Name: Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a dissecar tecido gonadal de larvas de Danio rerio para análise molecular. Este método permite estudar diferenciação sexual em peixes-zebra desde 17 dias pós-fertilização.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos C Zhang para o cuidado de peixe. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (31171074, 31371099 e 31571067 para GP) e pelo Projeto Talentos Pujiang (09PJ1401900 para GP).

experiências peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Fudan. Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com os procedimentos padrão 20. 1. Preparações <ol><li> Cultivar a 17 dpf e 25 dpf peixe-zebra larval <ol><li> Transferência 2 do sexo masculino e 2 do peixe-zebra adultos do sexo feminino (saudável, 3 a 6 meses de idade, a estirpe de laboratório AB) para um tanque de passagem no final da tarde do dia antes do cruzamento. Separar os machos e fêmeas com uma barreira. Na manhã seguinte, atualizar a água do tanque e remova a barreira para permitir-lhes para acasalar. Coleta de ovos em 100 mm placas de Petri de 1 a 2 horas após a fertilização. </li><li> Mantenha a cerca de 40 embriões numa placa de 100 mm, com 40 mL de meio de embrião (EM) a 28,5 ° C durante o período de desenvolvimento inicial (dia 4) e atualizar a EM duas vezes por dia. Transferência das larvas para tanques 1 L (40 larvas para 300 mL de água) e sistema alimentar com rotíferos vivos (alimentação total, duas vezes por dia) após a 5 dpf.Alimente camarão de água salgada ao vivo em vez de dieta rotíferos após 10 dpf. Transferir o peixe em água do sistema de recirculação em 14 dpf 21. </li><li> Elevar peixe-zebra larval no sistema de água de recirculação até 17 dpf ou 25 dpf. Assegurar o ciclo de luz / escuro de 14/10 h é e valor de pH de água do sistema é de cerca de 7,2. Medir o comprimento de corpo de 17 dpf (5,5-6,8 mm) e 25 dpf (8 a 11 mm) 22 larvas. </li></ol></li><li> Preparar 2% placas de agar para a dissecção. <ol><li> Adicionar 4 g de agar a 200 mL de água estéril. Aqueça a mistura em um forno de microondas até que fique transparente. </li><li> Arrefece-se a solução de agar durante cerca de 15 min, depois despejar 60 mm de diâmetro placas de Petri (aproximadamente 1/3 do volume da chapa). Armazenar as placas de agar solidificadas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo 1: Dissecar o tecido gonadal de 17 e 25 dpf Larvas <ol><li> Adicione gelo picado para o tanque para anestesiar 17 larvas dpf. transferir olarvas anestesiados para um 100 mm refrigeradas placa de Petri com solução de 30 ml de solução fria de Ringer. Manter o peixe incubadas em solução de Ringer geladas durante pelo menos 15 min para anestesiar completamente as larvas. </li><li> Transferência das larvas para uma placa de ágar pré-arrefecida com uma pequena colher de plástico. Submerge todo o corpo do peixe em 10 mL refrigeradas solução de Ringer e suavemente colocá-lo sobre o seu lado. </li><li> Fazer as seguintes operações sob o campo de visão do 25X microscópio estéreo. Prender o tronco peixe com uma pinça para estabilização. Rasgar o abdômen longitudinalmente a partir do ânus para o coração com outro par de pinças. Remova cuidadosamente a pele e os músculos de um lado do corpo para expor os órgãos internos. </li><li> Retire a massa de órgãos ventral à bexiga natatória com cuidado. Evitar danos na gónada ligado à bexiga natatória. </li><li> Cortar a ligação entre a bexiga natatória e corpo anterior. Retire toda a bexiga natatória e tecido gonadal suavemente. NOTA: Na maioria dos casoss, o tecido gonadal em 17 dpf contém circundante tecido epitelial e protonephridium. Eles não são facilmente separadas uma da outra, mas a 25 dpf pode ser facilmente separada. O gonadal também está ligado ao ânus. A junção com gônada esquerda e direita ligados uns aos outros no ânus será claramente visível. </li><li> Utilizar uma pinça para separar cuidadosamente o tecido gonadal da bexiga natatória e limpar os tecidos adiposos adjacentes. </li><li> Imediatamente transferir o tecido gonadal isolado para um tubo de centrífuga previamente arrefecido de 1,5 ml contendo solução de 200 ul da campainha. Manter o tubo em gelo até que todos os tecidos gonadais são separados a partir das larvas. </li><li> Dissecar as gónadas de 25 dpf larvas, tal como descrito nas etapas 2.1 - 2.7. </li></ol> 3. Protocolo 2: Analisar Gene Expression dos isolados tecidos Gonadais <ol><li> Extrair o ARN total a partir dos tecidos gonadais larvares. <ol><li> Transferir os tecidos gonadais isolado para uma nova isenta de RNase 1.5 mL de tubo e remover a solução de Ringer. Adicionar 100 de solução de lise. Vortex até que os tecidos são completamente lisadas. </li><li> Executar o procedimento da extracção total de ARN de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Adicionar 1/10 volume de 10x ADNase I de tampão e 1 mL de ADNase I para a solução de ARN e misturar suavemente. Incubar durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 1/10 volume de reagente de inactivao de DNase à solução de ARN. Incubar durante 10 min a 70 ° C. Medir a concentração do ARN total utilizando um espectrofotómetro. Armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Realizar a síntese de ADNc de primeira cadeia <ol><li> Usar um-ligante iniciador oligo (dT) para realizar a síntese da primeira cadeia de cDNA, seguindo o protocolo do fabricante. Adicionar 1 a 2 ug de RNA para um volume total de reacção de 20 uL. </li><li> Incubar a solução de reacção durante 90 minutos a 45 ° C. Terminar a reacção por aquecimento a 70 ° C durante 5 min. </li><li> Adicionar 1 mL de ARNase H para o cDNA assimlução para remover o ARN residual. Misturar suavemente e centrifuga-se durante 10 s a 13000 x g ~. Incubar durante 20 min a 37 ° C. Adicionar 20 ul de água livre de nuclease. Armazenar a -70 ° C. </li></ol></li><li> Executar PCR quantitativa fluorescente <ol><li> Execute qPCR em um sistema cycler com um corante fluorescente. Use as seguintes condições de ciclos de PCR: 35 ciclos a 95 ° C durante 15 s, Tm-5 ° C durante 15 s, 68 ° C durante 30 s. Use sequências iniciadoras como se segue: a HAM (Fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (Fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (Fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (Fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) e β-actina (Fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+sex+in+zebrafish%3A+loss+of+the+natural+sex+determinant+in+domesticated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains.</a> Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).</li>
<li>Liew, W. C., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sex%3A+a+complicated+affair%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sex: a complicated affair.</a> Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).</li>
<li>Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+winding+roads%3A+Testis+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).</li>
<li>Blaser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
<li>Wang, X. G., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+and+11+%CE%B2-hydroxylase+show+reciprocal+expression+to+that+of+aromatase+in+the+transforming+gonad+of+zebrafish+males%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males.</a> Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+apoptosis+during+the+transition+from+ovary-like+tissue+to+testes+during+sex+differentiation+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish.</a> J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).</li>
<li>Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+zebrafish+during+gonad+differentiation+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocr%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics.</a> Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).</li>
<li>Siegfried, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+determinants%3A+gene+expression+during+gonadal+sex+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation.</a> J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).</li>
<li>Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+analysis+of+sex-+and+gonad-biased+gene+expression+in+the+zebrafish%3A+evidence+for+masculinization+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome.</a> BMC Genomics. 10, 579(2009).</li>
<li>Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11264405">Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain.</a> Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).</li>
<li>Kishida, M., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cytochrome+P450+aromatase+isoforms+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+brain+and+ovary+are+differentially+programmed+and+estrogen+regulated+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development.</a> Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).</li>
<li>Rodríguez-Marí, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+pattern+of+zebrafish+anti-M%C3%BCllerian+hormone+%28amh%29+relative+to+sox9a%2C+sox9b%2C+and+cyp19a1a%2C+during+gonad+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development.</a> Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+vas%3A%3AEGFP+transgene+in+primordial+germ+cells+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish.</a> Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphic+expression+pattern+of+a+splice+variant+of+zebrafish+vasa+during+gonadal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development.</a> Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).</li>
<li>Tzung, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+depletion+of+primordial+germ+cells+in+zebrafish+promotes+testis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).</li>
<li>Hsiao, C., Tsai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+with+fluorescent+germ+cell%3A+a+useful+tool+to+visualize+germ+cell+proliferation+and+juvenile+hermaphroditism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo.</a> Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).</li>
<li>Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+gonads+from+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish.</a> Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nr0b1+%28DAX1%29+mutation+in+zebrafish+causes+female-to-male+sex+reversal+through+abnormal+gonadal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).</li>
<li>Liew, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polygenic+sex+determination+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polygenic sex determination system in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (4), e34397(2012).</li>
<li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+Adult+Zebrafish+Hearts+for+High-throughput+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications.</a> J. Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li>
<li>Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+development+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line development in fishes.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).</li>
<li>Huang, H. Y., Ketting, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+zebrafish+gonads+for+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation.</a> Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O peixe-zebra tornou-se um modelo poderoso e é amplamente utilizado no desenvolvimento e investigação relacionada com a doença. Os métodos para o isolamento de órgãos no peixe-zebra adulto, tais como tumores do cérebro, coração, gônadas e rim, foram bem documentados 23, 24, 25. Devido ao pequeno tamanho e remodelação dinâmica dos tecidos gonadais no peixe-zebra larval, o isolamento de tecido gonadal é uma tarefa difícil. Estudo...

O principal determinante do sexo feminino em selvagem cromossoma peixe-zebra 4 for perdido ou modificado no peixe-zebra domesticado (por exemplo estirpes de laboratório comuns) 1. Em vez disso, eles têm um sistema de determinação do sexo poligénica acompanhados por factores ambientais tais como a temperatura, a hipoxia, a disponibilidade de alimentos e densidade populacional. As modalidades específicas do desenvolvimento sexual peixe-zebra não são totalmente compreendidos. As questões fundamentais, tais como quando a determinação do sexo do peixe-zebra ocorre, o que o sinal de determinação do sexo primário (s) é / são, e que os genes regulam o primeiro passo de transformação das gónadas permanecem sem resposta 2, 3. No processo de desenvolvimento sexual peixe-zebra, várias etapas importantes foram reconhecidos. Na fase inicial de desenvolvimento, a partir de 4 HPF (horas após a fertilização) células germinativas primordiais (PGCs) submeter a especificação, a migração para e crista genitalproliferação. Números PGC e interacções recíprocas entre as células germinativas e células somáticas são importantes para a diferenciação gonadal 4. Aos 13 dpf (dias após a fertilização), as gónadas estão em fase indiferenciada. Por 17 dpf, as gônadas desenvolver em bi-potenciais ovários em ambos os sexos futuras. A transição dependente de apoptose a partir de ovário de testículo começam em 21 a 25 dpf e pode continuar durante várias semanas. Por 35 dpf, o sexo da gónada foi determinada e a produção de gâmetas específicos do sexo está em curso em ambos os ovários e de testículos de 5, 6, 7. Até à data, diversos genes e os mecanismos de determinação do sexo candidatos têm sido propostos. Proteomics e análise do transcriptoma isolaram muitos genes com expressão dimorfismo sexual e estes genes foram utilizados para estudar diferenciação sexual em peixes-zebra 8, </sup&gt; 9, 10. Por exemplo, no peixe-zebra larval, o gene cyp19a1a é especificamente expresso no ovário mas não no testículo 11, 12. Além disso, o gene AMH é fracamente expressa nas células da granulosa de folículos do ovário, mas fortemente em células de Sertoli de testículos 13. Em contraste, o gene de vasa é continuamente expressa nas células germinativas de ambos peixe-zebra macho e fêmea, tornando-o um marcador adequado gonadal 14, 15. Investigar os níveis de expressão do gene gonadais é fundamental para compreender o mecanismo molecular de determinação e diferenciação sexual, especialmente na fase de ovário bi-potencial 3, 9. No entanto, o pequeno tamanho do peixe-zebra larval e, correspondentemente, pequenas gónadas complicam o isolamento da gónadal tecido para outras análises moleculares. Estudos anteriores usados dissecado região do tronco inteiro entre o opercula e poros anal 16. Esta preparação, embora contendo gónadas, consiste em vários tecidos e órgãos. Em alternativa, os animais transgénicos com expressão da GFP específica para-gonadal, tais como vasa: EGFP foram usadas para o isolamento de tecido gonadal através de células activadas por fluorescência (FACS) e captura de laser de micro-dissecção 17, 18. Mas a sua aplicação generalizada é limitado. Aqui, descrevemos um procedimento simples para isolar o tecido gonadal dos peixes-zebra larval em 17 dpf e 25 dpf. Nós demonstramos a posição das gónadas no que diz respeito a outros órgãos e isolar as gónadas morfologicamente intactas a partir dos tecidos circundantes. Mostramos ainda mais os genes específicos de gónadas, tais como vasos e cyp19a1a são altamente expresso nas gônadas isolado em comparação com o tecido do tronco por meio de PCR quantitativa (qPCR) análise. O presente protocolo permite a identificação, o isolamento, a purificação de ARN e amplificação de genes específicos gonadais de peixe-zebra larval, permitindo assim a análise molecular subsequente de tecido gonadal 19.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Para incubação de embriões</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>Para 1 L necessário: adicionar 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl e 2,9 g de CaCl&#183; 2H2O; em seguida, adicione 0,41 g de KH2PO4, 0,412 g de Na2HPO4 anidro e 4,9 g de MgSO4&#183; 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>Diluir 20x EM em água destilada</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gene</td><td>121985</td><td>Para preparar as placas de ágar 2%</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Para isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Vidro do medidor</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>Para preparar as placas de ágar 2%</td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>Para aquecer o ágar</td></tr><tr><td>Pinça DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>para dissecação</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Para dissecação</td></tr><tr><td>Equipamento de água pura</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' s Para</td><td></td><td></td><td>1 L necessário: Adicionar 6,78 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 0,26 g de CaCl2 e 1,19 g de Hepes; em seguida, encher até 1 L; Ajuste o pH para 7,2. Esterilizar por filtração e manter em um recipiente de policarbonato transparente autoclavado.</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Banho de metal</td><td>Microscópio QiLinbeier</td><td></td><td>Modelo GL-150</td></tr><tr><td>Leica</td><td>&nbsp;</td><td>M205 FA</td><td>Para Centrífuga Fotomicrográfica</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de RNA em Micro Escala</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Para isolamento de RNA de tecidos gonadares</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>Para digestão de DNA na solução de RNA</td></tr><tr><td>RevertAid Kit de Síntese de cDNA de primeira fita</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Para síntese de cDNA de primeira fita</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>Para digerir o RNA residual na solução de cDNA.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Este produto é um master mix 2x baseado em Taq DNA polimerase para PCR em tempo real e&nbsp; aplicável para ensaio de intercalação com SYBR Green I.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Medindo a concentração do RNA total</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Perfil</td><td>de expressão gênica de Hamburgo</td></tr></tbody></table>

dissecção de larval zebrafish gonadal tissue

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Embora peixe-zebra selvagem possuem um / ZW sistema de determinação do sexo ZZ, peixe-zebra domesticados perderam do cromossoma sexual. Eles utilizam um sistema de determinação do sexo poligénica, onde vários genes distribuídos ao longo do genoma determinar colectivamente as identidades do sexo de cada peixe. Atualmente, os genes envolvidos na regulação do desenvolvimento das gônadas e como eles funcionam ainda imperceptíveis. Normalmente, o isolamento de tecido gonadal é o primeiro passo para examinar os processos de desenvolvimento sexuais. Aqui, nós apresentamos um processo para isolar tecido gonadal de 17 dpf (dias após a fertilização) e 25 dpf larvas de peixe-zebra. O tecido gonadal isolado pode ser posteriormente examinada por morfologia e a expressão do gene de perfis.

Dissecções das gónadas foram realizadas na AB strain peixe-zebra larval. A Figura 1 mostra tecido gonadal típico de peixe-zebra de larvas no 17 dpf e 25 dpf. Em primeiro lugar, a pele e os músculos de um lado do abdômen é cortado para expor os órgãos internos. Depois de retirar a massa dos órgãos internos, a bexiga natatória, juntamente com a gônada permanecer no tronco. O gonadal foi ligado ao lado ventral da bexiga natatória (seta na F...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de tecido gonadal dos peixes-zebra larval, o que irá facilitar as investigações de diferenciação sexual peixe-zebra e manutenção.

Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o tecido gonadal de filhotes de peixe-zebra e analisar as propriedades moleculares do tecido isolado. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo do desenvolvimento sexual do peixe-zebra, como a conservação de genes na regulação do desenvolvimento da gônada e os fundamentos moleculares do desenvolvimento sexual do peixe-zebra. A principal vantagem desta técnica é que tecidos gonadais de filhotes de peixe-zebra tão precoces quanto 17 dias após a fertilização podem ser dissecados para avaliar o estado celular e biológico molecular.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao tamanho pequeno e à remodelação dinâmica dos tecidos gonadais em peixes-zebra larvais. Para se preparar para a dissecação gonadal, transfira dois peixes-zebra adultos machos e dois fêmeas para cada lado de um tanque de cruzamento dividido. Na manhã seguinte, renove a água do tanque e remova a barreira para iniciar o acasalamento.Uma a duas horas após a fertilização, colete e transfira cerca de quarenta ovos para uma placa de 100 milímetros com 40 mililitros de meio embrionário, ou EM. Incube os embriões a 28,5 graus Celsiu

dissection-of-larval-zebrafish-gonadal-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve um procedimento para identificar e dissecar os órgãos do peixe-zebra adulto.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Este artigo descreve uma abordagem para microdissect retinas zebrafish com e sem epitélio pigmentar da retina em anexo, 1-3 embriões dia postfertilization.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Um método, claro padronizados para dissecção e isolamento do coração zebrafish em vários estágios de desenvolvimento são descritos. Técnicas de anotação e quantificação também são discutidos.

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

Apresentamos um novo método de microgavagem de larvas de peixe-zebra utilizando equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia. Demonstramos que a microgavagem é uma técnica segura e eficiente, útil para administrar quantidades controladas de diversos materiais diretamente na luz intestinal de larvas de peixe-zebra.

Microgavage de larvas do peixe

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o sulco superior e ocular, uma estrutura recentemente identificada, conservado evolutivamente no olho vertebrado. Usando zebrafish larvas, demonstraremos técnicas necessárias para identificar os fatores que contribuem para a formação e o fechamento do sulco superior ocular.

Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.

Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Este é um método comumente usado para a dissecção de gônadas de C. elegans seguida de quebra por congelamento, que produz amostras da linha germinativa para imunofluorescência via coloração de anticorpos ou para coloração DAPI simples para visualizar o DNA. Este protocolo tem sido bem sucedido para estudantes de graduação em um laboratório de pesquisa e em uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso.

C. elegans Dissecção de Gônadas e Congelamento de Fissuras para Imunofluorescência e Coloração DAPI

Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Aprenda a dissecar tecido gonadal de larvas de Danio rerio para análise molecular. Este método permite estudar diferenciação sexual em peixes-zebra desde 17 dias pós-fertilização.

Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

Explorar mais vídeos