Perfil de Expressão com Microarrays

Microarrays de DNA são ferramentas amplamente utilizadas para medir simultaneamente a expressão de muitos genes diferentes. Eles consistem em milhares de sondas — cada uma representando um gene diferente — imobilizados em "chips" ou slides, e dependem de hibridização complementar para avaliar a expressão genética em diferentes condições biológicas.

Este vídeo abordará os princípios básicos da tecnologia de microarray, um protocolo para perfil de expressão genética usando microarrays, e algumas aplicações atuais.

Vamos começar discutindo os princípios da expressão genética e da tecnologia de microarray.

Um dos primeiros métodos desenvolvidos para avaliar a expressão genética em amostras biológicas é a mancha do Norte, que envolve "sondagem" para moléculas específicas de RNA imobilizadas em membranas. As sondas "free-floating" reconhecem sequências complementares de RNA na amostra, e são tipicamente rotuladas com moléculas radioativas ou fluorescentes para que possam ser visualizadas.

Avanços na microfabização, sequenciamento de genomas e outras tecnologias levaram ao desenvolvimento do biochip de microarray. Como as manchas do norte, as microarrays são baseadas no princípio da ligação complementar entre as sequências de ácido nucleico da sonda e da amostra. Ao contrário dos nortes, no entanto, em microarrays são as sondas oligonucleotídeos que são imobilizadas em um escorregador de vidro ou chip. As amostras "flutuantes livres" são geradas a partir de RNA isolado de células ou organismos de interesse, que é transcrito reverso para dna complementar ou "c". Isso pode ser diretamente rotulado com moléculas fluorescentes, ou suas quantidades podem ser amplificadas por transcrição in vitro em cRNA. A amostra é então hibridizada para o chip. Como as sondas em microarrays projetadas para diferentes aplicações podem ser "sentido", o que significa que suas sequências estão na mesma direção que o RNA expresso de um organismo, ou "antissense", os pesquisadores devem garantir que a direcionalidade da amostra seja complementar à das sondas.

Os dados de intensidade de fluorescência "crua" para cada ponto específico do gene no chip podem então ser quantificados e processados. Os dados podem ser submetidos a testes estatísticos adicionais, como o teste t do Aluno, para determinar se os sinais de fluorescência — e, portanto, níveis de expressão — para um gene de interesse são significativamente diferentes entre dois tipos de células ou condições experimentais.

Os pesquisadores também podem usar esses dados para "agrupar" ou agrupar genes com base em padrões de expressão semelhantes. Por exemplo, ao comparar padrões de expressão entre duas populações celulares, certos genes podem ser encontrados para demonstrar mudanças de expressão em quantidades aproximadamente equivalentes na mesma direção, e assim seriam agrupados. Os pesquisadores podem retratar essas relações em um tipo de diagrama de árvore ou "dendrograma" onde alturas e arranjos de "ramos" indicam o quão semelhantes — ou diferentes — padrões de expressão genética são. Esse tipo de análise pode fornecer insights sobre redes genéticas, já que genes "agrupados" podem participar das mesmas vias biológicas.

Agora que discutimos os princípios da metodologia da microarray, vamos dar uma olhada em um típico experimento de microarray.

Para garantir a qualidade do RNA isolado, os espaços de trabalho e equipamentos devem ser tratados com produtos químicos que inativam RNases — enzimas que de outra forma destruiriam o RNA. O RNA é então isolado de amostras de interesse e purificado, e sua concentração e integridade são determinadas através da espectrofotometria.

Esta amostra de RNA é convertida em cDNA e, em seguida, cRNA. Em seguida, a amostra é rotulada com moléculas fluorescentes e fragmentadas, e sua qualidade e quantidade podem ser novamente verificadas, momento em que a extensão da rotulagem fluorescente também pode ser avaliada.

O cRNA rotulado é então misturado com "solução de hibridização" antes de carregar em uma microarray. Para facilitar a hibridização bem-sucedida, um "misturador" é colocado no chip para formar "câmaras de hibridização". A mistura de hibridização é então adicionada lentamente à matriz. Deve-se tomar cuidado para evitar bolhas de ar, pois estas podem interferir na ligação da amostra a regiões específicas da microarray, e resultar em um falso sinal negativo. Uma vez adicionada a amostra, os chips são incubados na temperatura apropriada por até 24 horas.

Após a hibridização, a batedeira é removida do chip, a amostra desvinculada é lavada, e a matriz é completamente seca por centrifugação em uma centrífuga especializada, de retenção de slides. O chip seco é inserido em um scanner de microarray, e a máquina é ajustada para que os sinais mais brilhantes observados em um chip não sejam supersaturados. A microarray é então digitalizada, e uma imagem de todo o chip produzido.

Uma vez que o chip tenha sido digitalizado, o arquivo de imagem é carregado em software de extração de dados e avaliado por quaisquer irregularidades de sinal. Os dados extraídos da imagem da microarray são submetidos a uma série de manipulações estatísticas, incluindo a transformação do log_2, que permite aos pesquisadores retratar numericamente dados em termos de aumentos ou diminuição da expressão genética; bem como a normalização, que explica as diferenças de sinal entre chips de microarray. Esses dados processados podem então ser analisados.

Agora que demonstramos como o perfil de expressão com microarrays é realizado, vamos ver como microarrays podem ser usados em experimentos específicos.

Pesquisadores frequentemente empregam microarrays para avaliar como a expressão genética muda ao longo de um processo biológico, como a diferenciação celular. Aqui, os cientistas avaliaram os níveis de microRNAs, que são pequenos RNAs de 22 nucleotídeos envolvidos na expressão genética de ajuste fino, em três tipos de células humanas representando diferentes estágios do desenvolvimento da retina. Ao comparar a expressão do microRNA entre essas células, os pesquisadores conseguiram identificar genes potencialmente envolvidos na diferenciação e desenvolvimento do tecido retiniano.

Microarrays também podem ser usados para avaliar diferenças de expressão entre diferentes células ou tipos de tecidos. Neste experimento, um modelo de roedor de transtorno de estresse pós-traumático, ou TEPT, foi estabelecido expondo ratos a choques elétricos. Os neurônios foram coletados de diferentes regiões cerebrais e o RNA foi isolado. As microarrays foram então utilizadas para identificar a expressão diferencial de genes associados a mitocôndrias nesses neurônios, fornecendo uma visão dos complexos mecanismos moleculares por trás do TEPT.

Finalmente, pesquisadores também estão aplicando microarrays em estudos de câncer, na esperança de que novos biomarcadores de doenças possam ser identificados. Como resultado de infecções por vírus ao longo de nossa evolução, os genomas humanos contêm sequências genéticas virais referidas como "retrovírus endógenos" ou ERVs, algumas das quais ainda são ativamente expressas. Aqui, a expressão de ERVs em tecidos cancerígenos e normais da próstata foram comparadas usando microarrays. Esse método permitiu aos pesquisadores identificar vários ERVs que foram regulados no câncer de próstata, tornando-os potenciais biomarcadores que podem ser usados para diagnosticar doenças.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre perfil de expressão genética usando microarrays. Este vídeo abordou os princípios básicos da tecnologia de microarray, um protocolo de perfil de expressão e aplicações dessa técnica. Como sempre, obrigado por assistir!