Name: Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a dissecar tecido gonadal de larvas de Danio rerio para análise molecular. Este método permite estudar diferenciação sexual em peixes-zebra desde 17 dias pós-fertilização.

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Agradecemos C Zhang para o cuidado de peixe. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (31171074, 31371099 e 31571067 para GP) e pelo Projeto Talentos Pujiang (09PJ1401900 para GP).

experiências peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Fudan. Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com os procedimentos padrão 20. 1. Preparações <ol><li> Cultivar a 17 dpf e 25 dpf peixe-zebra larval <ol><li> Transferência 2 do sexo masculino e 2 do peixe-zebra adultos do sexo feminino (saudável, 3 a 6 meses de idade, a estirpe de laboratório AB) para um tanque de passagem no final da tarde do dia antes do cruzamento. Separar os machos e fêmeas com uma barreira. Na manhã seguinte, atualizar a água do tanque e remova a barreira para permitir-lhes para acasalar. Coleta de ovos em 100 mm placas de Petri de 1 a 2 horas após a fertilização. </li><li> Mantenha a cerca de 40 embriões numa placa de 100 mm, com 40 mL de meio de embrião (EM) a 28,5 ° C durante o período de desenvolvimento inicial (dia 4) e atualizar a EM duas vezes por dia. Transferência das larvas para tanques 1 L (40 larvas para 300 mL de água) e sistema alimentar com rotíferos vivos (alimentação total, duas vezes por dia) após a 5 dpf.Alimente camarão de água salgada ao vivo em vez de dieta rotíferos após 10 dpf. Transferir o peixe em água do sistema de recirculação em 14 dpf 21. </li><li> Elevar peixe-zebra larval no sistema de água de recirculação até 17 dpf ou 25 dpf. Assegurar o ciclo de luz / escuro de 14/10 h é e valor de pH de água do sistema é de cerca de 7,2. Medir o comprimento de corpo de 17 dpf (5,5-6,8 mm) e 25 dpf (8 a 11 mm) 22 larvas. </li></ol></li><li> Preparar 2% placas de agar para a dissecção. <ol><li> Adicionar 4 g de agar a 200 mL de água estéril. Aqueça a mistura em um forno de microondas até que fique transparente. </li><li> Arrefece-se a solução de agar durante cerca de 15 min, depois despejar 60 mm de diâmetro placas de Petri (aproximadamente 1/3 do volume da chapa). Armazenar as placas de agar solidificadas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo 1: Dissecar o tecido gonadal de 17 e 25 dpf Larvas <ol><li> Adicione gelo picado para o tanque para anestesiar 17 larvas dpf. transferir olarvas anestesiados para um 100 mm refrigeradas placa de Petri com solução de 30 ml de solução fria de Ringer. Manter o peixe incubadas em solução de Ringer geladas durante pelo menos 15 min para anestesiar completamente as larvas. </li><li> Transferência das larvas para uma placa de ágar pré-arrefecida com uma pequena colher de plástico. Submerge todo o corpo do peixe em 10 mL refrigeradas solução de Ringer e suavemente colocá-lo sobre o seu lado. </li><li> Fazer as seguintes operações sob o campo de visão do 25X microscópio estéreo. Prender o tronco peixe com uma pinça para estabilização. Rasgar o abdômen longitudinalmente a partir do ânus para o coração com outro par de pinças. Remova cuidadosamente a pele e os músculos de um lado do corpo para expor os órgãos internos. </li><li> Retire a massa de órgãos ventral à bexiga natatória com cuidado. Evitar danos na gónada ligado à bexiga natatória. </li><li> Cortar a ligação entre a bexiga natatória e corpo anterior. Retire toda a bexiga natatória e tecido gonadal suavemente. NOTA: Na maioria dos casoss, o tecido gonadal em 17 dpf contém circundante tecido epitelial e protonephridium. Eles não são facilmente separadas uma da outra, mas a 25 dpf pode ser facilmente separada. O gonadal também está ligado ao ânus. A junção com gônada esquerda e direita ligados uns aos outros no ânus será claramente visível. </li><li> Utilizar uma pinça para separar cuidadosamente o tecido gonadal da bexiga natatória e limpar os tecidos adiposos adjacentes. </li><li> Imediatamente transferir o tecido gonadal isolado para um tubo de centrífuga previamente arrefecido de 1,5 ml contendo solução de 200 ul da campainha. Manter o tubo em gelo até que todos os tecidos gonadais são separados a partir das larvas. </li><li> Dissecar as gónadas de 25 dpf larvas, tal como descrito nas etapas 2.1 - 2.7. </li></ol> 3. Protocolo 2: Analisar Gene Expression dos isolados tecidos Gonadais <ol><li> Extrair o ARN total a partir dos tecidos gonadais larvares. <ol><li> Transferir os tecidos gonadais isolado para uma nova isenta de RNase 1.5 mL de tubo e remover a solução de Ringer. Adicionar 100 de solução de lise. Vortex até que os tecidos são completamente lisadas. </li><li> Executar o procedimento da extracção total de ARN de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Adicionar 1/10 volume de 10x ADNase I de tampão e 1 mL de ADNase I para a solução de ARN e misturar suavemente. Incubar durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 1/10 volume de reagente de inactivao de DNase à solução de ARN. Incubar durante 10 min a 70 ° C. Medir a concentração do ARN total utilizando um espectrofotómetro. Armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Realizar a síntese de ADNc de primeira cadeia <ol><li> Usar um-ligante iniciador oligo (dT) para realizar a síntese da primeira cadeia de cDNA, seguindo o protocolo do fabricante. Adicionar 1 a 2 ug de RNA para um volume total de reacção de 20 uL. </li><li> Incubar a solução de reacção durante 90 minutos a 45 ° C. Terminar a reacção por aquecimento a 70 ° C durante 5 min. </li><li> Adicionar 1 mL de ARNase H para o cDNA assimlução para remover o ARN residual. Misturar suavemente e centrifuga-se durante 10 s a 13000 x g ~. Incubar durante 20 min a 37 ° C. Adicionar 20 ul de água livre de nuclease. Armazenar a -70 ° C. </li></ol></li><li> Executar PCR quantitativa fluorescente <ol><li> Execute qPCR em um sistema cycler com um corante fluorescente. Use as seguintes condições de ciclos de PCR: 35 ciclos a 95 ° C durante 15 s, Tm-5 ° C durante 15 s, 68 ° C durante 30 s. Use sequências iniciadoras como se segue: a HAM (Fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (Fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (Fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (Fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) e β-actina (Fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O peixe-zebra tornou-se um modelo poderoso e é amplamente utilizado no desenvolvimento e investigação relacionada com a doença. Os métodos para o isolamento de órgãos no peixe-zebra adulto, tais como tumores do cérebro, coração, gônadas e rim, foram bem documentados 23, 24, 25. Devido ao pequeno tamanho e remodelação dinâmica dos tecidos gonadais no peixe-zebra larval, o isolamento de tecido gonadal é uma tarefa difícil. Estudo...

O principal determinante do sexo feminino em selvagem cromossoma peixe-zebra 4 for perdido ou modificado no peixe-zebra domesticado (por exemplo estirpes de laboratório comuns) 1. Em vez disso, eles têm um sistema de determinação do sexo poligénica acompanhados por factores ambientais tais como a temperatura, a hipoxia, a disponibilidade de alimentos e densidade populacional. As modalidades específicas do desenvolvimento sexual peixe-zebra não são totalmente compreendidos. As questões fundamentais, tais como quando a determinação do sexo do peixe-zebra ocorre, o que o sinal de determinação do sexo primário (s) é / são, e que os genes regulam o primeiro passo de transformação das gónadas permanecem sem resposta 2, 3. No processo de desenvolvimento sexual peixe-zebra, várias etapas importantes foram reconhecidos. Na fase inicial de desenvolvimento, a partir de 4 HPF (horas após a fertilização) células germinativas primordiais (PGCs) submeter a especificação, a migração para e crista genitalproliferação. Números PGC e interacções recíprocas entre as células germinativas e células somáticas são importantes para a diferenciação gonadal 4. Aos 13 dpf (dias após a fertilização), as gónadas estão em fase indiferenciada. Por 17 dpf, as gônadas desenvolver em bi-potenciais ovários em ambos os sexos futuras. A transição dependente de apoptose a partir de ovário de testículo começam em 21 a 25 dpf e pode continuar durante várias semanas. Por 35 dpf, o sexo da gónada foi determinada e a produção de gâmetas específicos do sexo está em curso em ambos os ovários e de testículos de 5, 6, 7. Até à data, diversos genes e os mecanismos de determinação do sexo candidatos têm sido propostos. Proteomics e análise do transcriptoma isolaram muitos genes com expressão dimorfismo sexual e estes genes foram utilizados para estudar diferenciação sexual em peixes-zebra 8, </sup&gt; 9, 10. Por exemplo, no peixe-zebra larval, o gene cyp19a1a é especificamente expresso no ovário mas não no testículo 11, 12. Além disso, o gene AMH é fracamente expressa nas células da granulosa de folículos do ovário, mas fortemente em células de Sertoli de testículos 13. Em contraste, o gene de vasa é continuamente expressa nas células germinativas de ambos peixe-zebra macho e fêmea, tornando-o um marcador adequado gonadal 14, 15. Investigar os níveis de expressão do gene gonadais é fundamental para compreender o mecanismo molecular de determinação e diferenciação sexual, especialmente na fase de ovário bi-potencial 3, 9. No entanto, o pequeno tamanho do peixe-zebra larval e, correspondentemente, pequenas gónadas complicam o isolamento da gónadal tecido para outras análises moleculares. Estudos anteriores usados dissecado região do tronco inteiro entre o opercula e poros anal 16. Esta preparação, embora contendo gónadas, consiste em vários tecidos e órgãos. Em alternativa, os animais transgénicos com expressão da GFP específica para-gonadal, tais como vasa: EGFP foram usadas para o isolamento de tecido gonadal através de células activadas por fluorescência (FACS) e captura de laser de micro-dissecção 17, 18. Mas a sua aplicação generalizada é limitado. Aqui, descrevemos um procedimento simples para isolar o tecido gonadal dos peixes-zebra larval em 17 dpf e 25 dpf. Nós demonstramos a posição das gónadas no que diz respeito a outros órgãos e isolar as gónadas morfologicamente intactas a partir dos tecidos circundantes. Mostramos ainda mais os genes específicos de gónadas, tais como vasos e cyp19a1a são altamente expresso nas gônadas isolado em comparação com o tecido do tronco por meio de PCR quantitativa (qPCR) análise. O presente protocolo permite a identificação, o isolamento, a purificação de ARN e amplificação de genes específicos gonadais de peixe-zebra larval, permitindo assim a análise molecular subsequente de tecido gonadal 19.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Para incubação de embriões</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>Para 1 L necessário: adicionar 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl e 2,9 g de CaCl&#183; 2H2O; em seguida, adicione 0,41 g de KH2PO4, 0,412 g de Na2HPO4 anidro e 4,9 g de MgSO4&#183; 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>Diluir 20x EM em água destilada</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gene</td><td>121985</td><td>Para preparar as placas de ágar 2%</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Para isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Vidro do medidor</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>Para preparar as placas de ágar 2%</td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>Para aquecer o ágar</td></tr><tr><td>Pinça DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>para dissecação</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Para dissecação</td></tr><tr><td>Equipamento de água pura</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' s Para</td><td></td><td></td><td>1 L necessário: Adicionar 6,78 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 0,26 g de CaCl2 e 1,19 g de Hepes; em seguida, encher até 1 L; Ajuste o pH para 7,2. Esterilizar por filtração e manter em um recipiente de policarbonato transparente autoclavado.</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Banho de metal</td><td>Microscópio QiLinbeier</td><td></td><td>Modelo GL-150</td></tr><tr><td>Leica</td><td>&nbsp;</td><td>M205 FA</td><td>Para Centrífuga Fotomicrográfica</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de RNA em Micro Escala</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Para isolamento de RNA de tecidos gonadares</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>Para digestão de DNA na solução de RNA</td></tr><tr><td>RevertAid Kit de Síntese de cDNA de primeira fita</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Para síntese de cDNA de primeira fita</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>Para digerir o RNA residual na solução de cDNA.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Este produto é um master mix 2x baseado em Taq DNA polimerase para PCR em tempo real e&nbsp; aplicável para ensaio de intercalação com SYBR Green I.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Medindo a concentração do RNA total</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Perfil</td><td>de expressão gênica de Hamburgo</td></tr></tbody></table>

dissecção de larval zebrafish gonadal tissue

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Embora peixe-zebra selvagem possuem um / ZW sistema de determinação do sexo ZZ, peixe-zebra domesticados perderam do cromossoma sexual. Eles utilizam um sistema de determinação do sexo poligénica, onde vários genes distribuídos ao longo do genoma determinar colectivamente as identidades do sexo de cada peixe. Atualmente, os genes envolvidos na regulação do desenvolvimento das gônadas e como eles funcionam ainda imperceptíveis. Normalmente, o isolamento de tecido gonadal é o primeiro passo para examinar os processos de desenvolvimento sexuais. Aqui, nós apresentamos um processo para isolar tecido gonadal de 17 dpf (dias após a fertilização) e 25 dpf larvas de peixe-zebra. O tecido gonadal isolado pode ser posteriormente examinada por morfologia e a expressão do gene de perfis.

Dissecções das gónadas foram realizadas na AB strain peixe-zebra larval. A Figura 1 mostra tecido gonadal típico de peixe-zebra de larvas no 17 dpf e 25 dpf. Em primeiro lugar, a pele e os músculos de um lado do abdômen é cortado para expor os órgãos internos. Depois de retirar a massa dos órgãos internos, a bexiga natatória, juntamente com a gônada permanecer no tronco. O gonadal foi ligado ao lado ventral da bexiga natatória (seta na F...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de tecido gonadal dos peixes-zebra larval, o que irá facilitar as investigações de diferenciação sexual peixe-zebra e manutenção.

Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o tecido gonadal de filhotes de peixe-zebra e analisar as propriedades moleculares do tecido isolado. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo do desenvolvimento sexual do peixe-zebra, como a conservação de genes na regulação do desenvolvimento da gônada e os fundamentos moleculares do desenvolvimento sexual do peixe-zebra. A principal vantagem desta técnica é que tecidos gonadais de filhotes de peixe-zebra tão precoces quanto 17 dias após a fertilização podem ser dissecados para avaliar o estado celular e biológico molecular.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao tamanho pequeno e à remodelação dinâmica dos tecidos gonadais em peixes-zebra larvais. Para se preparar para a dissecação gonadal, transfira dois peixes-zebra adultos machos e dois fêmeas para cada lado de um tanque de cruzamento dividido. Na manhã seguinte, renove a água do tanque e remova a barreira para iniciar o acasalamento.Uma a duas horas após a fertilização, colete e transfira cerca de quarenta ovos para uma placa de 100 milímetros com 40 mililitros de meio embrionário, ou EM. Incube os embriões a 28,5 graus Celsius por quatro dias, renovando o EM duas vezes ao dia. Após a incubação, transfira as larvas para tanques de um litro. Após cinco dias pós-fertilização, ou DPF, forneça rotíferos vivos aos peixes.Quando as larvas atingirem dez DPF, alimente os peixes com artêmias vivas. Em seguida, aos 14 DPF, transfira os peixes para um sistema de água recirculante. Crie os peixes larvais até 17 ou 25 DPF.Em seguida, meça o comprimento corporal das larvas aos 17 e 25 DPF. Prepare placas de ágar a dois por cento para dissecação, adicionando quatro gramas de ágar a 200 mililitros de água estéril. Aqueça a mistura em forno de micro-ondas até que fique transparente.Resfrie o ágar por 15 minutos, depois despeje em placas de Petri com diâmetro de 60 milímetros. Armazene as placas de ágar solidificadas a quatro graus Celsius. Para larvas anestesiadas de 17 DPF, adicione gelo triturado ao tanque.Transfira as larvas anestesiadas para uma placa de Petri de 100 milímetros resfriada contendo 30 mililitros de solução de Ringer fria. Incube os peixes na solução de Ringer resfriada por pelo menos 15 minutos para anestesiar completamente as larvas. Com uma colher de plástico, transfira as larvas para uma placa de ágar pré-resfriada.Mergulhe todo o corpo do peixe em dez mililitros de solução de Ringer gelada e coloque-o suavemente de lado. Sob um microscópio estereoscópico, com ampliação de 25x, use pinças para prender o tronco do peixe e estabilizá-lo. Em seguida, com outro par de pinças, rasgue longitudinalmente o abdômen do ânus até o coração.Em seguida, remova suavemente a pele e os músculos de um lado do corpo para expor os órgãos internos. Depois, remova cuidadosamente os órgãos volumosos ventrais à bexiga natatória. Evite danificar a gônada presa à bexiga natatória.Corte a conexão entre a bexiga natatória e o corpo interno. Em seguida, retire cuidadosamente toda a bexiga natatória e o tecido gonadal. Com pinça, separe cuidadosamente o tecido gonadal da bexiga natatória.E remova o tecido adiposo circundante. Transfira imediatamente o tecido gonadal isolado para um tubo de centrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitros, contendo 200 microlitros de solução de Ringer. Mantenha o tubo no gelo até que todos os tecidos gonadais sejam separados das larvas.Para extrair RNA total de tecido gonadal larval, transfira as gônadas isoladas para um novo tubo de 1,5 mililitro livre de RNase e remova a Solução de Ringer. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de lise e vorte o tubo até que o tecido seja completamente lisado.Após realizar uma extração total de RNA, de acordo com as instruções do fabricante, adicione um décimo do volume de tampão de DNase I e um microlitro de DNase I à solução de RNA, e misture suavemente o conteúdo do tubo. Incube a amostra a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione um décimo do volume do reagente de inativação de DNase à solução de RNA.Incube a amostra a 70 graus Celsius por dez minutos. Em seguida, utilize um espectrofotômetro para medir a concentração do RNA total. Para realizar a síntese da fita complementar de cDNA, use um iniciador ligante oligo-dT e um a dois microgramas de RNA para realizar a síntese da fita complementar de cDNA, seguindo o protocolo do fabricante.Incube a reação a 45 graus Celsius por 90 minutos. Em seguida, encerre a reação aquecendo a amostra a 70 graus Celsius por cinco minutos. Adicione um microlitro de RNase H à solução de cDNA para remover o RNA residual.Misture suavemente o conteúdo do tubo e centrifugue a amostra a aproximadamente 13.000 ×g por dez segundos. Incube o tubo a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione 20 microlitros de água livre de nucleases à amostra.E armazene o cDNA a 70 graus negativos Celsius. Finalmente, use corante fluorescente para realizar qPCR usando a condição e os iniciadores listados no protocolo textual. Esta figura mostra o tecido gonadal típico de peixe-zebra larval aos 17 DPF.O gônada está preso ao lado ventral da bexiga natatória, como visto aqui. Aos 17 DPF, as larvas contêm os gônadas esquerdo e direito, que são translúcidos. Na maioria dos casos, os gônadas são cercados por tecido epitelial e protonefrídio.Em 25 DPF, a gônada é frequentemente envolvida por tecido adiposo, e gônadas grandes ou pequenas podem ser observadas. Por fim, para analisar as propriedades moleculares do tecido gonadal isolado, os níveis de expressão dos marcadores gonadais amh, cyp19a1a, nanos3 e vasa foram examinados por QPCR. Os resultados mostram aumentos significativos nos genes marcadores no tecido gonadal em comparação com o tecido controle.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fornecer condições de criação consistentes para larvas de peixe-zebra, pois isso é fundamental para obter os resultados esperados. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisas na área de desenvolvimento sexual, permitindo explorar os mecanismos de determinação do sexo em peixe-zebra.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar tecidos gonadais de peixes-zebra larvais.

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Research

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