3: Análise de metilação do DNA

A metilação do DNA é uma modificação química do DNA que afeta a expressão gênica em diferentes contextos celulares. Muitos pesquisadores estão interessados no mecanismo e nas funções desse processo, pois a metilação aberrante do DNA tem sido associada a doenças como o câncer.

Neste vídeo, abordaremos os princípios por trás da metilação do DNA e os métodos para detectá-la. Em seguida, exploraremos um protocolo geral para um desses métodos, análise de bissulfito e algumas aplicações dessa técnica.

Primeiro, vamos dar uma olhada no que é a metilação do DNA e como ela pode ser detectada.

Durante esse processo bioquímico, uma célula adiciona uma etiqueta química conhecida como grupo metil às bases de citosina em seu DNA. A maioria das citosinas metiladas ocorre próxima a bases de guanina na mesma fita de DNA, e esses nucleotídeos adjacentes - e a ligação fosfodiéster que os liga - são chamados de ?CpGs. Embora a maioria dos CpGs vertebrados seja metilada, aqueles que não são metilados tendem a ocorrer próximos uns dos outros em ?ilhas? perto dos promotores de genes expressos ativamente e vários outros elementos de sequência regulatória.

Como as mudanças na metilação do DNA contribuem para a regulação gênica ainda é um assunto de intensa investigação. A metilação das ilhas CpG parece ser importante para o silenciamento gênico estável e de longo prazo observado em processos epigenéticos, como o imprinting genômico, que é a expressão específica do pai de origem de certos genes, bem como a inativação do cromossomo X, o silenciamento de um dos dois cromossomos X em cada célula de mamíferos fêmeas. A repressão de genes críticos devido à metilação aberrante das ilhas CpG também demonstrou contribuir para o crescimento celular descontrolado, o que pode levar ao câncer. Mecanicamente, a metilação do DNA pode contribuir para o silenciamento de genes, impedindo que os fatores de transcrição se associem aos promotores ou recrutando proteínas que modificam histonas e remodelam a cromatina em um estado transcricionalmente não permissivo.

Existem vários métodos para detectar o estado de metilação do DNA.

Uma técnica, o ensaio HELP, envolve duas endonucleases de restrição chamadas HpaII e MspI, que respectivamente clivam apenas sequências CCGG não metiladas, ou metiladas e não metiladas. Ao comparar os padrões de digestão produzidos por essas duas enzimas, o estado de metilação do DNA pode ser deduzido.

Outro método, chamado imunoprecipitação de DNA metilado ou ? MeDIP,? usa anticorpos que se ligam a citosinas metiladas para enriquecer sequências de DNA metiladas.

Finalmente, a análise de bissulfito é usada para distinguir a citosina metilada da não metilada no DNA, realizando uma reação química que converte a citosina não metilada em uracila. Após essa conversão, o DNA tratado com bissulfito pode ser submetido a PCR, sequenciado e comparado a um genoma de referência. As citosinas não metiladas são aquelas que estão presentes na referência, mas substituídas por timinas após análise de bissulfito e PCR. Ao submeter o DNA tratado com bissulfito à espectrometria de massa, os pesquisadores também podem criar "epigramas de metilação", que representam linearmente diferentes CpGs no genoma e descrevem o grau de metilação em cada um deles. Esses epigramas são particularmente úteis se os pesquisadores desejam comparar os padrões de metilação entre diferentes tipos de células.

Vamos agora dar uma olhada em profundidade no protocolo para análise de bissulfito.

Para começar, o hidróxido de sódio é adicionado às preparações de DNA genômico, que são então incubadas a 95 ° C. Isso desnatura o DNA e torna suas bases acessíveis a reações químicas subsequentes. O metabissulfito de sódio é então introduzido na mistura de DNA desnaturado e duas etapas de reação química ocorrerão. Durante a primeira etapa, sulfonação, um grupo sulfito é adicionado a uma citosina não metilada para formar sulfonato de citosina. Então, durante a desaminação hidrólica, um grupo amino é removido do sulfonato de citosina para gerar sulfonato de uracila.

Para facilitar esses primeiros estágios da reação química, a preparação do DNA é sobreposta com óleo mineral, que evita a evaporação e ajuda a manter a concentração de metabissulfito de sódio. A reação é então incubada aos 55? C no escuro. Durante esta etapa, um agente para evitar a oxidação, como o quinol, também é adicionado à mistura.

Para coletar DNA modificado contendo sulfonato de uracila e sem óleo mineral, a mistura é centrifugada e a camada líquida mais baixa recuperada. O DNA nesta solução é então purificado.

Em seguida, o hidróxido de sódio é adicionado à mistura de DNA, que é então incubada a 37 ° C. Isso é feito para induzir a dessulfonação, que - como você deve ter adivinhado - remove o grupo sulfito do sulfonato de uracila, formando uracila e completando a reação química.

Finalmente, a mistura é neutralizada com a adição de acetato de amônio e o DNA é coletado por precipitação de etanol. Uma vez que o DNA convertido em bissulfito tenha sido purificado, ele é submetido a PCR e sequenciamento.

Agora que discutimos a técnica básica para análise de bissulfito, vejamos algumas aplicações experimentais.

Alguns pesquisadores usam a análise de bissulfito para investigar o imprinting genômico. Aqui, os pesquisadores cruzaram duas cepas de Arabidopsis com diferenças genéticas, para que o DNA materno e paterno pudessem ser distinguidos. Os padrões de metilação nos embriões resultantes e no endosperma associado, ou no tecido que sustenta o embrião, foram então comparados. Usando esse método, os cientistas descobriram que os CpGs no alelo materno de um gene codificador de proteínas, MEA, tendiam a ser metilados em embriões, mas não metilados no endosperma, indicando impressão específica do tecido.

Outros pesquisadores estão usando essa técnica para entender como fatores ambientais ou sociais podem alterar os padrões de metilação. Aqui, os filhotes de camundongos foram separados de suas mães para induzir o estresse, e seus tecidos cerebrais foram posteriormente isolados. Após o sequenciamento do DNA tratado com bissulfito, os cientistas determinaram que os padrões de metilação em um gene codificador de hormônio, AVP, mudaram em uma região específica do cérebro em ?separados? filhotes, sugerindo um possível mecanismo molecular para efeitos biológicos de longo prazo da experiência no início da vida.

Finalmente, muitos pesquisadores estão tentando otimizar a análise de bissulfito para facilitar a comparação de padrões de metilação entre células individuais e únicas. Aqui, os pesquisadores modificaram o método de análise de bissulfito para que todas as etapas fossem realizadas em oócitos individuais de camundongos embebidos em agarose, o que ajudou a proteger contra a perda de DNA. Usando esse método, os pesquisadores foram capazes de identificar facilmente amostras de um único oócito que haviam sido contaminadas com outras células, procurando aquelas que davam vários padrões de metilação.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre análises sensíveis à metilação. Aqui, discutimos o papel que a metilação do DNA desempenha na regulação gênica, métodos que os pesquisadores usam para identificar regiões metiladas no genoma, um protocolo generalizado para análise de bissulfito e, finalmente, algumas aplicações dessa técnica. Como sempre, obrigado por assistir!