Name: Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a identificar grânulos de estresse em células de mamíferos usando imunofluorescência e hibridização in situ fluorescente. Este protocolo validado permite distinguir grânulos de estresse de outros focos citoplasmáticos de forma precisa.

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Agradecemos aos membros dos laboratórios Ivanov e Anderson por sua útil discussão e feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [GM111700 e CA168872 para PA, NS094918 para PI], o National Science Centre na Polônia [concessão UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 para WS]. WS também reconhece o Ministério da Ciência e Educação Superior na Polônia (Programa Mobility Plus) ea Comissão Fulbright polonesa-americana por seu apoio financeiro de sua pesquisa nos EUA.

1. Preparação da Célula <ol><li> Adicionar lamínulas autoclavadas a 12 poços de uma placa de 24 poços, como indicado na Figura 1A ; Isso pode ser feito usando uma pipeta estéril Pasteur anexado a um vácuo para pegar cada lamínula. Toque suavemente a lamela no lado do poço para liberar a sucção, permitindo que a lamela para cair no poço. </li><li> Placa 1 x 10 5 células de osteosarcoma U-2 OS (U2OS) por poço a um volume final de 500 μL de meio. Mova a placa lado a lado e para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células são distribuídas uniformemente. </li><li> Suavemente pressione os lamínulas para baixo com uma ponta P1000 limpa para garantir que a lamela está no fundo do poço e que não há bolhas sob a lamela. </li></ol> 2. Estressando as Células <ol><li> No dia seguinte, verifique visualmente a placa para assegurar que as células estejam uniformemente dispersas e uniformemente confluentes através da lamela, uma vez que variações entre saPodem afetar adversamente a reprodutibilidade dos resultados. Use um objetivo 10X em um microscópio de cultura de tecido invertido. </li><li> Pré-aqueça o meio a 37 ° C. Evite aplicar meios frios ou quentes nas células, pois estas causam choque frio ou choque térmico, respectivamente. </li><li> Diluir drogas em meios pré-aquecidos. Para cada concentração de fármaco diferente, preparar 2 poços contendo 500 μL de meio. Prepare um adicional de 500 μL para permitir a perda durante a pipetagem. Alíquota 4 tubos, contendo cada um 1,5 mL. <ol><li> Para o arsenito de sódio: para cada poço contendo 500 μL, adicionar 1,5 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 100 μM) ou adicionar 0,75 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 50 μM). </li><li> Para vinorelbina: a cada poço contendo 500 μL, adicionar 22,5 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 150 μM) ou adicionar 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 100 μM). NOTA: Arsenito de sódio<html> É um indutor de grânulos de stress bem caracterizado e vulgarmente utilizado e é portanto classicamente utilizado como controlo positivo. </li></ol></li><li> Remova e descarte a mídia dos poços B1 - 4 e C1 - 4. Adicione o meio com drogas e espere 60 min (Figura 1A). <ol><li> Adicionar 500 μL de meio com 100 μM de arsenito de sódio aos poços B1 e B2. Adicionar 500 μL de meio com 50 μM de arsenito de sódio aos poços B3 e B4. </li><li> Adicionar 500 μL de meio com 150 μM de vinorelbina aos poços C1 e C2. Adicionar 500 μL de meio com 125 μM de vinorelbina aos poços C3 e C4. </li></ol></li><li> 30 min antes da fixaï¿½o, tratar os poï¿½s na coluna 2 com 5 ï¿½ de cicloheximida (1 mg / mL de stock) e os poï¿½s na coluna 4 com 2 ï¿½ de puromicina (pasta de 1,25 mg / mL). Agite suavemente a placa para misturar antes de colocar a placa de volta na incubadora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fixação Celular e Imunofluorescência Nt &quot;&gt; NOTA: Antes do experimento, assegure-se de que o metanol é arrefecido até -20 ° C. Faça buffers, incluindo solução salina tamponada com fosfato (PBS), 5% de soro de cavalo normal (NHS) em PBS e paraformaldeído a 4% ) Em PBS. <ol><li> Descarte a mídia e lave os poços contendo lamínulas com PBS. Dependendo dos fármacos utilizados, pode ser importante descartar adequadamente os meios contendo drogas; Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter instruções específicas. Para lavar eficientemente, encha uma garrafa de espremer com PBS, corte a ponta de modo a permitir um fluxo suave ao invés de um fluxo apertado e use isso para adicionar PBS a cada poço após a aspiração do PBS original. </li><li> Fixar as células utilizando ~ 250 μL de PFA a 4% durante 15 min à RT sob agitação suave. Cubra completamente a parte superior da lamela com PFA; 250 μL deve ser suficiente, mas se não, adicione mais. Sempre evite pipetar diretamente nos lamínulas, pois algumas células (ou tratamentos de tensão de células) podem alterar o apego, e tA força de pipetagem pode desalojar as células. </li><li> Remova o PFA e descarte adequadamente. Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter detalhes sobre como descartar adequadamente paraformaldeído. </li><li> Adicionar ~ 250 μL de metanol (-20 ° C) e incubar durante 5 min à RT sob agitação suave; Isto permeabiliza e aplana as células. </li><li> Remover e descartar o metanol e bloquear as células, aplicando ~ 250 μL de NHS a 5% durante 1 h a RT O / N a 4 ° C. Entre em contato com o escritório de segurança ambiental local para obter detalhes sobre como descartar adequadamente metanol. </li><li> Para anticorpos primários, diluir os anticorpos em NHS a 5%. NOTA: A utilização de múltiplos marcadores SG é fundamental para confirmar se os grânulos observados são SGs de boa-fé . O número de marcadores SG que podem ser usados ​​depende dos filtros disponíveis no microscópio. Se estiverem disponíveis conjuntos de filtros verde, vermelho e far-vermelho padrão, utilize G3BP1, eIF4G e eIF3b a uma diluição de 1/250. <ol><lI&gt; Para esta experiência (12 lamelas a 250 μL de cada-Total: 3 mL de NHS a 5%), adicionar 12 μL de cada um dos seguintes: anti-G3BP1, anti-eIF3b e anti-eIF4G. Incubar os anticorpos primários utilizando agitação suave durante pelo menos 1 h à RT ou O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavar os poços 3x com PBS, e incubar cada lavagem durante 5 min. </li><li> Para anticorpos secundários, diluir todos os anticorpos secundários (diluição 1/250) e corante Hoechst (diluição 1/1000) em NHS a 5%. <ol><li> Para esta experiência (12 lamelas a 250 μL de cada um - Total: 3 mL de NHS a 5%), adicionar 12 μL de cada um dos seguintes: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (uma diluição 1/250 de cada ) E adicionar 3 μL de corante Hoechst. </li><li> Incubar os lamínulas com os anticorpos secundários durante 1 h à RT. Durante este e os seguintes passos, proteger as amostras de luz, cobrindo a placa com uma caixa ou colocando folha sobre o topo do prato de cultura de tecidos. </li></ol></li><li> Lave oLls três vezes com PBS durante 5 min cada. </li><li> Monte os lamínulas em lâminas de vidro etiquetado usando meio de montagem. Aquecer o meio de montagem num bloco de calor a 37 ° C durante 10 min; Isto diminui a viscosidade e facilita a pipetagem. Com uma ponta de corte P200, pipetar 25 μL de meio de montagem por lamela em uma lâmina de vidro; 4-8 lamínulas podem caber em uma lâmina de vidro, assumindo que o estágio do microscópio permite isso. Usando fórceps finos, transferir a lamela do poço para o slide, certificando-se de colocar o lado da célula para baixo sobre o meio de montagem. Usando uma ponta P200 limpa, pressione o lamínula para baixo. </li><li> Uma vez que todos os lamínulas foram montados, use tecido de laboratório dobrado para limpar o excesso de mídia de montagem, pressionando o tecido de laboratório muito firmemente sobre o slide. Use um frasco de compressão contendo H 2 O para enxaguar o excesso de meio de montagem e, em seguida, repita o blotting com tecido de laboratório dobrado para remover a água. </li></ol> 4. Fluorescência In Situ &lt;/ Em&gt; Hybridization (FISH) <ol><li> Placa e tratar as células, usando os passos 1 e 2.1-4 como um guia; Só é necessário plaquear as células na coluna 1, uma vez que são necessários apenas 3 lamelas na experiência seguinte. </li><li> Certifique-se de que todos os tampões são preparados ( isto é, PFA a 4% em PBS, etanol a 70% em água, 2x Citrato de sódio salino (SSC) e NHS a 5%), que o metanol seja arrefecido até -20 ° C e que O forno de hibridação é aquecido até à temperatura apropriada. </li><li> Execute os passos 3.1-3.3 para lavar e fixar as células. </li><li> Permeabilizar as células por adição de -20 ° C de metanol durante 10 min. </li><li> Remover o metanol e incubar as lamelas em etanol a 70%. Colocar a placa a 4 ° C durante a noite. Selar a placa usando parafilme para evitar a evaporação. </li><li> No dia seguinte, remover o etanol e re-hidratar as células adicionando 500 μL de SSC 2x. Incubar os lamínulas durante 5 min com agitação suave à temperatura ambiente. </li><li> Remova o SSC 2x e adicione 500ΜL de SSC 2X. Incubar durante 5 minutos sob agitação suave. </li><li> Coloque um pedaço de parafilme na parte de baixo do forno de hibridação. Pipetar 25 μL de tampão de hibridização sobre o parafilme para cada lamínula. Remova a lamela do prato de 24 poços (neste ponto, os lamínulas estão lado da célula para cima) e coloque a lamela lado da célula para baixo sobre o buffer de hibridização. Faça-o a 42 ° C ou opcionalmente a 65 ° C durante 15 min. NOTA: Completar esta etapa a 65 ° C desnaturalizará RNAs celulares; Isto pode melhorar o sinal se o poliA é mascarado por interações com proteínas. </li><li> Diluir a sonda de Biotina-Oligo (dT) (100 ng / μL) em tampão de hibridação para uma concentração de 2 ng / μL; 25 μL por lamínula é suficiente. </li><li> Para cada lamela, pipetar 25 μL de tampão de hibridação contendo Biotina-Oligo (dT) sobre o parafilme. Pegue a lamela com fórceps e toque suavemente a borda da lamela em um tecido de laboratório para remover o excessoTampão de hibridação. Transferir a lamela para o tampão de hibridação com Biotin-Oligo (dT); Lembre-se de manter o lado da célula para baixo. </li><li> Coloque os lamínulas em uma caixa de hibridização para limitar a evaporação. Incubar os lamínulas com Biotina-Oligo (dT) em tampão de hibridação por 60 min a 42 ° C. </li><li> Colocar 2x SSC no forno de hibridação para permitir que ele se equilibre a 42 ° C. </li><li> Adicionar ~ 500 μL de 2 x SSC aquecido para os poços na placa de 24 poços e usar pinças para transferir os lamínulas para o poço. Incubar durante 10 min. </li><li> Repetir o passo de lavagem acima duas vezes a 42 ° C e depois duas vezes à TA. </li><li> Complete os passos 3.5-3.10, certificando-se de usar um fluorocromo de estreptavidina para detectar o Biotin-Oligo (dT) em vez de um anticorpo convencional. </li></ol> 5. Ensaio de ribopuromicilação para avaliar o estado translacional <ol><li> Placa de células U2OS em lamínulas, como indicado no passo 1, mas apenas chapa um lamínula por condição (nesteCaso, 3 lamínulas: não tratadas, arsenito de sódio 100 μM e vinorelbina 150 μM) ( Figura 1 A). </li><li> Células de estresse usando o protocolo na etapa 2, completando as etapas 2.1-2.4. </li><li> 5 min antes da fixação, adicionar 2 μL de puromicina (estoque: 1,25 mg / mL, diluir 2 μL em 500 μL para obter uma concentração final de puromicina de 5 μg / mL) e 2,9 μL de emetina (estoque: 20 μg / mL; 2,9 μL à mesma solução contendo já a puromicina) para cada poço contendo 0,5 mL. </li><li> Completar os passos 3.1-3.10 como indicado acima, utilizando um anticorpo anti-puromicina (diluição 1/1000) para detectar puromicina. Idealmente, use outros dois marcadores SG nos canais restantes. </li><li> Ao quantificar o sinal de puromicina, tome todas as imagens usando a mesma exposição. Escolha esta exposição usando a amostra mais brilhante (sem tensão) e tirando uma imagem tão brilhante quanto possível sem saturação. NOTA: A intensidade do sinal fluorescente anti-puromicina represA tradução contínua, como substitutos de puromicina para um aminoácido, incorpora na proteína nascente, e impõe a terminação prematura da proteína. </li></ol> 6. Aquisição e Análise de Imagens <ol><li> Quantificação de grânulos de estresse <ol><li> Para quantificar SGs, adquira 3 - 5 imagens totalizando&gt; 100 células por amostra usando um objetivo 40X. Em alternativa, adquira imagens utilizando outros objectivos, mas certifique-se de que&gt; 100 células são contadas por lamínula e que a ampliação é suficientemente grande para visualizar claramente os grânulos. Faça isso dividindo a lamela em cinco regiões aproximadamente iguais e selecionando aleatoriamente um campo de cada região ( Figura 1B ); Imagens do mesmo campo devem incluir todos os canais para avaliar a colocalização de marcadores. </li><li> Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, mesclar os canais. Algum software da câmera fará automaticamente isto, enquanto outros requerem a fusão manual; Isso pode ser feito comImageJ abrindo todas as imagens e selecionando [Image | Cor | Mesclar Canais]. </li><li> Contagem manual do número total de células, contando o número de núcleos, usando Hoechst como o marcador de núcleos. Contagem manualmente o número de células que contêm mais de dois SGs por célula. NOTA: Por exemplo, usando uma imagem de três canais combinada exibindo G3BP1 (verde), eIF4G (vermelho) e Hoechst (azul), conte os núcleos (ou número de células) usando o canal azul. Em seguida, considere as células SG-positivas como aquelas com dois ou mais focos amarelos por célula. Os grânulos aparecerão amarelos, como verde de G3BP1 e vermelho de eIF4G aparecem amarelos se colocalized. </li><li> Determine a percentagem de células que são SG positivo, combinando os dados das 3-5 regiões independentes e, em seguida, calcular: Número de SG positivo / número de núcleos) * 100 = percentagem de células SG-positivas </li></ol></li><li> Avaliação da Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Método Manual <ol><li> AbertoImageJ. Faça o download gratuitamente de () </li><li> Abra o gerenciador de ROI: [Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI ...]. </li><li> Abra a imagem mesclada no ImageJ: [File | Aberto]. </li><li> Usando a ferramenta de linha localizada na barra de ferramentas ImageJ, adicione uma linha que passa por um SG, certificando-se de incluir antes e depois do SG. Adicione esta linha ao gerenciador de ROI clicando em [Adicionar] na janela do gerenciador de ROI. </li><li> Dividir a imagem mesclada em canais separados para avaliar a localização de cada marcador para o grânulo: [Image | Cor | Split Channel]; Isso dividirá a imagem mesclada em três imagens em preto e branco. </li><li> Na imagem em preto-e-branco, certifique-se de que a linha está selecionada; A linha é selecionada se aparecer na imagem. Caso contrário, na janela do gestor de ROI, clique na linha no painel; Isto irá realçar a linha em azul na janela do gestor de ROI e tornará a linha visível na imagem em preto e branco. Se a linha ainda não aparecer, certifique-se de que &quot;mostrar tudo&quot; é chEcked no gerente de ROI e, em seguida, clique na linha na imagem. </li><li> Analisar a intensidade da linha: [Analisar | Plot Profile]; Isto irá abrir a janela &quot;Plot Profile&quot;, que traça a intensidade do sinal através da linha. </li><li> Na janela &quot;Plot Profile&quot;, clique em [List], que abre uma janela contendo os dados brutos do gráfico. Copie todos os dados nesta janela e cole-os em um arquivo de planilha. Para fazer isso, selecione todos os dados na janela: [Editar | Selecionar tudo]. Copie a data: [Editar | Cópia de]. Abra um arquivo de planilha e cole os dados: [Editar | Colar]. </li><li> Complete os passos 6.2.6 a 6.2.8 para cada canal separadamente. Certifique-se de acompanhar o canal que está sendo avaliado. </li><li> Em uma planilha, gere um gráfico de linha dos resultados. Selecione as colunas que incluem dados pressionando [controle] e clicando na letra na parte superior de cada coluna. Em seguida, selecione o gráfico de linha: [Inserir | Gráfico de linha]. </li><li> Repita essa análise para multGranulados de estresse em várias experiências independentes. </li></ol></li><li> Avaliando Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Plugin ImageJ <ol><li> Faça o download e instale a ferramenta de perfil RGB no site da ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Quando instalado corretamente, um ícone vermelho, verde e azul (RGB) -lineado deve aparecer na barra de ferramentas. </li><li> Abra a imagem ( por exemplo, Tiff, JPG) em ImageJ: [File | Aberto]. </li><li> Clique no ícone RGB localizado na barra de ferramentas ImageJ. </li><li> Clique e arraste para adicionar uma linha que se estende através de um SG, certificando-se de incluir regiões adjacentes; Uma imagem do histograma aparecerá em uma janela pop-up. </li><li> Salvar os dados como uma imagem: [Arquivo | Guardar como | Tiff]. Como alternativa, exporte e, em seguida, grafique os dados em outro programa gráfico usando a etapa 6.2.8 acima. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Conforme evidenciado por estudos imuno-histológicos em múltiplas doenças, o estresse crônico leva à formação de diferentes focos intracelulares. Por exemplo, a maioria das doenças neurodegenerativas é caracterizada por agregados intracelulares de proteínas insolúveis. A presença de proteínas associadas a SG nesses agregados é frequentemente a base para concluir que tais focos são SGs. Uma conclusão semelhante é também tirada quando os focos citoplasmáticos positivos para o marcador SG são observados em células tratadas ...

As células empregam muitos mecanismos para responder ao estresse. Algumas respostas ocorrem no nível pós-transcricional e envolvem a regulação da tradução e / ou estabilidade do mRNA 1 , 2 . A detenção e degradação da tradução do mRNA modulado pelo estresse estão associados com a formação de focos celulares não-membranares específicos, sendo os mais bem caracterizados os Stress Granules (SGs) 3 . As SGs são focos citoplasmáticos que concentram mRNPs não-traduzidos em células arrancadas pela tradução que respondem ao estresse ( por exemplo, oxidação, choque térmico, inanição de nutrientes e infecção viral) 4 . Para além dos mRNAs não traduzidos, os SGs contêm factores de iniciação de tradução, proteínas de ligação a RNA e várias proteínas de sinalização 5 . As SGs são biomarcadores da tradução de proteínas inibidas e do metabolismo do ARN alterado e têm sido associadas à sobrevivência celular e à apoptose, via de sinalizaçãoS e processos nucleares 5 . SGs são entidades dinâmicas, e sua formação está firmemente conectado ao status de tradução celular 6 . Apesar da sua aparência aparentemente sólida, a maioria dos componentes da proteína SG transite rapidamente para dentro e para fora, com um tempo de residência de segundos. Enquanto SGs persistem por minutos a horas, a maioria dos seus componentes estão em fluxo rápido. A inibição da iniciação da tradução ea conseqüente desmontagem dos polissomos de translação promovem a formação de SGs; Assim, as SGs estão em equilíbrio com os polissomas de translação. Este equilíbrio polissômico / SG é fundamental para distinguir SGs bona fide de outros focos induzidos pelo estresse 6,7. A interrupção da iniciação da tradução implica a conversão de complexos de pré-iniciação competentes para a tradução que contêm mRNA, factores de iniciação de tradução (eIF) e subunidades ribossómicas 40S<html> O-chamado 48S complexos) em translacionalmente stalled complexos (chamados 48S * complexos) que podem coalescer em SGs 4 , 6 . As SGs são promovidas por paragem translacional em dois passos diferentes a montante da formação do complexo 48S: interferência com as funções do complexo eIF4F de ligação de tampão ( por exemplo, direccionando a sua subunidade eIF4A) ou fosforilação da subunidade a do factor de iniciação da tradução eIF2, mediada por uma Ou mais das quatro cinases eIF2. A presença de complexos 48S bloqueados ( isto é, subunidades ribossómicas 40S e factores de iniciação de tradução seleccionados) é uma característica dos SG 8 , 9 . SGs foram ligados a vários estados patológicos, tais como infecções virais, neurodegeneração, auto-imunidade e câncer 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . As formas mutadas de vários componentes SG estão associadas a doenças neurodegenerativas ( por exemplo, esclerose lateral amiotrófica) nas quais os neurônios exibem inclusões patológicas intracelulares que podem desempenhar papéis ativos na morte neuronal 13 . Alguns vírus sequestrar SG componentes para inibir SG formação e para reforçar a replicação viral [ 14] . Estudos recentes também ligam SGs ao cancro 15 e à sobrevivência das células cancerígenas nos tratamentos de quimioterapia e radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Embora tais descobertas tenham estimulado grande interesse na biologia da SG, muitos dos relatórios publicados não têm controles importantes para distinguir a formação de SGs de boa-fé de outros focos induzidos pelo estresse. As SGs foram inicialmente descritas como focos citoplasmï¿½icos nï¿½ membranosos compostos de proteï¿½as de ligaï¿½o a mRNA seleccionadas (RBPs), incluindo o antigï¿½io ntracelular de cï¿½ulas T 1 (TIA-1) e Proteï¿½a de Ligaï¿½o a Poli-A (PABP); Factores de iniciação de tradução; MARN poliadenilado; E pequenas subunidades ribossómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, a sua composição foi determinada por técnicas como a imunocoloração e a expressão ectópica de proteínas com marcação fluorescente 23 , 24 . Devido à sua natureza altamente dinâmica, a imunolocalização de proteínas SG e / ou mRNAs continua a ser a metodologia de definição para a detecção de SGs 23 , 24 . Até à data, muitas RBP e outras proteínas (mais de 120 proteínas distintas) são descritas como SG componentes [ 11] . QuantasAs proteínas G-localizadas alteram a sua localização tanto de uma forma dependente de stress como de uma forma independente e podem acumular-se em outros compartimentos intracelulares e focos, é importante escolher marcadores SG correctos e empregar critérios funcionais para distinguir SGs de outros tipos de stress induzido Focos Bona fide SGs contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e pequenas subunidades ribossômicas e estão em equilíbrio dinâmico com a tradução. Esse fluxo de trabalho simples é projetado para determinar se os focos induzidos pelo estresse são SGs de boa-fé . Este fluxo de trabalho inclui várias abordagens experimentais usando células U2OS, células comumente usadas para estudar SGs. Estas células são ideais, porque têm um citoplasma grande, são relativamente lisas, e atribuem fortemente aos lamínulas de vidro. Outros tipos de células podem ser usados ​​para estudar SGs, mas é importante estar ciente de que as diferenças no tempo, na concentração de fármacos e na abundância de proteínas nucleantes de SG podem alterar a cinética e a composiçãoPosição. Alï¿½ disso, algumas cï¿½ulas respondem ï¿½fixa de paraformaldeï¿½o formando vesï¿½ulas de superfï¿½ie celular, dando, entï¿½, uma aparï¿½cia abaulada que provoca a localizaï¿½o puncata de alguns marcadores SG; Sem uma análise cuidadosa, estes podem ser classificados erroneamente como SGs. Isso destaca a necessidade de avaliar todos os critérios necessários para identificar focos induzidos pelo estresse como SGs de boa-fé . Vinorelbina (VRB), um cancro terapêutico que promove SGs 20 , bem como Sodium Arsenite (SA), um robusto e bem caracterizado SG indutor, são utilizados como stress para as experiências neste protocolo. As SGs canônicas contêm múltiplos marcadores SG (proteínas e mRNAs) que se colocalizam em focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto a imunofluorescência como a hibridização in situ fluorescente (FISH) para detectar a localização de marcadores de proteína e ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Resumidamente, a imunofluorescência indirecta utiliza anticorpos ( i.E. Anticorpos primï¿½ios) especï¿½icos para uma determinada proteï¿½a para a detectar dentro da cï¿½ula. Em seguida, os anticorpos secundários (geralmente específicos de espécies) ligados a fluorocromos reconhecem o anticorpo primário e revelam a localização da proteína alvo. A microscopia fluorescente é utilizada para detectar o sinal localizado dentro da célula. Utilizar anticorpos produzidos em diferentes espécies e detectá-los com anticorpos secundários de cor diferente permite a detecção da colocalização de múltiplos anticorpos, indicando que os alvos proteicos são encontrados no mesmo local 23 . É importante selecionar marcadores que foram verificados para co-localizar em SGs de boa-fé . FISH usa uma sonda marcada que base-pares para uma determinada RNA ou DNA seqüência [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza uma sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (ou pares de bases) com a cauda poliA de mRNA ( isto é, poliA FISH). A sonda biotinilada é então detectada utilizando estreptavidina conjugada com fluorescência, uma vez que a estreptavidina tem uma elevada afinidade para a biotina. Ao avaliar SGs, é importante acoplar poliA FISH com imunofluorescência detectando um marcador SG, como em SGs bona fide , os dois sinais devem colocalize. Usando este protocolo, colocalização é avaliada de várias maneiras. Em uma imagem multicanal ( ou seja, RGB: vermelho, verde e azul), a colocalização alterará a cor do sinal sobreposto ( por exemplo, colocalized vermelho e verde aparecem amarelo) 23 . Adicionalmente, a colocalização é quantificada graficamente usando análise de varredura de linha, onde a intensidade de cada cor é medida através de uma dada linha 8 , 20 . Este protocolo descreve dois procedimentos de análise de varredura de linha usando o ImageJ 26 . Um procedimento é manual e passa por todo o processo,O outro usa uma macro, ou um programa simples que automatiza as etapas manuais. É importante passar pelo programa manual para entender o procedimento macro. SGs formam-se em células onde a tradução é reprimida; Portanto, as células com SGs devem exibir níveis diminuídos de tradução global em comparação com células não tratadas. Experimentalmente, utiliza-se ribopuromicilação. A puromicina e a emetina são adicionadas às células durante um curto período de tempo antes da fixação, permitindo que a puromicina se incorpore aos polipéptidos que formam activamente, causando a terminação 27 , 28 . O tratamento com emetina é necessário para prevenir o re-início 29 . A puromicina pode então ser detectada utilizando anticorpo anti-puromicina, dando um instantâneo de tradução activa. Este método é usado porque é rápido, não requer pré-fome com um meio que não tem um aminoácido particular (e potencialmente pretensão das células), e revela aLocalização subcelular de tradução de proteínas. Outros mï¿½odos, nomeadamente utilizando anï¿½ogos de aminoï¿½idos modificados, tais como o anï¿½ogo de metionina L-azidohomoalaina (AHA), acoplados com a quï¿½ica &quot;click-it&quot; 30 , foram utilizados para mostrar que as cï¿½ulas contendo SG apresentam uma traduï¿½o muito mais baixa do que as cï¿½ulas vizinhas 31 . No entanto, esta técnica requer inanição de metionina seguida de marcação por impulsos durante 15-30 min. A privação de metionina constitui um estresse adicional, enquanto que o longo tempo de marcação ( isto é, 15-30 min) resulta na medição de tradução cumulativa em vez de contínua e também permite que as proteínas recém-sintetizadas se movam do seu local de síntese para o seu destino final dentro do célula. Em contraste, a ribopuromicilação é muito mais rápida e é compatível com qualquer meio, tal como o meio isento de glucose utilizado para induzir SGs através de inanição de glucose. As SGs canônicas estão em equilíbrio dinâmicoCom tradução activa de polissomas. Isto pode ser avaliado experimentalmente por tratamento de amostras com os fármacos que estabilizam ou desestabilizam polissomas, inclinando assim o equilíbrio entre SGs e polissomas 23 . A ciclo-heximida (ou emetina, que se comporta de modo semelhante) bloqueia o alongamento por &quot;congelamento&quot; de ribossomas no mRNA, diminuindo assim o conjunto de mRNPs não polissómicos disponíveis capazes de formar SGs. Experimentalmente, isto pode ser usado de duas maneiras: pela adição de cicloheximida (ou emetina) antes da tensão para prevenir a formação de SG ou pela adição de cicloheximida (ou emetina) após a formação das SGs, mesmo sem remover o agente estressante, causando a desmontagem da SG Os complexos de pré-iniciação são lentamente admitidos na fracção de polissomo. Em contraste, a puromicina provoca a terminação prematura e promove a desmontagem do polissomo, aumentando o conjunto de mRNAs iniciadores capazes de se reunirem em SGs. Experimentalmente, o tratamento com puromicina aumenta o número de SGs ou reduz oD em que se formam em resposta ao stress graduado ou dose de fármaco. Ao avaliar o efeito da puromicina, é importante utilizar um nível sub-máximo do fármaco de interesse, uma vez que se espera que a puromicina aumente o efeito do fármaco e aumente a percentagem de células apresentando SGs - isto não pode ocorrer se o fármaco / Estresse provoca SGs em 100% das células inicialmente. Isto contrasta com o tratamento com cicloheximida, que desmonta as SGs e funciona melhor quando ~ 95% das células inicialmente exibem SGs de modo que a maior diminuição possível pode ser observada e quantificada com precisão. Este protocolo proporciona uma estrutura para estudar SGs em células de mamíferos. Os métodos incluem: (1) coloraï¿½o imunofluorescente e anï¿½ise de ImageJ para avaliar a colocalizaï¿½o dos marcadores SG-associados eIF4G, eIF3b e proteï¿½a de ligaï¿½o de proteï¿½a 1 activadora de Ras GTPase (G3BP1) em SGs putativas; (2) hibridação in situ de fluorescência de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamento com ciclo-heximida e puromicina para determinar se os focos induzidos pelo estresse estão em equilíbrio dinâmico com polissomos; E (4) ribopuromicilação para avaliar o estado de translação de células contendo SGs putativas. Juntos, estes ensaios podem determinar se os focos induzidos pelo stress podem ser classificados como SGs de boa-fé .

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC ATCC</td><td>&reg; HTB-96&trade;</td><td>Comumente escrito "U2OS" Culture at 37 &deg; C abaixo de 5% de CO2 em 10% de FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Contém 4,5 g/L de glicose, piruvato e vermelho de fenol Suplementado com 10% de FBS, HEPES 10 mM e penicilina/steptomicina Pré-aqueça a diluição do(s) medicamento(s) Soro</td></tr><tr><td>Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Usado para suplementar o meio</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Usado para suplementar mídia</td></tr><tr><td>penicilina estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Usado para suplementar mídia</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>tecidos de laboratório (kimwipes)</td> <td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Capa de Vidro para Óculos de Cobertura de Crescimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Autoclavado antes do uso Mantenha estéril na capa de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>(meta)arsenito de sódio &ge; 90% (SA)</td> <td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Dissolver em água até a concentração de 1 M, depois diluir até 100 &micro; M como estoque de trabalho</td></tr><tr><td>Vinorelbina (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Dissolver em água a 10 mM</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Usado para avaliar o nível de tradução (ribopuromicilação) -Usado para avaliar a conexão SG com tradução ativa Diluir em água a 10 mg/mL</td></tr><tr><td>de hidrato de dicloridrato de emetina</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Usado em combinação com puromicina para avaliar o nível geral de tradução Usado para avaliar a conexão SG com tradução ativa -Diluir em água para 10 mg/mL</td></tr><tr><td>de cicloheximida (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Usado para avaliar a conexão SG com tradução ativa Diluir em água para 10 mg/mL</td></tr><tr><td>de solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Tampão de lavagem para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Grau de reagente de paraformaldeído, cristalino (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Faça uma solução a 4% em PBS quente na capela de exaustão, mexa até dissolver Alíquotas podem ser armazenadas a -20 &deg; C por vários meses Perigoso, use ventilação Descarte em resíduos especiais</td></tr><tr><td>Metanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Pré-resfriamento a -20 &graus; C antes de usar Descarte em resíduos especiais</td></tr><tr><td>Soro Normal de Cavalo (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Diluir a 5% em PBS Adicionar azida de sódio para armazenamento a 4 &graus; C Solução de bloqueio para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Etanol, Puro, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Diluir a 70% com água</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Fisherbrand Superfrost Plus Fisherbrand</td><td></td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti G3BP1 de camundongo (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Armazenar em 4 &deg; C 1/100 diluição</td></tr><tr><td>coelho anti eIF4G anticorpo (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Armazenar em 4 &deg; C 1/250 caprino diluição</td></tr><tr><td>anti eIF3&eta; (N-20) anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; também é conhecido como eIF3b Loja a 4 &deg; C 1/250 diluição</td></tr><tr><td>de camundongo anticorpo anti-puromicina 12D10</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Armazenar a 4 &deg; C diluição de 1/1.000</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstituir em água por fabricante' s instruções então armazene a 4 &deg; C diluição de 1/250</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Reconstituir em água conforme o fabricante' s instruções então armazene em 4&deg; C diluição de 1/2.500</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Reconstituir em água de acordo com o fabricante' s instruções então armazene em 4&deg; C diluição 1/250</td></tr><tr><td>Solução Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Incubar com anticorpos secundários Solução de estoque 0,5 mg/mL em dH20, proteger da luz -Armazenar a 4 > C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Reconstituir em água por fabricante» s instruções, em seguida, armazenar em 4 &deg; C 1/250 diluição</td></tr><tr><td>oligo-(dT)40x sonda biotinilada</td><td>Tecnologias Integradas de DNA (IDT)</td><td>/</td><td>Reconstituir em água a 100 ng/mL, alíquota e armazenar a -20 &deg; C Diluir em tampão de hibridação 1/50 antes de usar </td></tr><tr><td>Caixa de hibridação</td> de pedido personalizado<td>/</td><td>/</td><td>Faça uma câmara de umidade com qualquer caixa de lâminas de armazenamento adicionando papel umidificado na parte inferior - pré-aqueça a caixa antes do uso</td></tr><tr><td>20x tampão SSC</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Dilua para 2x SSC usando água livre de RNase (tratada com DEPC) Armazene em RT Tampão de lavagem para FISH</td></tr><tr><td>Buffer de hibridização PerfectHybPlus</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>Bloco e tampão de incubação de sonda para</td></tr><tr><td>mídia de montagem de slides</td> FISH <td>feito em casa</td> <td>/</td> <td>Misture 5 g de " solúvel a frio" poli(álcool vinílico) em 20 mL de PBS Misture por sonicação, seguido de agitação O/N em RT Adicione 5 mL de glicerol e 0,2 mL de azida sódica a 20% e agite por 16 h em RT Centrifugação a 20.000 g por 20 min, descarte o pellet grande líquido viscoso alíquota, armazenamento de longo prazo a -20 & C, 1 semana às 4 > C</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td> <td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poli (álcool vinílico)</td> <td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Reagente para fazer vinol</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>Reagente para fazer</td></tr><tr><td>vinol azida sódica</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Agente conservante para solução de bloqueio e vinol Faça uma diluição de 20% em água</td></tr></tbody></table>

métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

As células são muitas vezes desafiadas por mudanças ambientais súbitas. Os grï¿½ulos de stress (SGs), complexos de ribonucleoproteï¿½a citoplasmï¿½icos que se formam em cï¿½ulas expostas a condiï¿½es de stress, estï¿½ implicados em vï¿½ios aspectos do metabolismo celular e sobrevivï¿½cia. As SGs modulam as vias de sinalização celular, expressão de genes pós-transcricionais e programas de resposta ao estresse. A formação destes grânulos contendo mRNA está directamente ligada à tradução celular. SG é desencadeada por inibição da iniciação da tradução e a desmontagem SG é promovida por ativação da tradução ou por alongamento da tradução inibida. Esta relação é ainda mais realçada pela composição da SG. Os componentes Core SG são complexos de pré-iniciação de tradução paralisados, ARNm e proteínas de ligação a RNA seleccionadas (RBPs). A finalidade da montagem do SG é conservar a energia celular sequestrando mRNAs arranjados da manutenção da tradução, permitindo a tradução realçada de proteínas stress-responsivas. Em additiSobre os constituintes do núcleo, tais como complexos de pré-iniciação de tradução paralisada, as SGs contêm uma multiplicidade de outras proteínas e moléculas de sinalização. Defeitos na formação de SG podem prejudicar a adaptação celular ao estresse e, assim, podem promover a morte celular. SGs e grï¿½ulos contendo ARN semelhantes foram ligados a vï¿½ias doenï¿½s humanas, incluindo distï¿½bios neurodegenerativos e cancro, levando ao interesse recente na classificaï¿½o e definiï¿½o de subtipos de grï¿½ulos de ARN. Este protocolo descreve ensaios para caracterizar e quantificar SGs de mamíferos.

Os focos induzidos pelo estresse não são necessariamente SGs. As SGs são classificadas como focos citoplasmáticos que contêm mRNAs, factores de iniciação de tradução e proteínas de ligação ao ARN e estão em equilíbrio com a tradução activa. O protocolo acima pode ser usado como um modelo para caracterizar se um determinado estresse induz SGs bona fide . SGs colocalize com outros marcadores SG conhecidos, incluindo pro...

Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé .

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

O objetivo geral deste fluxo de trabalho é determinar se os focos identificados no citoplasma são grânulos de estresse autênticos, que são grânulos de RNA com papéis importantes na fisiologia celular. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é que ele testa todas as propriedades fundamentais dos grânulos de estresse. Embora este fluxo de trabalho seja apresentado para células de osteossarcoma humano U-2 OS, ele também pode ser aplicado a outros tipos de linhagens celulares e células primárias.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque nem todos os focos induzidos por estresse são grânulos de estresse. Nosso fluxo de trabalho compreende todos os experimentos necessários para distingui-los. Demonstrarei este procedimento com Anais Aulus.Somos pesquisadores pós-doutorandos no laboratório de Paul Anderson e Pavel Ivanov. Para começar, semeie as células em lamínulas colocadas em placas de 24 poços conforme descrito no protocolo textual. Após a incubação durante a noite, aspire o meio de cultura dos poços B1 a B4 e de C1 a C4 da placa de 24 poços.Adicione 500 microlitros do meio suplementado com 100 micromolares de arsenito de sódio aos poços B1 e B2, em seguida adicione 500 microlitros do meio suplementado com 50 micromolares de arsenito de sódio aos poços B3 e B4. A seguir, adicione 500 microlitros do meio contendo 150 micromolares de vinorelbina aos poços C1 e C2. Finalmente, adicione 500 microlitros do meio suplementado com 125 micromolares de vinorelbina aos poços C3 e C4. Incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após 30 minutos de incubação, adicione às células da coluna dois cinco microlitros de uma solução de cicloheximida a um miligrama por mililitro e às células da coluna quatro, dois microlitros de puromicina a 1,25 miligramas por mililitro. Agite suavemente a placa para misturar as soluções e retorne a placa ao incubador por mais 30 minutos de incubação.Para fixar as células, remova o meio dos poços e lave as células com aproximadamente 250 microlitros de PBS. Adicione aproximadamente 250 microlitros de uma solução tamponada de paraformaldeído a 4% para fixar as células, certificando-se de que a parte superior do lamínula fique completamente coberta. Em seguida, deixe a placa em um agitador horizontal à temperatura ambiente por 15 minutos.Em seguida, remova e descarte adequadamente o paraformaldeído. Adicione aproximadamente 250 microlitros de metanol gelado para permeabilizar e achatas as células. Incube a placa por mais cinco minutos à temperatura ambiente em um agitador rotativo.Uma vez concluída a permeabilização, descarte o metanol e bloquee as células aplicando aproximadamente 250 microlitros de um tampão de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução de anticorpo primário adicionando 12 microlitros dos anticorpos contra G3BP1, eIF4G e eIF3B a três mililitros do tampão de bloqueio. Adicione 250 microlitros da solução de anticorpo a cada poço da placa de 24 poços.Incube a placa em um agitador durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora de incubação, remova a solução de anticorpo e lave as células com aproximadamente 250 microlitros de PBS durante cinco minutos. Em seguida, adicione 12 microlitros dos anticorpos Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 e Anti-Goat Cy5 juntamente com três microlitros do corante hooks a três mililitros do tampão bloqueador para preparar a solução de anticorpo secundário.Adicione 250 microlitros da solução de anticorpo secundário a cada poço e cubra a placa para proteger as amostras da luz. Incube a placa em agitador sob temperatura ambiente por uma hora. Após a conclusão da incubação, remova a solução de anticorpo e lave as células com PBS por cinco minutos.Aqueça o meio de montagem em um bloco térmico a 37 graus Celsius por 10 minutos para reduzir a viscosidade. Em seguida, utilizando uma ponteira de pipeta pré-cortada de 200 microlitros, coloque 25 microlitros do meio de montagem sobre uma lâmina de vidro identificada. Com pinça fina, transfira a lamínula do poço para a lâmina, invertendo-a de modo que as células fiquem voltadas para o meio de montagem.Use uma ponteira P200 limpa para pressionar a lamínula. Depois que todas as lamínulas forem montadas, remova o meio de montagem em excesso pressionando firmemente um papel toalha de laboratório contra a lâmina. Em seguida, enxágue a lâmina com água.E imediatamente seque com papel-toalha de laboratório mais uma vez. Permeabilize as células previamente fixadas incubando-as com 250 microlitros de metanol gelado por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione aproximadamente 250 microlitros de etanol 70% aos poços vazios da placa e feche a placa com parafilm para evitar evaporação.Incube a placa a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna, remova o etanol e reidrate as células adicionando 500 microlitros de 2XSSC. Incube as lamínulas por cinco minutos em um agitador rotativo à temperatura ambiente.Em seguida, descarte a solução e adicione mais 500 microlitros de SSC. Incube a placa por mais cinco minutos com agitação suave. Em seguida, coloque uma camada de parafilm na parte inferior de uma estufa de hibridização e pipete 25 microlitros de um tampão de hibridização sobre ela.Transfira a lamínula da placa de 24 poços, invertendo a parte superior para que as células fiquem voltadas para o tampão de hibridização. Incube as lamínulas a 42 graus Celsius por 15 minutos. Pipete 25 microlitros de uma solução de oligo dT biotinilado sobre o parafilm dentro do forno de hibridização.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as, pegue a lam&iacute;nula e encoste sua borda em um papel toalha de laborat&oacute;rio para remover o excesso de tamp&atilde;o de hibridiza&ccedil;&atilde;o. Transfira a lam&iacute;nula para a solu&ccedil;&atilde;o de oligo dT biotinilado, certificando-se de que as c&eacute;lulas fiquem voltadas para baixo, e incube a 42 graus Celsius por 60 minutos. Ap&oacute;s a conclus&atilde;o da hibridiza&ccedil;&atilde;o, adicione aproximadamente 500 microlitros de 2XSSC previamente aquecido &agrave;s cavidades da placa de 24 po&ccedil;os.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as, transfira a lam&iacute;nula para o po&ccedil;o e incube-a a 42 graus Celsius por 10 minutos. Ap&oacute;s corar as c&eacute;lulas adicionalmente com solu&ccedil;&atilde;o de anticorpo, visualize as amostras utilizando um microsc&oacute;pio de fluoresc&ecirc;ncia. S&atilde;o apresentadas aqui imagens de c&eacute;lulas U-2 OS n&atilde;o tratadas que n&atilde;o cont&ecirc;m gr&acirc;nulos ou focos corados com os marcadores de gr&acirc;nulos de estresse G3BP1, eIF4G e eIF3B.Em células U-2 OS tratadas com arsenito de sódio ou vinorelbina, foi induzida a formação de focos citoplasmáticos que contêm G3BP1, eIF4G e eIF3B. A co-localização desses marcadores foi confirmada por análise de varredura linear realizada para cada canal com aumento da magnificação, seguida pela superposição dos gráficos obtidos. Além disso, os focos citoplasmáticos identificados nas células tratadas continham mRNA, conforme demonstrado por FISH de poli A.O sinal de oligo dT co-localizou-se com o sinal de G3BP1, confirmando a identificação dos grânulos de estresse. Uma vez dominado, todo este fluxo de trabalho pode ser realizado em três dias, se for executado corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imunofluorescência e hibridização fluorescente.Passos essenciais para a caracterização e identificação corretas de grânulos de estresse. Não se esqueça de que o trabalho com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de EPIs e ventilação adequada, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Vonaesch, P. et. al., Análise de Imunofluorescência da Formação de Grânulos de Estresse após Desafio Bacteriano em Células de Mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a infecção das células epiteliais pela bactéria patogênica Shigella flexneri e a resposta celular do hospedeiro resultante. Proteínas efetoras bacterianas interrompem a tradução do hospedeiro, desencadeando a formação de organelos sem membrana chamados grânulos de estresse, que refletem a resposta adaptativa da...

Formação de Grânulos de Estresse durante a infecção por Shigella em células epiteliais cancerígenas

Este vídeo demonstra um ensaio para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos, que consistem em mRNAs, proteínas de ligação a RNA (RBPs) e várias outras proteínas.

Um ensaio de imunofluorescência para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

As amebas sociais Dictyostelium discoideum foram recentemente estabelecidas como um sistema para estudar o desdobramento de proteínas e a proteostase. Aqui, descrevemos uma nova metodologia baseada em imagens para estudar a agregação de proteínas induzida pela temperatura e a resposta ao estresse celular em D. discoideum.

Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de<em&gt; D. discoideum</em&gt; Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular

Descrevemos um método para a análise qualitativa e quantitativa da formação de grânulos de estresse em células de mamíferos após as células serem desafiadas com bactérias e vários estresses diferentes. Este protocolo pode ser aplicado para investigar a resposta do grânulo do estresse celular em uma ampla gama de interações hospedeiro-bacteriana.

Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Apresentamos um fluxo de trabalho livremente disponível construído para rápida exploração e análise precisa de corpos celulares em compartimentos celulares específicos em imagens de microscopia de fluorescência. Este fluxo de trabalho fácil de usar é projetado no software de código aberto Icy e também usa funcionalidades ImageJ. O gasoduto é acessível sem conhecimento em análise de imagens.

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Aprenda a identificar grânulos de estresse em células de mamíferos usando imunofluorescência e hibridização in situ fluorescente. Este protocolo validado permite distinguir grânulos de estresse de outros focos citoplasmáticos de forma precisa.

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

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