Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo
19 de janeiro de 2017
Descrevemos aqui uma abordagem relativamente rápida e simples para mapear o tempo de replicação de mamíferos em todo o genoma, desde o isolamento celular até a análise básica dos resultados do sequenciamento. Um mapa genômico de um programa de replicação representativo será fornecido seguindo o protocolo.
O objetivo geral deste procedimento é mapear o programa de tempo de replicação em todo o genoma de uma célula de escolha. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de replicação, como, por exemplo, como o programa de replicação genômica muda na saúde e na doença.
A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma maneira rápida e simples de mapear o tempo de replicação em várias células e condições. O homem que escreveu o procedimento de fax seria Dan Lehmann, um especialista em fax na Faculdade de Medicina. Esse procedimento geralmente começa com pelo menos uma a duas vezes dez elevado à sexta de células em crescimento rápido e não sincronizadas.
Para células aderentes, aspire e lave cada placa com três mililitros de PBS sem cálcio nem magnésio. Descarte o PBS e adicione um mililitro de tripsina-EDTA comercial a cada placa. Incube as células por cinco minutos, a 37 graus Celsius, até que se desprendam.
Adicione três mililitros de meio de cultura para neutralizar a tripsina e colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros ou em um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Mantenha as células sobre gelo. Para iniciar este procedimento, centrifugue as células a 300 x G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspire e lave as células com um mililitro de PBS frio. Em seguida, centrifugue as células. Após a segunda lavagem, remova o PBS e re-suspenda as células em 250 microlitros de PBS frio.
Enquanto vórtex agita suavemente o tubo, adicione lentamente, gota a gota, 800 microlitros de etanol a menos 20 graus Celsius, com pureza elevada de 100 por cento. Isso resulta em uma concentração final de etanol entre 70 e 80 por cento. Incube as células em gelo por 30 minutos.
Inicie este procedimento centrifugando as células fixadas a 500 x G durante dez minutos a 4 graus Celsius. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e lave as células duas vezes com um mililitro de PBS frio. Centrifugue após cada lavagem.
Após a segunda lavagem, aspire o sobrenatante e re-suspenda cada célula com a seguinte mistura de PI. Um mililitro de PBS contendo cinco microlitros de RNAase a dez miligramas por mililitro e 50 microlitros de iodeto de propídio a um miligrama por mililitro. Filtre a amostra através de uma malha de 35 micrômetros para um tubo de poliestireno de 5 mililitros.
Feche o tubo com parafilm. Incube à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos. Mantenha as amostras no escuro, pois o iodeto de propídio é sensível à luz.
As células serão separadas usando uma máquina de fax. Utilize o laser de 561 nanômetros para diferenciar as células com base na intensidade de iodeto de propídio. Para obter resultados ideais, use a menor ponteira recomendada para o tamanho específico das células.
Para a maioria das células, é de 85 micrômetros. Utilize um fluxo constante e lento. Geralmente, até 300 a 500 eventos por segundo.
Utilizando o Gating, discrimine células mortas e detritos subcelulares plotando FCS versus SSC. A partir das células viáveis, discrimine dupletas plotando largura SSC versus altura SSC, seguido por um gráfico de largura FFC versus altura FFC e um gráfico de largura de iodeto de propídio versus altura de iodeto de propídio. Para as células sinal viáveis, desenhe um histograma da intensidade da área do iodeto de propídio, que representa o conteúdo de DNA das células.
Classifique as células em condições frias nas fases G1 e S. O delimitador para S deve ser amplo e invadir as fases G1 e G2. Já o delimitador para G1 deve ser estreito e o mais distante possível de S.
Para alguns tipos de células, pode ser difícil obter uma boa distribuição do ciclo celular. É mais crítico coletar a fase G1 sem células em fase S. Remova os tubos com células classificadas da máquina de fax.
Mantenha os tubos no gelo após a separação. Após a classificação celular, o DNA de cada amostra é purificado utilizando um kit comercial de purificação de DNA, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, fragmente o DNA com um ultrassonicator focalizado até um tamanho médio alvo de pico de 250 pares de bases.
Verifique o tamanho do DNA fragmentado por eletroforese. A distribuição de tamanho recomendada é de 200 a 700 pares de bases, com um pico em torno de 250 pares de bases. Posteriormente, a biblioteca é preparada, sequenciada e analisada conforme descrito no protocolo textual.
É apresentado um mapa de tempo de replicação para todo o cromossomo um de fibroblastos embrionários de camundongo. Com uma visão mais detalhada de uma região de aproximadamente 50 megabases. Os pontos representam a razão normalizada entre S e G1 para janelas individuais, e a linha contínua representa os resultados da interpolação suave cúbica.
Valores altos de S para G1 correspondem à replicação precoce, enquanto valores baixos correspondem à replicação tardia. As setas vermelhas indicam exemplos de regiões com tempo constante de replicação, e as setas verdes indicam regiões de transição temporal. Esta figura mostra a reprodutibilidade dos mapas de tempo de replicação entre triplicatas de fibroblastos embrionários de camundongo, comparadas a triplicatas de células pré-B de camundongo na mesma região de 18 megabases do cromossomo um do camundongo.
As setas laranjas indicam exemplos de regiões diferenciais entre as linhagens celulares. Um mapa de calor das correlações de Spearman entre as seis amostras confirma ainda mais os resultados. Uma vez dominada, esta técnica, desde a coleta de células até a geração de mapas, pode ser concluída em uma semana se realizada corretamente.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar mapas genômicos de tempo de replicação para células em crescimento.
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Visão Geral
Este artigo detalha o método da Razão da Quantidade de Cópias de S/G1 para mapeamento do Tempo de Replicação Genômico (CNR-ToR), uma abordagem simplificada para gerar mapas abrangentes do tempo de replicação no genoma em células de mamíferos. O protocolo aproveita as diferenças no conteúdo de DNA entre células em fase S e em fase G1, permitindo aos pesquisadores estudar programas de replicação em diversos tipos celulares e condições de forma eficiente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Biologia Celular
- Replicação do DNA
Contexto
- A replicação do genoma ocorre durante a fase S de maneira altamente regulada para garantir a fidelidade do DNA.
- O tempo de replicação (ToR) varia entre regiões genômicas e se correlaciona com características genômicas e epigenéticas.
- Alterações no tempo de replicação estão associadas às taxas de mutação e ao câncer.
- O mapeamento abrangente do tempo de replicação é essencial para compreender a regulação do genoma na saúde e na doença.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método rápido e simples para mapear o cronograma de replicação em todo o genoma em células de mamíferos.
- Permitir a comparação dos programas de replicação entre diferentes tipos celulares ou condições.
- Facilitar estudos sobre como o cronograma de replicação muda na saúde e na doença.
Métodos Utilizados
- Preparação e coleta de células em crescimento rápido e não sincronizadas.
- Coloração das células com iodeto de propídio (PI) para análise do conteúdo de DNA.
- Classificação de células nas fases G1 e S utilizando citometria de fluxo ativada por fluorescência (FACS) com base na intensidade do PI.
- Purificação de DNA a partir das células classificadas.
- Sonicar o DNA para obter um tamanho alvo de fragmento (~250 pb).
- Preparação de biblioteca, sequenciamento e análise bioinformática para gerar mapas de tempo de replicação.
Resultados Principais
- Geração de mapas de alta resolução do tempo de replicação para cromossomos inteiros (por exemplo, cromossomo um do camundongo).
- Identificação de regiões de replicação precoce e tardia com base nas razões de número de cópias S/G1.
- Detecção de regiões com tempo de replicação constante e regiões de transição temporal no genoma.
- Demonstração da reprodutibilidade e da capacidade de distinguir diferenças no tempo de replicação entre tipos celulares (por exemplo, fibroblastos embrionários de camundongo versus células pré-B).
Conclusões
- O método CNR-ToR é uma abordagem rápida, reprodutível e acessível para análise do cronograma de replicação em todo o genoma.
- Permite a comparação detalhada dos programas de replicação entre diferentes tipos celulares e condições.
- Essa técnica pode ser concluída em até uma semana e é adequada para uma ampla variedade de células de mamíferos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Mapas de cronometragem da replicação em todo o genoma gerados pelo método CNR-ToR fornecem informações acionáveis sobre a regulação do ciclo celular e a estabilidade genômica, ambos críticos para a descoberta precoce de fármacos e modelagem de doenças. Esta abordagem permite a comparação de alta resolução dos programas de replicação entre tipos celulares, apoiando a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Seu fluxo de trabalho rápido e reprodutível posiciona-o como uma capacidade valiosa para triagem de portfólios e pesquisas translacionais em P&D biofarmacêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de alterações no cronograma de replicação associadas a estados patológicos e instabilidade genômica.
- Apoia a validação funcional de alvos envolvidos na replicação do DNA e no controle do ciclo celular.
- Facilita a desmistificação mecanicista por meio da análise do cronograma de replicação em diversos contextos celulares.
- Oferece confiança preditiva para a priorização de alvos com fenótipos associados à replicação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara populações validadas de células para triagem subsequente com base na separação precisa de fases do ciclo celular.
- Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis de tempo de replicação para padronização de ensaios.
- Permite o mapeamento escalável de programas de replicação em múltiplas linhagens celulares ou condições.
- Apoia a avaliação confiável de compostos que afetam a dinâmica da replicação do DNA.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha perfis de tempo de replicação com características genômicas e epigenéticas relevantes para doenças.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica mediante comparação entre estados celulares saudáveis e doentes.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em alterações do programa de replicação.
- Fornece insights mecanicistas para o desenvolvimento de biomarcadores translacionais quando apoiado por dados genômicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método CNR-ToR integra-se ao continuum de descoberta desde os primeiros testes de hipóteses até a identificação de compostos promissores e a pesquisa pré-clínica, permitindo a análise sistemática do cronograma de replicação como um indicador funcional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alterações no programa de replicação e a elucidação de vias em modelos de doenças.
- Triagem: Fornece dados quantitativos e reprodutíveis de tempo de replicação para preparação de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Gera mapas genoma-abrangentes de razão S/G1 e saídas estatísticas para comparação robusta entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações no tempo de replicação com mecanismos de doenças e potenciais biomarcadores, quando apoiado por dados.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e escalável, adaptável a diversos sistemas de células de mamíferos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece análise rápida, reprodutível e escalonável do tempo de replicação em todo o genoma.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir e a eficiência do capital ao esclarecer os riscos associados à replicação.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos com relevância no tempo de replicação.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em análise do ciclo celular, operação de FACS e bioinformática para interpretação de dados.
- Necessita de acesso à triagem de células ativada por fluorescência, sequenciamento de alto rendimento e infraestrutura computacional.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para estratégias de seleção de eventos (gating) e normalização de dados.
- Adaptável a uma variedade de tipos celulares de mamíferos, mas a qualidade da distribuição do ciclo celular pode variar conforme o modelo.
- Depende de uma discriminação cuidadosa das fases e do manuseio adequado das amostras para garantir a qualidade dos dados.
