Name: Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a construir operons multigênicos sintéticos controlados por polimerase T7 induzível em Escherichia coli usando o sistema pMGX. Este método permite expressar múltiplas proteínas simultaneamente a partir de um único plasmídeo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá.

1. Obtendo Genes de Interesse <ol><li> Desenhe genes sintéticos. <ol><li> Otimize uma sequência de genes para a expressão de E. coli . </li><li> Remova todos os sites de restrição problemáticos da sequência (AvrII, NdeI, EcoRI e XbaI). </li><li> Incorporar sites de restrição para clonagem; É recomendado um site 5 &#39;-NdeI e um site 3&#39;-EcoRI. Outros locais podem ser utilizados, se necessário; Referem-se à região de multiclonagem do plasmídeo selecionado ( Figura S1- S4 ). Se desejado, inclua uma etiqueta de codificação 5 &#39;ou 3&#39; para a detecção Western Blot. </li><li> Comercialmente, ordene o gene projetado. </li><li> Ou o clone clone o gene em um vetor contundente usando um kit de clonagem contundente, de acordo com as instruções do fabricante; Projete iniciadores para amplificar o gene (então, avance para o passo 1.2.2); Ou adicionar extremidades 5 &#39;e 3&#39; adicionais para a clonagem direta em um plasmídeo pMGX e passar para o Passo 2. Aqui, thOs resultados representativos são da clonagem brusca dos genes de interesse. </li></ol></li><li> Amplificar o gene desejado (a partir de um gene sintético projetado e otimizado ou de DNA modelo contendo o gene desejado) 15 . <ol><li> Desenhe primers com sites de restrição para clonagem; É recomendado um site 5 &#39;-NdeI e um site 3&#39;-EcoRI. Outros locais podem ser utilizados, se necessário; Referem-se à região de multiclonagem do plasmídeo selecionado ( Figura S1- S4 ). Se desejado, inclua uma etiqueta de codificação de 5 &#39;ou 3&#39; para a detecção de Western Blot. </li><li> PCR amplifica o gene desejado 15 . </li><li> Analisar o PCR por eletroforese em gel de agarose 16 . </li><li> Se houver amplificação inespecífica, limpe o gene amplificado por extração de gel. Caso contrário, use um kit de limpeza de enzimas. </li><li> Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro, verificando o absorventeE a 260 nm; Em branco com tampão de eluição 17 . </li></ol></li></ol> 2. Clonagem de Genes de Interesse em um Vector de Sistema de Expressão Multigênica, pMGX 18 <ol><li> Restrição digerir o gene obtido de interesse e o vetor desejado, pMGX, com NdeI e EcoRI. NOTA: Se uma grande quantidade de plasmídeos recircularizados forem obtidos, permita que a reação de NdeI prossiga por 1 h antes de adicionar EcoRI. <ol><li> Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA e 1 μL de cada enzima com 4 μL do tampão 10x apropriado. </li><li> Para um resumo NdeI e EcoRI, use o tampão EcoRI e primeiro adicione a endonuclease NdeI. Digerir por 1 h a 37 ° C. Em seguida, adicione a endonuclease EcoRI e permita que o resumo continue por uma hora adicional. NdeI é sensível às clivagens próximas ao fim do DNA, então a digestão inicial por EcoRI pode prevenir a digestão efetiva pelo NdeI. </li></ol></li><li> ElectrOfora a digestão de restrição em gel de agarose (para um gene de 1 kb, use um gel de agarose a 0,7% a 110 V durante 55 min, para selecionar a porcentagem de gel de agarose para diferentes tamanhos de genes, consulte a referência 16 . </li><li> Inserção de impostos e bandas de vetores usando um bisturi limpo ou uma lâmina de barbear e coloque o segmento de gel excisado em um tubo de 1,5 mL. </li><li> Extrair o DNA do gel de agarose usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Ligar o gene de interesse para o vector pMGX utilizando uma proporção de inserção para vector de 3: 1; Configurar uma ligação negativa de pMGX digerido sem a inserção. <ol><li> Configure uma reação de ligação de 20 μL contendo 1 μL de T4 DNA ligase, 0,15-0,5 μg de DNA de vetor (~ 5 μL) e uma quantidade apropriada de inserção com base em uma proporção de inserção a vetor de 3: 1 e do tamanho de O gene que está sendo inserido; Os backbones pMGX estão entre 5,312 e 5,504 pb de tamanho. Inclua uma reação de controle negativo que contenha tudoT o gene que está sendo inserido. Certifique-se de que a quantidade de DNA de vetor é equivalente na ligação de controle negativo e as reações de ligação de inserção vetorial mais. </li></ol></li><li> Reagir as reacções de ligação em células de E. coli quimicamente competentes XL1-Blue e plasmídeos ligados pMGX- yfg1 (contendo o gene do interesse 1), pMGX- yfg2 (contendo o gene do interesse 2) ... pMGX- yfgn (contendo o gene do interesse n). Use técnica asséptica (dentro de um gabinete de biossegurança ou sob uma chama). <ol><li> Destilar alíquotas de 100 μL de XL1-Blue E. coli quimicamente competente em gelo durante 5 min e depois adicionar 5 μL das reações de ligação. Incube durante 30 minutos no gelo. </li><li> Choque de calor das células por 45 s em um banho de água a 42 ° C e depois adicione 200 μL de LB frio. Incubar em gelo durante 2 min. </li><li> Agite as células a 37 ° C, 220 rpm durante 1 h e, em seguida, aplique a placa 100 μL sobre uma placa de LB-agar contendo uma aprovaçãoMarcador selecionável adequado (ampicilina ou kanamicina). </li></ol></li><li> Teste os clones para transformantes positivos. <ol><li> Compare as contagens de colônias nas placas de controle negativo e ligadura. É desejada uma relação de contagem de colônias maior que 1: 2. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte para o Passo 2.1 e reveja a nota. </li><li> Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) de cada reação de ligação dos diferentes genes inseridos para rastreio (1 n) e inocule um LB de 4 mL e uma cultura durante a noite de antibiótico apropriada / colônia individual. Cultive culturas durante a noite com agitação a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Isolar o DNA do plasmídeo usando um kit de isolamento do DNA do plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Configure uma reação de 20 μL NdeI + EcoRI digest contendo 150-500 ng de DNA e 1 μL de cada enzima com 2 μL do tampão 10x apropriado. NaoÉ caso, adicione NdeI e EcoRI ao mesmo tempo em que o gene de interesse estará entre os sites de restrição. É recomendado um controle negativo com o vetor pMGX vazio. Digerir durante 2 h a 37 ° C em banho-maria. </li></ol></li></ol> 3. Inserindo o gene 2 no vetor pMGX contendo o gene 1, pMGX- yfg1 <ol><li> Restrição digerir pMGX- yfg1 com AvrII e tratar com fosfatase intestinal de bezerro (CIP). <ol><li> Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA vetorial (~ 5-10 μL de DNA isolado) e 1 μL de AvrII com 4 μL do tampão 10x apropriado. Digerir por 1,5 h a 37 ° C e depois adicionar 1,5 μL de CIP. Deixe-o a 37 ° C durante 30 minutos adicionais. </li></ol></li><li> Restriction digest pMGX- yfg2 com AvrII e XbaI para libertar o gene de interesse. <ol><li> Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA e 1 μ; L de cada enzima com 4 μL do tampão 10x apropriado. Digerir por 2 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> A restrição de eletroforese digere em um percentual apropriado (0,7%) de gel de agarose e adiciona as inserções e bandas de vetores usando um bisturi limpo / lâmina de barbear (consulte as Etapas 2.2-2.3). </li><li> Extraia o DNA usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante e quantifica o DNA 17 . </li><li> Ligate o gene 2 em pMGX- yfg1 usando uma proporção de inserção / vetor 3: 1. Configure uma ligação negativa de pMGX- yfg1 digerido sem a inserção adicional. Configure como acima no Passo 2.5. </li><li> Transforme 5 μL das reações de ligação em células XL1-Blue quimicamente competentes de E. coli , plasmídeos ligados pMGX- yfg1,2 (contendo o gene de interesse 1 e 2) e controle negativo de pMGX- yfg1 , como visto no Passo 2.6. </li><li> Compare a contagem de colônias nas placas de controle e ligadura negativas. Uma razão de contagem de colônias gÉ desejável reater do que 1: 2. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte para o Passo 3.1 e reveja o tratamento com CIP. </li><li> Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) da reação de ligação e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado por colônia individual e cresça durante a noite a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Isolar DNA de plasmídeo usando um kit de isolamento de DNA plasmídico de acordo com o protocolo do fabricante e quantificar o DNA 17 . </li><li> Tira a inserção efetiva do segundo gene, realizando uma digestão de restrição de pMGX- yfg1,2 com EcoRI. <ol><li> Use uma reação de 20 μL de digestão contendo 150-500 ng de DNA e 1 μL de enzima EcoRI com 2 μL de tampão EcoRI 10x. Digerir por 2 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Eletroforese a síntese de restrição em uma porcentagem adequada de gel de agarose; Procure uma banda que correspondaS ao tamanho do gene 2 (ver passo 2.2). Um gene pode inserir no vetor na orientação indesejada e reversa. </li></ol> 4. Adicionando um terceiro gene ao vetor pMGX contendo os genes 1 e 2, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Restrição digerir pMGX- yfg1,2 com AvrII e tratar com CIP, como visto no Passo 3.1. </li><li> Restriction digest pMGX- yfg3 com AvrII e XbaI, conforme observado na Etapa 3.2. </li><li> Eletroforese as digestões de restrição em uma porcentagem apropriada de gel de agarose e inserção de impostos especiais de consumo e bandas de vetores usando uma bisturí limpa / lâmina de barbear; Consulte os Passos 2.2-2.3. </li><li> Extraia o DNA do gel de agarose usando um kit de extração de gel e quantifica o DNA 17 . </li><li> O gene de ligato 3 em pMGX- yfg1,2 utilizando uma relação de inserção a vector de 3: 1 e estabeleceu uma ligação livre de pMGX- yfg1,2 digerido sem inserção adicional, como se observa no Passo 3.5. </li><li> Transforme 5 μL das reações de ligação em XLCélulas de E. coli quimicamente competentes de 1-azul, plasmídeo ligado pMGX- yfg1,2,3 (contendo genes de interesse 1, 2 e 3) e controle negativo de pMGX- yfg1,2 , como visto na Etapa 2.6. </li><li> Compare a contagem de colônias nas placas de controle e ligadura negativas. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte ao Passo 4.1 e reveja o tratamento com CIP. </li><li> Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) da reação de ligação e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado por colônia individual; Crescer durante a noite a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Isolar o DNA plasmídico usando um kit de isolamento de DNA plasmídico de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Tira a inserção efetiva do terceiro gene executando uma síntese de restrição de pMGX- yfg1,2,3 com EcoRI, conforme observado na Etapa 3.10. </li><li> Eletroforese a síntese de restrição em uma porcentagem adequada de gel de agarose; VejaPara bandas que correspondem aos tamanhos do gene 2 e do gene 3 (ver passo 2.2). Nota: o gene 3 pode inserir no vetor na orientação não desejada, invertida. Se os genes 2 e 3 forem do mesmo tamanho, outro local de restrição de restrição apropriado deve ser selecionado para triagem. NOTA: Repita conforme necessário para cada novo gene. </li></ol> 5. Produção de proteínas de interesse usando um sistema de expressão multigênica e avaliação da produção por Western Blot <ol><li> Transforme o clone positivo contendo todos os genes de interesse em quimicamente competente, produção de proteína E. coli , como BL21- (λDE3). <ol><li> Descongelar alíquotas de 100 μL de E. coli BL21- (λDE3) químicamente competente em gelo durante 5 min e depois adicionar 1 μL do DNA plasmídico clonado positivo; Incubar durante 30 min no gelo. </li><li> Choque térmico das células durante 45 s em banho-maria mantido a 42 ° C e depois adicione 200 μL de LB frio. Incubar no gelo durante 2 min. </li><li>Agite as células a 37 ° C e 220 rpm durante 1 h e depois aplique a placa 100 μL sobre uma placa de LB-agar contendo o marcador selecionável apropriado (ampicilina ou kanamicina). </li></ol></li><li> Expresse a proteína pela indução de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). <ol><li> Selecione uma colônia isolada da placa de transformação B21- (λDE3) e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado; Cresça durante a noite, agitando a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Inocular 100 mL de LB mais a cultura de antibiótico apropriada utilizando 1 mL de cultura durante a noite. </li><li> Crescer a 37 ° C com agitação a 220 rpm para uma DO 600 de 0,6. </li><li> Induzir a cultura com 100 μM de IPTG e crescer durante 15 h a 25 ° C e 220 rpm. </li><li> Remova 1 mL da cultura e centrifugá-la a 13.000 xg durante 1 min; Descarte o sobrenadante. </li></ol></li><li> Lyse as células usando solução de lise de acordo com as instruções do fabricanteE preforme uma mancha de Western do lisado celular solúvel para determinar se todas as proteínas foram produzidas com sucesso 19 . </li></ol>

<ol><li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+wave+of+synthetic+biology%3A+from+modules+to+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li>
<li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li>
<li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li>
<li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li>
<li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li>
<li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li>
<li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303559323_N-Acetylneuraminic_Acid_Production_in_Escherichia_coli_Lacking_N-Acetylglucosamine_Catabolic_Machinery">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li>
<li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts%3A+experimental+procedures%2C+database+tracking+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%2C+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li>
<li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Kim, K. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li>
<li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li>
<li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A co-expressão de múltiplos genes é cada vez mais essencial, particularmente na caracterização e reconstituição das vias metabólicas complexas multigênicas 3 , 4 , 5 . O sistema pMGX faz co-expressão multigene na rotina 6 , 7 , 8 de E. coli e acessível a diversos pesquisadores. Neste estudo, mostraram-se cinco proteínas de int...

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial, particularmente em aplicações de biologia sintética, onde vários módulos funcionais devem ser expressos 1 ; No estudo dos complexos proteína-proteína, onde a expressão e função muitas vezes requerem co-expressão 2 , 3 ; E na caracterização e aproveitamento de caminhos biossintéticos, onde cada gene na via deve ser expresso 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Vários sistemas foram desenvolvidos para coexpressão, particularmente no organismo hospedeiro Escherichia coli , o cavalo de trabalho para a expressão de proteína recombinante em laboratório 9 . Por exemplo, múltiplos plasmídeos com diferentes marcadores selecionáveis ​​podem ser usados ​​para expressar proteínas individuais usando uma riqueza de diferentes ex<html> Vetores de pressão 10 , 11 . Os sistemas plasmídicos únicos para expressão múltipla de proteínas utilizaram múltiplos promotores para controlar a expressão de cada gene 10 , 12 ; Operões sintéticos, onde múltiplos genes são codificados em uma única transcrição 2 , 13 ; Ou, em alguns casos, um único gene que codifica um polipéptido que é processado de forma proteolítica, produzindo as proteínas desejadas de interesse 14 . <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Figura 1: fluxo de trabalho pMGX que mostra a construção de um vetor policristão. O sistema pMGX fornece uma estratégia flexível e fácil de usar para a construção de operões sintéticos sob o controle de um promotor T7 indutível.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior deste número. Neste manuscrito, é descrito o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigene sob o controle de uma ARN polimerase T7 indutível ( Figura 1 ). Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. É baseado em um sistema de plasmídeo, originalmente chamado pKH22, que foi utilizado com sucesso para várias aplicações diferentes 6 , 7 , 8 . Aqui, este conjunto de plasmídeo é expandido para incluir quatro vetores relacionados: pMGX-A, um vetor de expressão que não possui quaisquer marcas C ou N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-hisA, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-K, um vetor de expressão lObtendo quaisquer tags C ou N-terminal e com o marcador de resistência à kanamicina; E pMGX-hisK, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à canamicina. Neste estudo, o método para a geração de um vetor policristão contendo cinco genes usando o sistema pMGX, especificamente pMGX-A, é demonstrado juntamente com a produção bem-sucedida de cada proteína individual em Escherichia coli .

<table><tbody><tr><td>Enzimas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Novo England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polimerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb Escada de DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Sem Manchas</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ágar Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) células quimicamente comeptent</td><td></td><td></td><td>Célula Comeptent preparada em casa</td></tr><tr><td>B-PER Reagente de Extração de Proteína Bacteriana</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP</td><td>Agilent Technologies</td><td></td> Fornecido com Kit <td></td></tr><tr><td></td><td>de Extração de Gel de PolimeraseOmega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extraction, fornecido pela VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Anticorpo [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Substrato de HRP quimioluminescente</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó instantâneo pasteurizado em pó</td> de <td>mercearia</td><td></td> local <td>Leite de mercearia sem nome é adequado</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrana PT 0.45 &micro; m 200 mm x 4 m, fornecido pela VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de DNA de plasmídeo</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A MiniKit de DNA de plasmídeo I, fornecido pela VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Solicitação do Boddy Lab Contato cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers Tecnologias de</td><td>DNA</td><td></td> integradas <td>Projete os primers conforme necessário para o gene desejado</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Projete e otimize conforme necessário</td></tr><tr><td>Papel de Filtro de Mancha Espessa</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue células quimicamente competentes</td><td></td><td></td><td>Célula de componente preparada em casa</td></tr><tr><td>Nome</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de gel - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Eletroforese Vertical</td></tr><tr><td>Cell Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubadora-forno</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora-agitadora</td><td>Isotemp Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Navalhas</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transiluminador</td><td>VWR International</td><td>Termociclador M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, fornecido pela Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Banho de Água</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de Transferência Ocidental</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

sistema induzível de expressão multigênica mediada por polimerização t7 de t7, pmgx

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial para a biologia sintética, estudando complexos proteína-proteína e caracterizando e aproveitando os caminhos biossintéticos. Neste manuscrito, descreve-se o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigenes sob o controle de uma polimerase de ARN T7 induzível. Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. Aqui, um conjunto de quatro vetores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K e pMGX-hisK, com o marcador selecionável por resistência à ampicilina ou kanamicina (A e K) e possuindo ou não uma hexahistidina N-terminal A tag (his) é divulgada. São fornecidos protocolos detalhados para a construção de operões sintéticos usando este sistema de vetores juntamente com os dados correspondentes, mostrando que um sistema baseado em pMGX contendo cinco genes pode ser facilmente construído e usado para produzir todas as cinco proteínas codificadas em Escherichia coli . Este sistemaEm e protocolo permite que os pesquisadores rotineiramente expressam módulos complexos de múltiplos componentes e caminhos em E. coli .

Neste estudo, o objetivo era co-expressar cinco proteínas de um único plasmídeo. Os fragmentos de gene sintético otimizados com cinco codões que codificam as marcas de hexahistidina N- ou C-terminal foram adquiridos comercialmente. Os genes sintéticos foram amplificados por PCR e clonados individualmente em um vetor PCR-blunt e sequenciados. Para gerar o plasmídeo policórónico, os cinco genes de interesse foram primeiro clonados num plasmídeo pMGX adequado, pMGX-A. A...

Este estudo descreve métodos para a co-expressão mediada por T7 de múltiplos genes de um único plasmídeo em Escherichia coli usando o sistema de plasmídeo pMGX.

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

O objetivo geral deste procedimento é construir operons sintéticos multigênicos sob o controle de uma RNA polimerase T7 induzível para expressar múltiplas proteínas simultaneamente. Este método pode auxiliar pesquisadores em biologia sintética e bioquímica, permitindo-lhes montar vias de múltiplas proteínas ou estudar complexos proteicos dependentes da coexpressão por múltiplas abordagens. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a expressão simultânea de múltiplos genes em Escherichia coli a partir de um único plasmídeo.Realizando o procedimento do meu laboratório estarão Mohamed Hassan, aluno de doutorado, e Angela Thompson, aluna de estágio cooperativo. Após obter e amplificar os genes de interesse conforme o protocolo descrito, prepare as reações de digestão para o primeiro gene de interesse e para o vetor pMGX. Utilize uma reação de 40 microlitros contendo 0,5 a 1,5 microgramas de DNA com a enzima indel.Incube as reações a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione EcoRI e deixe a digestão prosseguir por mais uma hora. NdeI é adicionado antes de EcoRI para garantir que a digestão ocorra de forma eficaz.A enzima NdeI é sensível ao comprimento de DNA de dupla fita em ambos os lados do sítio de restrição. Adicioná-la primeiro garante que ela corte o plasmídeo circular completo. Carregue as reações de digestão em um gel de agarose 0,7% e eletroforese as amostras a 100 volts por 55 minutos.Em seguida, com uma lâmina de bisturi ou lâmina de barbear limpa, excise as bandas do inserto e do vetor e coloque os segmentos de gel excisados em tubos de 1,5 mililitro. Utilize um kit de extração de gel de acordo com o protocolo descrito para purificar o DNA. Prepare uma reação de ligação de 20 microlitros contendo de 0,15 a 0,5 microgramas de DNA do vetor e a quantidade apropriada de inserto, dependendo do tamanho do gene, e um microlitro de ligase T4 de DNA.Em condições assépticas, descongele em gelo alíquotas de 100 microlitros de células de E. coli XL1-Blue quimicamente competentes por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco microlitros das reações de ligação contendo um gene de interesse às células. Incube as transformações em gelo por 30 minutos.Em seguida, submeta as células a um choque térmico por 45 segundos em banho-maria a 42 graus Celsius. Depois, coloque as transformações no gelo e adicione 200 microlitros de meio LB frio. Deixe as células incubarem por dois minutos.Incube as células a 37 graus Celsius com 220 rotações por minuto durante uma hora e espalhe 100 microlitros em placas de ágar LB contendo um marcador seletivo apropriado. Para triar colônias em busca de possíveis transformantes, compare o número de colônias no controle negativo com o das placas de ligação. É desejada uma razão de contagem de colônias de um para dois.Selecione quatro a oito colônias individuais de cada reação de ligação para inocular 4 mililitros de LB com o antibiótico apropriado. Incube as culturas a 37 graus Celsius e 220 rotações por minuto durante a noite. Com o kit de isolamento de DNA plasmidial, purifique o DNA plasmidial de acordo com o protocolo descrito e prepare reações de digestão de 20 microlitros com 150 a 500 nanogramas de DNA, utilizando um microlitro de cada enzima, NdeI e EcoRI.Incube as reações de digestão a 37 graus Celsius por duas horas. Para inserir o gene dois no vetor pMGX contendo o gene um, prepare uma reação de digestão de 40 microlitros contendo 0,5 a 1,5 microgramas de DNA do vetor contendo o primeiro gene de interesse e um microlitro de AVR2. Incube a reação a 37 graus Celsius por 1,5 hora antes de adicionar 1,5 microlitros de fosfatase de intestino de bezerro.Incube por mais 30 minutos. Em seguida, prepare uma reação de digestão de 40 microlitros contendo 0,5 a 1,5 microgramas do vetor pMGX contendo o segundo gene de interesse. Utilizando um microlitro de AVR2 e xpol.Incube a reação a 37 graus Celsius por duas horas. Eletroforese os digestos de restrição em gel de agarose 0,7%. E use uma borracha de bisturi limpa para excisar as bandas do inserto e do vetor conforme demonstrado anteriormente.Após extrair o DNA plasmidial e quantificar a amostra de acordo com o protocolo descrito, monte uma reação de ligação utilizando uma proporção de 3:1 entre inserto e vetor dos genes 2 e pMGX-yfg1. Inclua um controle negativo utilizando apenas o pMGX-yfg1. Transforme cinco microlitros de cada reação em células XL1-Blue conforme demonstrado anteriormente.Em seguida, compare a contagem de colônias nas placas de controle negativo e de ligação. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, revise o tratamento com CIP. Selecione quatro a oito colônias individuais da reação de ligação e utilize cada colônia para inocular quatro microlitros de LB acrescido do antibiótico apropriado.Cultive a 37 graus Celsius e 220 rotações por minuto durante a noite. Após isolar e quantificar o DNA plasmidial como anteriormente, realize a triagem para inserção eficaz do segundo gene montando uma reação de digestão contendo de 150 a 500 nanogramas de DNA e um microlitro de EcoRI. Incube as reações a 37 graus Celsius por duas horas.Recomenda-se EcoRI para fins de triagem, mas em alguns casos, EcoRI pode gerar dois ou mais fragmentos de inserção com tamanhos semelhantes, difíceis de distinguir em um gel. Para garantir o sucesso, deve-se utilizar uma enzima de digestão por restrição alternativa, como NdeI. Separe as reações de digestão em um gel de agarose, procurando uma banda que corresponda ao tamanho do gene inserido 2.Clone genes adicionais no plasmídeo de acordo com o protocolo descrito no texto. Para gerar o plasmídeo policistrônico, os cinco genes foram inicialmente clonados em um plasmídeo apropriado, pMGX A. Esta figura mostra pCR-Blunt-yfg1 e pCR-Blunt-yfg2 no plasmídeo pMGX A, bem como pMGX A digerido com indel e EcoRI. Para clonar os dois primeiros genes no pMGX A, o plasmídeo foi digerido com indel e EcoRI.Após a clonagem, os vetores pMGX-yfg1 e pMGX-yfg2 foram digeridos com AVR2 e xpol para confirmar que clones bem-sucedidos foram obtidos. Esta figura mostra o vetor pMGXyfg1 digerido com AVR2 e o vetor pMGX-yfg2 digerido com AVR2 e xpol para isolar o gene de interesse dois. O inserto resultante foi clonado no pMGX-yfg1 para criar o vetor pMGX-yfg1 dois.Como visto aqui, a digestão de pMGX-yfg1 dois com EcoRI confirmou a clonagem bem-sucedida do gene de interesse número dois no vetor pMGX-yfg1. Esta imagem de gel demonstra a diferença entre plasmídeos digeridos que continham o inserto em orientação correta ou em orientação reversa. Um inserto em orientação reversa apresentaria dois sítios EcoRI em proximidade, tornando os fragmentos resultantes de 50 pares de bases indetectáveis no gel e o esqueleto do plasmídeo maior.Por fim, após gerar um vetor de expressão policistrônico de cinco genes, um ensaio de western blot das proteínas expressas confirma que todas as cinco proteínas foram expressas a partir de um único vetor. Observe que a proteína produzida por yfg5 possui o mesmo tamanho que yfg1 e não é separada no gel. Quando dominada, esta técnica pode ser concluída em três ou quatro dias para cada gene inserido no vetor pMGX, desde que seja realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de tratar e linearizar o vetor com uma fosfatase, como a fosfatase da intestino de bezerro, para desfosforilar os cinco extremidades do vetor. Após este procedimento, experimentos adicionais, como a expressão multigênica in vivo, podem ser realizados com o objetivo de caracterizar e explorar vias biossintéticas para a produção de produtos naturais ou para estudar complexos proteína-proteína. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia sintética produzirem carboidratos complexos e E. coli geneticamente modificadas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implementar o sistema de expressão multigênica em E.coli.

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Fonte: Berens, C. et al. Aplicação de um sistema de expressão induzível para estudar a interferência dos fatores de virulência bacteriana com a sinalização intracelular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de um sistema de expressão induzível para identificar onde a proteína efetora bacteriana CaeB interrompe a cascata apoptótica do hospedeiro. Ele descreve as etapas para transfectar células que expressam CaeB com um sistema responsivo à tetraciclina, a fim de induzir a expressão...

Transfecção de um sistema de expressão gênica induzível em células que expressam uma proteína efetora bacteriana

Este vídeo demonstra o sistema de expressão gênica da tetraciclina, ou Tet-On, em um modelo de camundongo. Na presença de doxiciclina, um derivado da tetraciclina, o sistema Tet-On que consiste na proteína transativadora reversa controlada por tetraciclina é ativado e expressa o gene de interesse.

Expressão gênica baseada em sistema regulável por tet-on induzível in vivo: um sistema de expressão gênica induzido por tetraciclina para ativação da transcrição do gene alvo em modelo de camundongo

Aqui nós relatamos um método para usar tipo I e tipo...

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação da expressão do transgene usando pEUI(+) singular gene interruptor por tebufenozide tratamento.

Um isoinokosterone baseado no Receptor Singular Gene interruptor para deliberada expressão do Transgene com robustez, reversibilidade e insignificante Leakiness

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Este estudo descreve um método para experimentos de alto rendimento usando uma matriz de LED impressa em 3D para otimizar a expressão gênica induzível por luz em células HEK293T.

Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

Aprenda a construir operons multigênicos sintéticos controlados por polimerase T7 induzível em Escherichia coli usando o sistema pMGX. Este método permite expressar múltiplas proteínas simultaneamente a partir de um único plasmídeo.

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Explorar mais vídeos