesiados sob isoflurano deve ter uma taxa respiratória de 50 - 100 ciclos / min. Um aumento da frequência respiratória indica que a anestesia é muito leve, enquanto uma frequência respiratória diminuída pode indicar que a anestesia é muito profundo. </li></ol></li><li> Prepare a pele do dorso do crânio com povidona-iodINE solução seguido de etanol a 70% três vezes. Drapejar com campos estéreis, deixando o local da cirurgia exposta. NOTA: Usar luvas cirúrgicas estéreis e manter uma técnica asséptica durante o procedimento. Apenas em contacto com superfícies e objetos estéreis, como a cortina estéril e os instrumentos autoclavados. Possui uma assistente de ajustar a iluminação, os pacotes sutura abertos, etc. </li><li> Usando um bisturi 15-lâmina, fazer uma incisão na linha média sagital, que se estende sobre a maior parte do crânio dorsal. Usando uma pinça fina dentadas, retrair a pele do lado direito da incisão para expor o osso parietal direito. </li><li> Usando uma furadeira com uma broca trefina diamantada 4 milímetros autoclavado, perfurar um defeito através do osso parietal. Não estenda o defeito passado óssea na camada dura-máter. (Figura 4) </li><li> Coloque um andaime no defeito e, em seguida, fechar a incisão na pele com o funcionamento de fio de náilon. </li><li> Monitorar o mouse e fornecer padrão de pós-operatório os cuidados de umegundo as diretrizes institucionais. <ol><li> Mantenha o mouse sobre uma toalha de papel limpa dentro de uma gaiola limpa enquanto ele se recupera. Metade da gaiola deve ser colocado sobre uma manta de recirculação de água quente e o rato deve ser colocada inicialmente no semestre. </li><li> Não deixe um mouse sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para deambular. Não devolva um rato que foi submetido a cirurgia para uma gaiola com outros ratos até que esteja totalmente recuperado. </li></ol></li><li> Repetir os passos acima com um novo rato para cada estrutura de suporte que está a ser testado. Esterilizar instrumentos cirúrgicos entre cirurgias usando um esterilizador talão quente ou outro método adequado. </li><li> Pouco tempo após o procedimento, e, em seguida, a 2, 4, 6, e 8 semanas, usar varrimento CT micro para analisar a taxa de fechamento do defeito calvária. NOTA: Ver o artigo de Levi et al. 6 para uma descrição de varredura micro CT de defeitos na calota craniana. </li><li> Quando o experimento é complete, a eutanásia ratos colocando-as em uma câmara de eutanásia limpo e iniciar um fluxo de dióxido de carbono gasoso para dentro da câmara a uma taxa de 2 L / min. Depois de respiração cessaram completamente (após cerca de 10 min) realizar deslocamento cervical para confirmar a eutanásia. </li><li> Opcionalmente, após a experiência estar completa, o uso de seccionamento e coloração histológica para avaliar a formação de osso dentro do defeito. NOTA: Ver o artigo de McArdle et al. 12 para obter detalhes sobre a preparação óssea amostras para histologia. Para uma revisão de técnicas histológicas e de coloração, consulte um manual histológica, como o Manual de Patologia Cirúrgica 15. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm divulgações a fazer.

Passos críticos dentro do Protocolo Durante a colheita da ASC, o passo crítico é a digestão adequada de gordura com colagenase. digestão inadequada resultará em um baixo rendimento da ASC. Durante FACS triagem de células BMPR-IB +, é importante definir cuidadosamente o portão para a positividade. Definindo portas muito frouxamente pode resultar em populações classificadas que não são puros. Durante a confecção do defeito calvária, é crítico para perfurar o defeito através do osso do crânio, mas...

Os principais defeitos ósseos resultantes de lesão, infecção ou cancro invasivo tem um impacto significativo sobre a recuperação e a qualidade de vida de um paciente. Existem técnicas para preencher esses defeitos com osso saudável de outras partes do próprio corpo do paciente, mas essa transferência leva seu próprio morbidade e risco de complicações 1, 2, 3. Além disso, alguns defeitos são tão grandes ou complexos que óssea de doadores suficiente não está disponível para preencher o defeito. Dispositivos protéticos são uma opção potencial para preenchimento de defeitos ósseos mas estes estão associados com várias desvantagens, incluindo o risco de infecção, falha de hardware, e reação de corpo estranho 4. Por estas razões, há um grande interesse na possibilidade de engenharia substitutos ósseos biológicos utilizando as próprias células 5 de um paciente. células estromais derivadas de tecido adiposo (ASCs)tem potencial para esta aplicação, porque eles estão disponíveis em abundância no próprio tecido de gordura do paciente e eles têm demonstrado a capacidade de curar defeitos ósseos, gerando um novo tecido ósseo 6, 7. ASC são uma população diversa de células e vários estudos têm mostrado que a selecção de marcadores específicos da superfície celular pode produzir populações de células com actividade osteogénica aumentada de 8, 9. Seleccionar ASC com o maior potencial osteogénico iria aumentar a probabilidade de que um andaime semeadas com estas células poderia regenerar um grande defeito ósseo. Sinalização proteína morfogenética do osso (BMP) é crítico para a regulação de diferenciação do osso e formação 10 e do tipo de receptor de BMP IB (BMPR-IB) é conhecida por ser importante para a osteogénese em 11 ASC. Recentemente, mostrámos que a expressão de BMPR-IB pode be usado para selecionar para ASC com reforçada actividade osteogénica 12. Aqui demonstramos um protocolo para o isolamento de BMPR-IB-expressando ASC de gordura humana, seguido de um ensaio da sua actividade osteogénica utilizando um modelo in vivo de calvária defeito.

<table><tbody><tr><td>Filtro de células de 100 mícrons</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi de 15 lâminas</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de 40 mícrons</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL Sutura</td> de <td>nylon Ethilon</td><td>Falcon 352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0, agulha P-3 de 18", &nbsp;</td><td>Anticorpo primário Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BMPR-IB</td><td>R& D systems</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>luvas cirúrgicas BioGel PI</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>ALA42675Z</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejo agulha driver</td> Ferramentas de <td>Belas Ciências</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 camundongo nu</td><td>Charles River</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo II pó</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM médio</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>Broca: Faca circular 4.0 mm</td><td>Xemax Surgical</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Broca: Micromotor sem escova Z500</td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Absorventes Absorventes Fisherbrand, 20" x 24"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Almofada de gaze de algodão estéril, 4" x 4"</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS medium</td><td>GE&nbsp; Ciências da Vida</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Isotesia isoflurano</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td></td><td></td>050033</tr><tr><td>Micro Fórceps com dentes</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Micro Fórceps com dentes</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Filme de parafina (Parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PLGA andaimes</td><td>Formulação proprietária</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188, 10%</td> <td>Sigma</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Campo Estéril Poli-revestido, 18 "x 24"</td> <td>Descartáveis para Hospital Busse</td><td>696</td><td>Corte um orifício retangular do tamanho apropriado</td></tr><tr><td>Solução de Polissucrose: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Preparação de Iodo Povidona</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica de petrolato Puralube, tubo de 1/8 oz.</td><td>Dechra Produtos</td><td></td><td></td>Veterinários</tr><tr><td>RBC lise tampão</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Webcol para preparação de álcool</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento rápido de bmpr-ib + adiposo-derivados de células estromais para uso em um defeito modelo cura calota craniana

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Cânceres invasivos, lesões graves e infecções podem causar defeitos ósseos grandes demais para serem reconstruídos com osso preexistente do próprio corpo do paciente. A capacidade de cultivar osso de novo usando as próprias células de um paciente permitiria que os defeitos ósseos fossem preenchidos com tecido adequado sem a morbidade da colheita de osso nativo. Há interesse no uso de células estromais derivadas do tecido adiposo (ASCs) como fonte para a engenharia de tecidos, pois estas são obtidas de uma fonte abundante: o próprio tecido adiposo do paciente. No entanto, os ASCs são uma população heterogênea e algumas subpopulações podem ser mais eficazes nessa aplicação do que outras. O isolamento da população mais osteogênica de ASCs pode melhorar a eficiência e a eficácia de um processo de engenharia óssea. Neste protocolo, as ASCs são obtidas do tecido adiposo subcutâneo de um doador humano. A subpopulação de ASCs que expressam o marcador BMPR-IB é isolada usando FACS. Essas células são então aplicadas a um ensaio de cicatrização de defeitos calvariais in vivo e apresentam potencial regenerativo osteogênico aprimorado em comparação com células não classificadas.

Micro Scan CT feito no dia da cirurgia irá mostrar claramente o defeito no crânio. Neste tempo, não haverá o crescimento interno para o defeito de 4 mm. verificações subsequentes são obtidos ao longo do tempo para quantificar o tamanho do defeito ao longo do tempo em comparação com a linha de base. Defeitos semeadas com células de BMPR-IB + devem demonstrar de forma mais rápida de fecho do defeito quando comparado com BMPR-IB e células não separadas (figura 5). Além diss...

As células estromais derivadas do tecido adiposo podem ser úteis para a engenharia de novos tecidos a partir das próprias células do paciente. Apresentamos um protocolo para o isolamento de uma subpopulação de células estromais derivadas do tecido adiposo humano (ASCs) com potencial osteogênico aumentado, seguido da aplicação das células em um ensaio de cicatrização calvarial in vivo.

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

O objetivo geral deste protocolo é isolar populações celulares específicas de células estromais derivadas de tecido adiposo e testar sua atividade osteogênica utilizando um ensaio in vivo. O método pode ser usado para responder perguntas fundamentais na área da biologia regenerativa craniofacial, como, por exemplo, como as células-tronco derivadas de tecido adiposo podem ser utilizadas para criar tecido ósseo plenamente funcional em defeitos ósseos danificados. A principal vantagem desta técnica é que as células são rapidamente isoladas de tecido humano fresco, evitando assim que passem tempo em cultura celular, o que é sabido alterar a expressão de genes e de marcadores celulares.As implicações desta técnica estendem-se a pacientes que apresentam grandes defeitos ósseos, causados por câncer, trauma ou infecção. No futuro, poderá ser possível isolar populações celulares de ASCs e utilizá-las de maneira regenerativa. A demonstração visual desta técnica é fundamental, pois a criação do defeito calvarial é difícil de aprender, principalmente porque o defeito é feito em um crânio com formato abobadado e porque está muito próximo à dura-máter.Para este protocolo, obtenha gordura subcutânea abdominal, lateral ou da coxa coletada de um doador humano saudável e armazenada em um coletor plástico a vácuo. Adicione ao tecido adiposo um volume igual de PBS estéril e misture com agitação suave durante 30 segundos. Deixe a camada aquosa decantar e, em seguida, remova-a utilizando uma pipeta plástica de 10 mililitros.Em seguida, decante a gordura para um recipiente plástico grande e adicione um volume igual da mistura de digestão. Limpe o recipiente fechado da gordura com etanol 70%, e feche-o com parafina. Em seguida, agite o recipiente a 180 rotações por minuto, em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, neutralize a digestão duplicando o volume da reação com meio padrão. Centrifugue as células, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 5 mililitros de meio padrão. Depois, passe todas as suspensões através de um filtro de 100 microns para um tubo cônico de 50 mililitros.Centrifugue o filtrado a quatro graus Celsius por 15 minutos a 300 G. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de eritrócitos à temperatura ambiente. Após a formação da suspensão, deixe por cinco minutos em lise à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue o tubo à temperatura ambiente por 15 minutos e finalize os passos de separação conforme o protocolo descrito no texto.A classificação celular adequada é essencial para este protocolo. Primeiro, re-suspenda as células em tampão FACS a um milhão de células por 100 microlitros e mantenha-as no gelo. Em seguida, transfira pelo menos 10 milhões de células para um tubo plástico de centrífuga no gelo, identificado como BMPR-1B.Transfira um milhão de células para um tubo sobre gelo rotulado como não corado e adicione um mililitro de tampão FACS. Rotule as células restantes como não classificadas. Em seguida, adicione o anticorpo ao tubo BMPR-1B e misture com pipetagem suave para homogeneizar.Deixe esta mistura incubando pelo tempo recomendado pelo fabricante. Em seguida, centrifugue as células para triagem por FACS e ressuspenda-as cuidadosamente em um mililitro de tampão FACS. Depois, repita o procedimento e ressuspenda as células a um milhão de células por mililitro.Agora, passe as três populações celulares através de filtros celulares de 40 micrômetros para tubos de FACS de vidro. Use 500 microlitros de tampão FACS para remover as últimas células dos filtros. Em seguida, prepare dois frascos de coleta, para as populações positivas e negativas para o anticorpo.Carregue cada um com dois mililitros de meio padrão de cultura celular, na máquina de FACS, execute primeiro as células não coradas e use os resultados para definir um gate negativo para o marcador fluorescente. Em seguida, utilizando um bico de 100 microns, separe as células coradas para os respectivos tubos contendo meio padrão. Se possível, mantenha esses tubos refrigerados a quatro graus Celsius durante a separação.Prossiga carregando as células na estrutura conforme descrito no protocolo textual. Após anestesiar o animal, corte os pelos da área cirúrgica e limpe a pele exposta com solução de iodopovidona seguida de etanol 70%, três vezes. Em seguida, cubra o animal com campo cirúrgico, deixando a área cirúrgica exposta.Agora, utilizando uma lâmina de bisturi 15, faça uma incisão sagital mediana que se estenda pela maior parte do crânio dorsal. Em seguida, com pinça de dentes finos, retrai a pele no lado direito da incisão para expor o osso parietal direito. Prepare a broca com uma ponteira de broca trepanadora esterilizada de quatro milímetros revestida com diamante.Em seguida, faça um defeito através do osso parietal, mas não estenda o defeito além do osso, mantendo a camada da dura-máter intacta. Agora, coloque um suporte contendo células ou solução controle no defeito e feche a incisão cutânea com ponto contínuo de náilon. Em seguida, prossiga com os protocolos de cuidados pós-operatórios com o camundongo conforme indicado no protocolo textual.Escaneamentos de micro-TC do defeito no crânio realizados no dia da cirurgia mostram claramente o novo defeito. Escaneamentos repetidos em pontos temporais posteriores mostram que os defeitos semeados com células positivas para BMPR-1B fecham mais rapidamente do que aqueles com células negativas para BMPR-1B ou células não classificadas. Quando a cicatrização é quantificada como uma porcentagem de fechamento completo da ferida, a diferença é facilmente apreciada.Em seguida, porções dos crânios contendo os defeitos foram descalcificadas e coradas para identificar o novo osso regenerado e o controle de regeneração óssea utilizando a pentacroma de Movat, que distingue a cartilagem do osso e todos os estágios de maturação intermediários. Em comparação com células não classificadas, as células positivas para BMPR-1B tiveram um forte impacto no processo regenerativo, mais notável nas bordas do defeito. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão do potencial clínico que este experimento oferece, ao isolar ASCs específicas do paciente e utilizá-las para curar defeitos ósseos.Muitos experimentos posteriores podem ser realizados a partir deste para responder ainda mais perguntas sobre a cicatrização óssea, como a utilização de FACS para o isolamento de ASCs com diferentes compromissos de linhagem, microtomografia computadorizada para analisar como diferentes tipos celulares e tecidos cicatrizam ao longo do tempo, e o modelo de defeito craniano neste experimento para gerar ideias para novos experimentos de cicatrização óssea. Não se esqueça de que o trabalho com tecido humano pode ser extremamente perigoso. Certifique-se de tomar as precauções adequadas, incluindo o uso de luvas, proteção ocular e a correta disposição de todos os resíduos perigosos.

rapid-isolation-bmpr-ib-adipose-derived-stromal-cells-for-use

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de...

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Este protocolo descreve o isolamento de derivadas de tecido adiposo a partir de células do estroma lipoaspirado e a criação de um defeito de 4 milímetros de tamanho crítico calvária em avaliar a regeneração óssea.

Reparação de um modelo de defeito crítico porte calvária Usando derivadas de tecido adiposo células do estroma colhidas lipoaspirado

Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.

Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

Propomos um protocolo de expansão celular na se microcarriers e seu uso como sistema de entrega em um bioreator de perfusão para propagar uma matriz de tecido decellularized. Nós também incluímos diferentes técnicas para determinar a proliferação celular e a viabilidade das células cultivadas no microcarriers. Além disso, demonstramos a funcionalidade das células após culturas de biorreator.

Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo

O número de novos biomateriais, projetado para a reparação de lesões ósseas grande está expandindo continuamente com o objectivo de reforçar a consolidação óssea e superar as complicações associadas com o transplante de osso. Aqui, apresentamos uma estratégia multidisciplinar para testes de pré-clínica biocompatibilidade de biomateriais para reparo ósseo.

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Este artigo apresenta um método que combina a adesão total da medula óssea e a classificação da citometria de fluxo para isolar, cultivar, classificar e identificar células-tronco mesenquimais de medula óssea a partir de mandíbulas de ratos.

Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

O isolamento de MSCsaltasde MFGE8BAMBI , um dos três principais subgrupos que constituem UC-MSCs humanas heterogêneas, é útil para entender completamente as características e funções desse subtipo para sua futura aplicação para melhorar a eficácia clínica em doenças específicas. Aqui, apresentamos um método para classificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.

Isolamento de células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical alto BAMBIhumanoMFGE8alto

Aprenda o isolamento rápido de células estromais adiposas com potencial osteogênico para biologia regenerativa craniofacial. Este método permite avaliar a atividade óssea in vivo em defeitos calvários.

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

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