Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

Na epiderme. A imuno-histoquímica é um meio eficiente de localizar proteínas específicas em seu compartimento de expressão. Neste vídeo, demonstramos um método confiável para imunolocalização de proteínas na epiderme, que usamos rotineiramente em nosso laboratório.

Olá, sou Tammy, do Laboratório do Dr. Turin, aqui no prédio baixo do Instituto de Pesquisa em Saúde de Ottawa, no programa de doenças crônicas. Hoje vamos mostrar um procedimento para imuno-histoquímica usando anticorpos fluorescentes em seções de tecido embebidas em parafina da epiderme de camundongo. Em nosso laboratório, otimizamos protocolos para marcadores de diferenciação epidérmica imunolocalizadores usando tecido fixo do BO.

Como parte da otimização, mantemos a pele plana, colocando-a em papel toalha antes de fixar. Este procedimento envolve dissecção da epiderme, fixação, desidratação, inclusão em parafina e corte de seção, reidratação de enceramento, desmascaramento do antígeno, marcação de anticorpos e, finalmente, montagem e visualização com epifluorescência. Então, vamos começar.

Ao usar camundongos neonatais, não há necessidade de raspar a pele traseira. No entanto, quando você tem ratos mais velhos com pelos, é necessário raspar a pele das costas para que não atrapalhe o corte das seções. Ao fazer sua dissecção, você deve ter muito cuidado para não colocar o fórceps nas áreas da pele que deseja usar para o ensaio.

Então, o que fazemos é colocar a pinça ao redor da borda de onde vamos cortar, e então você levanta com muito cuidado, corta a epiderme, lembrando-se de não tocar na área que deseja usar para o experimento. Quando estamos consertando a pele, não queremos que a pele enrole e fique no tubo. Queremos que seja bonito e plano.

Então, o que fazemos para ajudar nisso é colocar a pele em uma toalha de papel para que ela fique plana enquanto está sendo consertada. Então, agora que temos a pele bonita e plana na toalha de papel, o que fazemos é cortar as bordas ou apará-las para remover as partes que podemos ter danificado com a pinça. E então você corta a pele em pedaços muito pequenos, cerca de dois milímetros por dois milímetros.

Agora o tecido vai ser consertado. Depois de cortar a pele em pedaços manejáveis, você a mergulha na solução boin. Tampe os tubos, enrole-os com perfil e coloque-os em um balancim.

Para uma incubação durante a noite, é importante incubar na solução boin apenas 16 a 18 horas. Períodos de fixação mais curtos ou mais longos danificarão seu tecido. A incubação acabou.

Você enxágue o lenço com PBS e, em seguida, passe por uma série de lavagens com etanol usando 30%, 50% e 70% de álcool. Você pode ver que o BO é de cor amarela e que, à medida que você faz as lavagens, à medida que os benefícios são diluídos, a cor da lavagem se torna cada vez menos amarela. Você lava duas vezes 30 minutos de cada vez.

Após a última lavagem em etanol, as amostras são colocadas em etanol fresco a 70% e podem ser armazenadas a quatro graus Celsius até o processamento posterior de algumas aberturas de parafina. Incorporação. O uso excessivo de tecidos congelados é que a integridade do tecido é superior e as amostras podem ser armazenadas por longos períodos de tempo. Em geral, as instalações principais geram resultados mais reprodutíveis.

No entanto, se você tiver a instalação e um operador dedicado que tenha a experiência, as seções podem ser cortadas internamente. Aprender a cortar boas seções é uma forma de arte. Portanto, usamos uma instalação central.

Depois de receber os slides de volta da instalação do Core, você pode ver que a parafina está presente nos slides. Como um filme fino, as lâminas são colocadas em uma prateleira embrulhada com papel alumínio, como uma batata assada e incubadas por cinco minutos a 55 graus. Após o término da incubação, desembrulhe rapidamente as lâminas e coloque-as em tolueno por três lavagens de cinco minutos.

É muito importante lembrar que essas lavadoras de cinco minutos devem ser bem cronometradas, incubando por muito tempo, e o tolueno não será bom para seus espécimes. Após as três lavagens e tolueno, faça um enxágue rápido com cem por cento de etanol. Como o etanol e o tolueno formam um precipitado que interferirá no seu experimento, este é um passo muito importante a ser lembrado.

Em seguida, as amostras são reidratadas por lâminas de incubação, cinco minutos em etanol a 95%, cinco minutos em, etanol a 70% e, em seguida, duas vezes cinco minutos em água. Neste ponto, os tecidos podem ser processados para coloração com h e e. Também usamos a instalação principal para esse fim.

Para desmascarar o antígeno, 500 mils de tampão de citrato de uma vez em um copo de plástico de um litro e mergulhe suas lâminas. Lembre-se de remover a alça de metal e colocar o copo no micro-ondas. Microondas em alta potência por duas vezes cinco minutos.

Lembre-se de abrir a porta para resfriar o micro-ondas entre as duas incubações. Após o término do micro-ondas, remova as lâminas do tampão de citrato fervente e coloque-as em uma mancha contendo água morna. Usamos apenas água morna da torneira e o objetivo disso é resfriar lentamente seus slides da fervura à temperatura ambiente.

Agora você pode lavar as lâminas três vezes por cinco minutos em PBS e estamos prontos para começar com a imuno-histoquímica. A primeira coisa que precisamos fazer para iniciar a imunocoloração é secar a área ao redor de nossas amostras com um pedaço de papel de seda. Para evitar a contaminação cruzada de anticorpos, demarcamos a área ao redor de nossas amostras com um bloqueador de líquidos.

Prepare uma câmara umidificada colocando um papel de filtro em uma placa de Petri. Mergulhe-o com água, retire o excesso de água e insira as lâminas. A razão pela qual usamos uma câmara umidificada é garantir que, durante nossos períodos de incubação, nossas lâminas não sequem.

É muito importante que os slides não sequem, pois o desenho aumentará seu plano de fundo. As lâminas são bloqueadas neste momento com buffer de incubação por 30 minutos. Após o bloqueio, transfira as lâminas de volta para o rack de lâminas e incube no tampão de lavagem.

Remova o excesso de buffer como você fez antes. Coloque a lâmina de volta na câmara umidificada e incube com anticorpo primário por uma hora. À temperatura ambiente.

Quando a incubação de uma hora terminar, coloque as lâminas de volta no rack de lâminas e lave com tampão de lavagem por três vezes 10 minutos. Após as lavagens, remova o excesso de tampão de lavagem ao redor da amostra com um lenço de papel. Coloque as lâminas de volta na câmara umidificada e incube por uma hora em temperatura ambiente com anticorpo secundário após incubar com anticorpo secundário, lave em três trocas de tampão de lavagem por 15 minutos cada.

Em seguida, lavamos três vezes cinco minutos. No PBS, remova qualquer excesso de líquido ao redor da amostra e limpe o PBS da parte de trás da lâmina para montar as lamínulas na lâmina. Usamos celular com 2,5% DAB co.

Para reduzir o desbotamento, adicione 80 microlitros de gota a gota aos slides. Tomando cuidado para não introduzir bolhas. Em seguida, abaixe muito lentamente em uma lamínula.

Tomando cuidado para não deixar bolhas para trás. As bolhas são ruins porque geralmente pousam bem no seu espécime, exatamente onde você deseja tirar suas fotos depois que o celular estiver seco. Agora você está pronto para ir Olhe para seus slides.

Aqui está uma olhada em uma coloração bem-sucedida usando um filtro FITC. Em uma objetiva de 20 x, vemos Clain seis associado a todas as camadas superbasais da epiderme. Nosso laboratório está muito interessado na expressão e localização de claudinas na epiderme.

Com relação às junções apertadas e à formação da barreira de permeabilidade epidérmica, acabamos de mostrar como realizar a imuno-histoquímica na pele de camundongos. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que você deseja que suas seções de tecido sejam planas e que deseja garantir que suas lâminas não sequem entre as incubações. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.