Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

O objetivo deste procedimento é preparar andaimes celulares tridimensionais biodegradáveis semelhantes a espuma com base em elastômeros de cristal líquido de cadeia lateral biocompatíveis. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de cristal líquido e biomédicos, como os efeitos das propriedades do elastômero de cristal líquido na proliferação e alinhamento celular. A principal vantagem deste método de scaffolds celulares bidimensionais é que ele permite o estudo de interações espaciais célula-célula, o que raramente é possível em macroambientes 2D.

Geralmente, aqueles que são novos neste método terão dificuldades com os testes de compressão tátil. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez depois de ter que mudar a mídia em centenas de placas de Petri. Nós nos perguntamos se os elastômeros de cristal líquido poderiam suportar células musculares em uma rede 3D, para eliminar o uso de tantas placas de Petri.

A demonstração visual desse método é crítica, pois algumas etapas exigem uma manipulação cuidadosa de produtos químicos. Além disso, moldar o modelo de espuma de metal pode ser um desafio. Primeiro, encha uma ampola de 20 mililitros com uma solução de 2% em volume de PFOTES em tolueno.

Agite a solução na ampola por 24 horas para silanizar o interior da ampola. Enxágue a ampola silanizada com álcool isopropílico e seque-a a 140 graus Celsius por 30 minutos. Coloque 3,64 gramas de épsilon-caprolactona destilada, 0,5 gramas de alfa-cloro-épsilon-caprolactona e 0,25 mililitros de glicerol na ampola seca.

Vortex a mistura por um minuto. Em seguida, adicione 4,90 gramas de DL-lactídeo à mistura e purgue a atmosfera da ampola com gás nitrogênio por um minuto. Cubra a abertura da ampola com papel alumínio e aqueça a mistura a 120 graus Celsius por cerca de duas horas para derreter o DL-lactídeo.

Vórtice a mistura para romper quaisquer sólidos não derretidos e, em seguida, adicione 66 microlitros de 10-2-etilhexanoato à ampola e vórtice novamente. Feche a ampola com papel alumínio e aqueça a mistura a 120 graus Celsius por 10 minutos para derreter novamente o DL-lactídeo. Assim que o DL-lactídeo derreter novamente, vortex vigorosamente a mistura e purgue a atmosfera da ampola com gás nitrogênio.

Sele a ampola com um septo de borracha. Insira uma agulha conectada a uma linha de vácuo através do septo e inicie o vácuo. Sele o gargalo da ampola, tomando cuidado para não derreter a rolha de borracha.

Assim que o gargalo estiver selado, aqueça a mistura de reação a 140 graus Celsius por 48 horas. Em seguida, deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente. Abra a ampola e dissolva a mistura de reação viscosa em 10 mililitros de diclorometano.

Transferir a mistura para uma ampola de separação. Coloque um frasco contendo 100 mililitros de metanol em um banho de gelo seco e acetona para resfriar o metanol a aproximadamente 78 graus Celsius negativos. Uma vez arrefecido o metanol, fixar a ampola de separação sobre o balão.

Adicione a mistura de reação ao metanol frio a uma taxa de duas gotas a cada segundo. Recolha o precipitado branco resultante em papel de filtro. Seque o precipitado em um forno a vácuo entre 50 e 60 graus Celsius para obter o produto alfa-cloro SBC de três braços.

Para preparar o SBC de três braços alfa colesterol, o átomo de cloro pendente é substituído por uma azida. Uma reação de clique com 5-hexinoato de colesterol resulta em um colesteril pendente como porção de cristal líquido. Para começar a preparar o andaime de elastômero de cristal líquido, combine 0,75 gramas de SBC de três braços de alfa-colesterol com 0,25 mililitros de HDI e 0,24 mililitros de épsilon-caprolactona destilada.

Adicione a isso 60 microlitros de 10-2-etilhexanoato e vortex a mistura. Em seguida, corte um pedaço de um centímetro por quatro centímetros de espuma de níquel metálico. Enrole a espuma de níquel em um cilindro de um centímetro de diâmetro e um centímetro de altura para formar um modelo para o andaime de espuma de elastômero de cristal líquido.

Coloque o molde em um frasco de vidro ou invólucro de papel alumínio e despeje a mistura de elastômero de cristal líquido sobre o molde até que esteja completamente coberto. Deixe o molde descansar na mistura de elastômero de cristal líquido por dois minutos e, em seguida, remova o excesso com uma pipeta. Aqueça a mistura e o molde a 80 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, retire a folha de alumínio ou quebre o vidro. Use uma lâmina de barbear para remover o excesso de elastômero de cristal líquido para expor o modelo de metal de níquel. Coloque a espuma em um frasco e adicione 70 mililitros de uma solução aquosa saturada de ferro três cloreto.

Mexa a espuma na solução por três dias em temperatura ambiente para dissolver o molde de níquel. A cada 24 horas, mexa a espuma em água deionizada por 30 minutos e, em seguida, volte a mexer em uma solução fresca de ferro e três cloretos. Após o segundo dia de agitação, efectue um ensaio de compressão táctil na espuma de elastómero de cristais líquidos.

A resistência à compressão tátil indica que o molde de níquel ainda está presente na espuma. Após o terceiro dia, todo o molde de níquel foi eliminado e a espuma resultante parece muito macia e fácil de comprimir totalmente. O gabarito de níquel deve ser completamente eliminado.

É importante enxaguar bem a espuma de elastômero de cristal líquido em cloreto de ferro até que esteja macia ao toque quando um teste de compressão tátil for realizado. O andaime de espuma de elastômero de cristal líquido está agora pronto para ser caracterizado e usado. Quando a espuma de elastômero de cristal líquido estiver macia, enxágue-a com etanol a 70% para esterilizá-la.

Para iniciar o procedimento de semeadura, lave novamente os andaimes de espuma de elastômero de cristal líquido duas vezes em um mililitro de etanol a 70% para esterilizar as superfícies de elastômero. Em seguida, irradie os andaimes com luz UV por 10 minutos. Lave os andaimes com outra porção de um mililitro de etanol a 70%.

Enxágue os andaimes com um mililitro de água estéril e solução salina tamponada com fosfato. Carregue os andaimes de elastômero de cristal líquido esterilizados em placas de cultura de 24 poços. Preparar e contar uma suspensão das células de interesse no meio de crescimento celular apropriado com penicilina e estreptomicina.

Dilua a suspensão celular para 1,5 vezes 10 elevado à quinta célula por 100 microlitros usando meio de crescimento. Deposite uma gota de suspensão de célula diluída em cima de cada andaime de elastômero de cristal líquido. Incube os andaimes de elastômero de cristal líquido semeados a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de CO2 por duas horas.

Adicione mais 0,5 mililitros de meio de crescimento a cada andaime e continue a incubação. A cada 48 horas, lave os andaimes semeados com um mililitro de PBS e adicione meio de crescimento fresco. Continue incubando os andaimes até que as células estejam prontas para a microscopia.

Esses LCs esméticos permitem o estudo de construções complexas de tecidos, promovendo o crescimento e a proliferação celular. Para manter a viabilidade celular, as espumas devem ser esterilizadas e a limpeza das culturas mantida em todos os momentos. Para se preparar para a microscopia, fixe as células nos andaimes com uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS por 15 minutos.

Mergulhe as amostras três vezes em três mililitros de PBS por cinco minutos. Coloque uma amostra de andaime em um tubo Eppendorf. Manchar a amostra com uma solução de DAPI a 0,1% em 500 microlitros de PBS por 10 minutos.

Mergulhe a amostra duas vezes em um mililitro de PBS por cinco minutos. E então, imediatamente imagem da amostra com microscopia confocal. Adquira pilhas de imagens abrangendo a amostra e analise os dados em um programa de processamento de imagens.

Um SBC de três braços com porções de cristal líquido foi fundido em um molde de espuma de níquel com HDI como reticulador. O molde de níquel foi removido por condicionamento para obter a espuma de elastômero de cristal líquido. O teste de deformação por compressão foi realizado periodicamente para monitorar o processo de gravação.

Uma vez que o níquel foi completamente dissolvido, o teste de deformação por compressão mostrou uma redução de 70% no tamanho quando comprimido. Ao liberar a compressão, a espuma de elastômero de cristal líquido recuperou consistentemente seu tamanho e forma originais. Esse comportamento é atribuído às porções de cristal líquido, pois espumas de elastômero semelhantes sem a porção de colesterol épsilon-caprolactona não se recuperaram da compressão.

O SCM da morfologia interna da espuma mostrou uma rede interconectada de hastes ocas de espuma. A morfologia regular foi atribuída à estrutura da espuma de níquel, indicando que o tamanho dos poros e a forma geral podem ser controlados pela seleção de um molde de metal apropriado. A espuma foi semeada com células de neuroblastoma, que se fixaram nas paredes da rede em dois dias.

30 dias após a semeadura, a microscopia confocal revelou que as células se estendiam sobre a rede de elastômeros de cristal líquido e formaram várias camadas dispersas por toda a espuma de elastômero. O alongamento dos núcleos celulares foi observado e foi correlacionado ao alinhamento celular. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita dentro de três a quatro semanas, se executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e preparar andaimes de células de elastômero de cristal líquido com tamanhos e morfologias de poros específicos. Ao tentar este procedimento, é importante caracterizar completamente cada produto e monitorar a viabilidade e expansão celular. Além disso, a técnica de coloração adequada é importante para adquirir facilmente imagens de microscopia confocal.

Após este procedimento, os elastômeros de cristal líquido também podem ser expostos a estímulos externos, como estresse ou campos magnéticos e elétricos, para responder a perguntas adicionais sobre como a ordenação molecular anisotrópica dos elastômeros de cristal líquido afeta a resposta celular. As implicações desta técnica se aplicam ao estudo de processos de doenças, pois fornece uma plataforma para estudar dinamicamente os efeitos de agentes externos na atividade simulada da doença e nos processos de reparo subsequentes. Embora esta espuma de elastômero de cristal líquido esmética possa fornecer informações sobre as interações célula-célula, ela também pode ser usada com outros materiais, como semicondutores ou nanoestruturas metálicas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em áreas biomédicas projetarem plataformas experimentais de longo prazo espelhando sistemas vivos.