En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

É descrito um procedimento para preparar preparações en face da artéria carótida e da aorta do rato. Tais preparações, quando imunofluorescentemente coradas com anticorpos específicos, permitem estudar a localização de proteínas e a identificação de tipos de células dentro de toda a parede vascular por microscopia confocal.

O objetivo geral deste procedimento é preparar a aorta e a artéria carótida do camundongo para a coloração imunológica face após a ligadura da artéria carótida esquerda. Este método nos permite estudar a organização, a expressão de cada proteína e o possível estado das células antrais e outras células vasculares em métodos de coloração imunológica. As preparações faciais permitem a análise de grandes áreas nos vasos sanguíneos para a avaliação da diferença regional na expressão de vários parâmetros celulares normais e possíveis.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Quaico, um microcirurgião do nosso grupo. Comece colocando o mouse anestesiado em uma placa cirúrgica em decúbito dorsal. Depois de confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, prenda as patas dianteiras na prancha na posição esticada e ambas as patas traseiras no lado direito do mouse para expor ao lado esquerdo do pescoço.

Remova os pelos ao redor da região cervical e desinfete a pele exposta. Cubra o camundongo com uma cortina cirúrgica esterilizada com um orifício sobre a região cirúrgica e aplique pomada nos olhos do animal. Mova o mouse sob o microscópio de dissecação e faça uma incisão na linha média ventral ao redor da área cervical.

Reposicione as glândulas salivares que cobrem os vasos sanguíneos no lado esquerdo do animal para expor a artéria carótida comum esquerda, que se bifurca na artéria carótida interna esquerda e na artéria carótida externa esquerda. Remova suavemente o tecido conjuntivo ao redor e abaixo da artéria carótida interna esquerda e use uma pinça para passar um comprimento de 2,5 centímetros de sutura de seda pré-cortada de seis O sob a artéria, usando uma segunda pinça para puxar a sutura aproximadamente um terço de seu comprimento para o outro lado do vaso. Ligue a artéria carótida interna esquerda.

Em seguida, remova o tecido conjuntivo ao redor da artéria carótida externa esquerda, como acabamos de demonstrar, e faça uma ligadura proximal à artéria tireóidea superior esquerda. Quando todas as artérias, exceto a artéria occipital, tiverem sido ligadas, retorne as glândulas salivares às suas posições originais e hidrate o campo cirúrgico com duas a três gotas de solução salina. Em seguida, use seis suturas de vicryl revestidas com O para fechar a pele e coloque o camundongo na gaiola pré-aquecida com monitoramento até a decúbito total.

No final do experimento, prenda o camundongo em decúbito dorsal em uma placa de dissecação e use uma tesoura de íris para expor a cavidade abdominal com uma incisão na linha média. Corte as costelas lateralmente ao esterno para expor a cavidade torácica. Em seguida, corte a artéria femoral e insira uma agulha de calibre 26 presa a uma profusão de gravidade instalada no ápice do ventrículo esquerdo para profundir o sistema circulatório com solução salina suplementada com heparina.

Continue a profusão até que a solução salina que flui do corte fique clara. Em seguida, mude o sistema de profusão de solução salina para paraformaldeído a 4% em PBS. Após cinco minutos, mova o camundongo sob o microscópio de dissecação e use uma tesoura e uma pinça de ponta romba para colher a aorta e as artérias carótidas esquerda e direita.

Em seguida, transfira os tecidos para uma placa de Petri de PBS e remova cuidadosamente a gordura e os tecidos conjuntivos, seguido pela separação e divisão longitudinal da aorta e das artérias carótidas para expor o endotélio. A coisa mais importante a lembrar ao fazer preparações de vasos sanguíneos faciais é que as células endoteliais são facilmente danificadas pelo manuseio brusco. Não estique os recipientes em nenhum momento, especialmente durante as etapas de colheita e limpeza.

Em seguida, transfira cada vaso para poços individuais de uma placa de 12 poços contendo 0,5 mililitros de solução permeabilizante por poço. Permeabilize os vasos sanguíneos por 10 minutos com balanço em temperatura ambiente, seguido de uma breve lavagem em PBS. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com uma incubação de 30 minutos em soro normal a 10% da mesma espécie que os anticorpos secundários planejados em TTBS, com balanço à temperatura ambiente.

Em seguida, rotule as amostras com os anticorpos primários de interesse diluídos em TTBS com soro normal a 10% durante a noite com balanço a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, enxágue os vasos sanguíneos com três lavagens de 10 minutos em TTBS com balanço à temperatura ambiente, seguidas de incubação nos anticorpos secundários apropriados diluídos em TTBS e soro normal a 10% e dappy. Retorne as amostras para o balancim e a tampa para proteger da luz.

Após uma hora em temperatura ambiente com balanço, lave as amostras três vezes em TTBS fresco, conforme demonstrado, seguido de um breve enxágue em PBS, e coloque uma gota de reagente antidesbotamento por recipiente em vidros individuais de 22 por 50 milímetros. Sob um microscópio, coloque um recipiente em cada gota de reagente com o endotélio voltado para baixo e cubra os vasos com uma lâmina de vidro de 22 por 75 milímetros por amostra. Coloque as lâminas em um lenço de laboratório limpo e cubra-as com dois pedaços de lenço de laboratório e 3,5 kg de peso para achatar os recipientes.

Após no máximo cinco minutos, remova o peso e limpe o excesso de solução ao redor das lamínulas. Em seguida, aplique o esmalte nos quatro cantos das lamínulas e coloque as lâminas em uma caixa de slides, com a lamínula voltada para cima. Na manhã seguinte, use mais esmalte para selar completamente as lamínulas e faça a imagem dos recipientes assim que o esmalte estiver seco.

Aqui, é mostrada uma imagem típica de imunoflorescência facial de dupla coloração endotelial com anticorpos anti caderina VE e molécula de adesão celular antivascular um e ilustrando uma única seção óptica de uma aorta de camundongo tirada perto da abertura de uma artéria intercostal. Observe a coloração de contorno linear verde na junção de aderência das células endoteliais e a forte coloração da molécula de adesão de células antivasculares na abertura da artéria intercostal, onde o fluxo sanguíneo perturbado é conhecido por ocorrer. Nessas imagens, pode-se observar a coloração face de uma carótida esquerda parcialmente ligada e de uma artéria direita controle não ligada um dia após a cirurgia, com uma molécula de adesão anticelular aumentada uma coloração aparente no vaso ligado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer uma ligadura parcial da artéria carótida esquerda e fazer preparações faciais em vasos sanguíneos de camundongos. Leve isso com sua ótica para outros pequenos animais. O uso de preparações faciais agora está limitado à coloração de imunoflorescência, mas também pode ser usado com outros métodos, como para estudo de regiões inteiras após coloração de oriole ou para experimentos de contador ex vivo.