Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX
27 de junho de 2017
Este estudo descreve métodos para a co-expressão mediada por T7 de múltiplos genes de um único plasmídeo em Escherichia coli usando o sistema de plasmídeo pMGX.
O objetivo geral deste procedimento é construir operons sintéticos multigênicos sob o controle de uma RNA polimerase T7 induzível para expressar múltiplas proteínas simultaneamente. Este método pode auxiliar pesquisadores em biologia sintética e bioquímica, permitindo-lhes montar vias de múltiplas proteínas ou estudar complexos proteicos dependentes da coexpressão por múltiplas abordagens. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a expressão simultânea de múltiplos genes em Escherichia coli a partir de um único plasmídeo.
Realizando o procedimento do meu laboratório estarão Mohamed Hassan, aluno de doutorado, e Angela Thompson, aluna de estágio cooperativo. Após obter e amplificar os genes de interesse conforme o protocolo descrito, prepare as reações de digestão para o primeiro gene de interesse e para o vetor pMGX. Utilize uma reação de 40 microlitros contendo 0,5 a 1,5 microgramas de DNA com a enzima indel.
Incube as reações a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione EcoRI e deixe a digestão prosseguir por mais uma hora. NdeI é adicionado antes de EcoRI para garantir que a digestão ocorra de forma eficaz.
A enzima NdeI é sensível ao comprimento de DNA de dupla fita em ambos os lados do sítio de restrição. Adicioná-la primeiro garante que ela corte o plasmídeo circular completo. Carregue as reações de digestão em um gel de agarose 0,7% e eletroforese as amostras a 100 volts por 55 minutos.
Em seguida, com uma lâmina de bisturi ou lâmina de barbear limpa, excise as bandas do inserto e do vetor e coloque os segmentos de gel excisados em tubos de 1,5 mililitro. Utilize um kit de extração de gel de acordo com o protocolo descrito para purificar o DNA. Prepare uma reação de ligação de 20 microlitros contendo de 0,15 a 0,5 microgramas de DNA do vetor e a quantidade apropriada de inserto, dependendo do tamanho do gene, e um microlitro de ligase T4 de DNA.
Em condições assépticas, descongele em gelo alíquotas de 100 microlitros de células de E. coli XL1-Blue quimicamente competentes por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco microlitros das reações de ligação contendo um gene de interesse às células. Incube as transformações em gelo por 30 minutos.
Em seguida, submeta as células a um choque térmico por 45 segundos em banho-maria a 42 graus Celsius. Depois, coloque as transformações no gelo e adicione 200 microlitros de meio LB frio. Deixe as células incubarem por dois minutos.
Incube as células a 37 graus Celsius com 220 rotações por minuto durante uma hora e espalhe 100 microlitros em placas de ágar LB contendo um marcador seletivo apropriado. Para triar colônias em busca de possíveis transformantes, compare o número de colônias no controle negativo com o das placas de ligação. É desejada uma razão de contagem de colônias de um para dois.
Selecione quatro a oito colônias individuais de cada reação de ligação para inocular 4 mililitros de LB com o antibiótico apropriado. Incube as culturas a 37 graus Celsius e 220 rotações por minuto durante a noite. Com o kit de isolamento de DNA plasmidial, purifique o DNA plasmidial de acordo com o protocolo descrito e prepare reações de digestão de 20 microlitros com 150 a 500 nanogramas de DNA, utilizando um microlitro de cada enzima, NdeI e EcoRI.
Incube as reações de digestão a 37 graus Celsius por duas horas. Para inserir o gene dois no vetor pMGX contendo o gene um, prepare uma reação de digestão de 40 microlitros contendo 0,5 a 1,5 microgramas de DNA do vetor contendo o primeiro gene de interesse e um microlitro de AVR2. Incube a reação a 37 graus Celsius por 1,5 hora antes de adicionar 1,5 microlitros de fosfatase de intestino de bezerro.
Incube por mais 30 minutos. Em seguida, prepare uma reação de digestão de 40 microlitros contendo 0,5 a 1,5 microgramas do vetor pMGX contendo o segundo gene de interesse. Utilizando um microlitro de AVR2 e xpol.
Incube a reação a 37 graus Celsius por duas horas. Eletroforese os digestos de restrição em gel de agarose 0,7%. E use uma borracha de bisturi limpa para excisar as bandas do inserto e do vetor conforme demonstrado anteriormente.
Após extrair o DNA plasmidial e quantificar a amostra de acordo com o protocolo descrito, monte uma reação de ligação utilizando uma proporção de 3:1 entre inserto e vetor dos genes 2 e pMGX-yfg1. Inclua um controle negativo utilizando apenas o pMGX-yfg1. Transforme cinco microlitros de cada reação em células XL1-Blue conforme demonstrado anteriormente.
Em seguida, compare a contagem de colônias nas placas de controle negativo e de ligação. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, revise o tratamento com CIP. Selecione quatro a oito colônias individuais da reação de ligação e utilize cada colônia para inocular quatro microlitros de LB acrescido do antibiótico apropriado.
Cultive a 37 graus Celsius e 220 rotações por minuto durante a noite. Após isolar e quantificar o DNA plasmidial como anteriormente, realize a triagem para inserção eficaz do segundo gene montando uma reação de digestão contendo de 150 a 500 nanogramas de DNA e um microlitro de EcoRI. Incube as reações a 37 graus Celsius por duas horas.
Recomenda-se EcoRI para fins de triagem, mas em alguns casos, EcoRI pode gerar dois ou mais fragmentos de inserção com tamanhos semelhantes, difíceis de distinguir em um gel. Para garantir o sucesso, deve-se utilizar uma enzima de digestão por restrição alternativa, como NdeI. Separe as reações de digestão em um gel de agarose, procurando uma banda que corresponda ao tamanho do gene inserido 2.
Clone genes adicionais no plasmídeo de acordo com o protocolo descrito no texto. Para gerar o plasmídeo policistrônico, os cinco genes foram inicialmente clonados em um plasmídeo apropriado, pMGX A. Esta figura mostra pCR-Blunt-yfg1 e pCR-Blunt-yfg2 no plasmídeo pMGX A, bem como pMGX A digerido com indel e EcoRI. Para clonar os dois primeiros genes no pMGX A, o plasmídeo foi digerido com indel e EcoRI.
Após a clonagem, os vetores pMGX-yfg1 e pMGX-yfg2 foram digeridos com AVR2 e xpol para confirmar que clones bem-sucedidos foram obtidos. Esta figura mostra o vetor pMGXyfg1 digerido com AVR2 e o vetor pMGX-yfg2 digerido com AVR2 e xpol para isolar o gene de interesse dois. O inserto resultante foi clonado no pMGX-yfg1 para criar o vetor pMGX-yfg1 dois.
Como visto aqui, a digestão de pMGX-yfg1 dois com EcoRI confirmou a clonagem bem-sucedida do gene de interesse número dois no vetor pMGX-yfg1. Esta imagem de gel demonstra a diferença entre plasmídeos digeridos que continham o inserto em orientação correta ou em orientação reversa. Um inserto em orientação reversa apresentaria dois sítios EcoRI em proximidade, tornando os fragmentos resultantes de 50 pares de bases indetectáveis no gel e o esqueleto do plasmídeo maior.
Por fim, após gerar um vetor de expressão policistrônico de cinco genes, um ensaio de western blot das proteínas expressas confirma que todas as cinco proteínas foram expressas a partir de um único vetor. Observe que a proteína produzida por yfg5 possui o mesmo tamanho que yfg1 e não é separada no gel. Quando dominada, esta técnica pode ser concluída em três ou quatro dias para cada gene inserido no vetor pMGX, desde que seja realizada corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de tratar e linearizar o vetor com uma fosfatase, como a fosfatase da intestino de bezerro, para desfosforilar os cinco extremidades do vetor. Após este procedimento, experimentos adicionais, como a expressão multigênica in vivo, podem ser realizados com o objetivo de caracterizar e explorar vias biossintéticas para a produção de produtos naturais ou para estudar complexos proteína-proteína. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia sintética produzirem carboidratos complexos e E. coli geneticamente modificadas.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implementar o sistema de expressão multigênica em E.coli.
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Visão Geral
Este estudo descreve métodos para a coexpressão mediada por T7 de múltiplos genes a partir de um único plasmídeo em Escherichia coli utilizando o sistema de plasmídeos pMGX. A técnica permite aos pesquisadores construir operons sintéticos multigênicos para expressão simultânea de proteínas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Sintética
- Bioquímica
- Engenharia Genética
Antecedentes
- O sistema de RNA polimerase T7 é amplamente utilizado para expressão gênica.
- A coexpressão de múltiplas proteínas é crucial para o estudo de complexos proteicos.
- Escherichia coli atua como hospedeiro comum para expressão proteica.
- O uso de um único plasmídeo para múltiplos genes simplifica o processo de clonagem.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para expressar múltiplos genes simultaneamente.
- Facilitar a construção de vias multienzimáticas.
- Aprimorar o estudo de interações e complexos proteicos.
Métodos Utilizados
- Amplificação dos genes de interesse.
- Preparação das reações de digestão para os genes e o plasmídeo pMGX.
- Uso de enzimas indel para manipulação do DNA.
- Demonstração do procedimento por membros do laboratório.
Resultados Principais
- Coexpressão bem-sucedida de múltiplos genes em E. coli.
- Demonstração da eficiência do método na produção de proteínas.
- Aplicações potenciais em biologia sintética e bioquímica.
- Ilustração do processo por meio de uma demonstração detalhada em laboratório.
Conclusões
- O método de coexpressão mediado por T7 é eficaz para a expressão de múltiplos genes.
- Essa técnica pode avançar pesquisas em complexos proteicos.
- Estudos futuros podem explorar aplicações adicionais em biologia sintética.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coexpressão eficiente de múltiplas proteínas é essencial para a biologia sintética, engenharia de vias metabólicas e o estudo de complexos proteicos na pesquisa farmacêutica e biotecnológica&D. O sistema pMGX mediado pela polimerase de RNA T7 indutível permite a expressão simultânea de vários genes a partir de um único plasmídeo em E. coli, simplificando a montagem e a validação funcional de módulos biossintéticos complexos. Essa capacidade permite a prototipagem rápida e a redução de riscos de sistemas biológicos multicomponentes em pontos críticos de descoberta e pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias multigênicas e interações proteína-proteína em um sistema controlado.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao permitir a validação funcional de operons sintéticos complexos.
- Oferece suporte à confiança preditiva em estudos de montagem de vias e interação com alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas validados de expressão multiproteica para fluxos de trabalho de triagem downstream.
- Melhora a reprodutibilidade do ensaio ao padronizar a coexpressão a partir de um único vetor.
- Permite plataformas escaláveis e reutilizáveis para avaliar variantes de vias ou complexos proteicos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir a expressão de módulos multigerados de proteínas relevantes para a doença.
- Apóia a continuidade desde o design de vias sintéticas até a validação pré-clínica em sistemas microbianos.
- Reduz o risco no avanço de vias projetadas para aplicações terapêuticas ou produtivas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema pMGX integra-se ao continuum de descoberta, desde o design inicial em biologia sintética até a identificação de vias promissoras e a validação pré-clínica em E. coli.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a montagem e expressão rápidas de construtos multigênicos.
- Triagem: Fornece sistemas reprodutíveis de múltiplas proteínas prontos para ensaios, destinados a estudos funcionais e de interação.
- Análises: Fornece dados quantitativos de expressão proteica, confirmados por western blot e análise de restrição, para comparação de configurações de vias.
- Pesquisa Translacional: Facilita a continuidade pré-clínica de módulos biossintéticos projetados com relevância para objetivos terapêuticos ou produtivos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular e padronizada, adaptável a diversos projetos de biologia sintética e engenharia de proteínas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de vias multigênicas.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de fluxos de trabalho de expressão multiproteica.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais informadas de avançar/não avançar e o progresso eficiente em termos de capital de sistemas biológicos complexos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de iniciativas de biologia sintética e engenharia de proteínas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, digestão com enzimas de restrição e transformação microbiana.
- Necessita de acesso a instrumentação padrão de biologia molecular e ferramentas analíticas, como eletroforese em gel e western blotting.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de clonagem e triagem para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos conjuntos de genes e desenhos de vias metabólicas em sistemas de expressão em E. coli.
- Depende da seleção cuidadosa de enzimas e preparação de vetores para assegurar a orientação e expressão corretas dos genes.
