Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

O objetivo geral deste fluxo de trabalho é determinar se os focos identificados no citoplasma são grânulos de estresse genuínos, que são grânulos de RNA que desempenham papéis importantes na fisiologia celular. A principal vantagem desse fluxo de trabalho é que ele testa todas as propriedades fundamentais dos grânulos de tensão. Embora esse fluxo de trabalho seja apresentado para células de osteossarcoma humano U-2 OS, ele também pode ser aplicado a outros tipos de linhagens celulares e células primárias.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque nem todos os focos induzidos por estresse são grânulos de estresse. Nosso fluxo de trabalho compreende toda a experimentação necessária para distingui-los. Estarei demonstrando esse procedimento com Anais Aulus.

Somos bolsistas de pós-doutorado no laboratório de Paul Anderson e Pavel Ivanov. Para começar, semeie as células em lamínulas colocadas em placas de 24 poços, conforme descrito no protocolo de texto. Após incubação durante a noite, aspirar os meios de cultura dos poços B1 a B4 e de C1 a C4 da placa de 24 poços.

Adicione 500 microlitros do meio suplementado com 100 micromolares de arsenito de sódio aos poços B1 e B2 e, em seguida, adicione 500 microlitros do meio suplementado com 50 micromolares de arsenito de sódio aos poços B3 e B4. Em seguida, adicione 500 microlitros do meio contendo 150 vinorelbina micromolar aos poços C1 e C2. Por fim, adicione 500 microlitros do meio suplementado com 125 micromolares de vinorelbina aos poços C3 e C4. Incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após 30 minutos de incubação, adicione às células da coluna dois cinco microlitros de um miligrama por mililitro de solução de cicloheximida e às células da coluna quatro, dois microlitros de 1,25 miligramas por mililitro de puromicina. Agite suavemente a placa para misturar as soluções e retorne a placa à incubadora por mais 30 minutos de incubação.

Para fixar as células, retire o meio dos poços e lave as células com aproximadamente 250 microlitros de PBS. Adicione aproximadamente 250 microlitros de uma solução tamponada de paraformaldeído a 4% para fixar as células, certificando-se de que a parte superior da lamínula esteja completamente coberta. Em seguida, deixe o prato em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente por 15 minutos.

Em seguida, remova e descarte adequadamente o paraformaldeído. Adicione aproximadamente 250 microlitros de metanol gelado para permeabilizar e achatar as células. Incube a placa por mais cinco minutos em temperatura ambiente em um balancim.

Quando a permeabilização estiver completa, descarte o metanol e bloqueie as células aplicando aproximadamente 250 microlitros de um tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução de anticorpo primário adicionando 12 microlitros de anticorpos contra G3BP1, eIF4G e eIF3B a três mililitros de tampão de bloqueio. Adicione 250 microlitros da solução de anticorpos a cada poço da placa de 24 poços.

Incube a placa em um balancim por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Após uma hora de incubação, remova a solução de anticorpos e lave as células com aproximadamente 250 microlitros de PBS por cinco minutos. Em seguida, adicione 12 microlitros de anticorpos Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 e Anti-Goat Cy5 junto com três microlitros de corante de ganchos a três mililitros de tampão de bloqueio para preparar a solução de anticorpo secundário.

Adicione 250 microlitros da solução de anticorpo secundário a cada poço e cubra a placa para proteger as amostras da luz. Incube a placa em um balancim em temperatura ambiente por uma hora. Quando a incubação estiver concluída, remova a solução de anticorpos e lave as células com PBS por cinco minutos.

Aqueça o meio de montagem em um bloco de calor de 37 graus Celsius por 10 minutos para reduzir a viscosidade. Em seguida, usando uma ponta de pipeta pré-cortada de 200 microlitros, coloque 25 microlitros do meio de montagem em uma lâmina de vidro rotulada. Com uma pinça fina, transfira a lamínula do poço para a lâmina, invertendo a parte superior para que as células fiquem voltadas para o meio de montagem.

Use uma ponta P200 limpa para pressionar a lamínula para baixo. Depois que todas as lamínulas estiverem montadas, remova o excesso de meio de montagem pressionando um lenço de papel firmemente contra a lâmina. Em seguida, lave a lâmina com água.

E imediatamente seque-o com tecido de laboratório mais uma vez. Permeabilize as células prefixadas incubando-as com 250 microlitros de metanol gelado em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, aos poços esvaziados da placa, adicione aproximadamente 250 microlitros de etanol a 70% e sele a placa usando parafilme para evitar a evaporação.

Incube a placa a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna, remova o etanol e reidratie as células adicionando 500 microlitros de 2XSSC. Incube as lamínulas por cinco minutos em um balancim em temperatura ambiente.

Em seguida, descarte a solução e adicione 500 microlitros de SSC mais uma vez. Incube a placa por mais cinco minutos com agitação suave. Em seguida, coloque o parafilme no fundo de um forno de hibridização e pipete 25 microlitros de um tampão de hibridização em cima dele.

Transfira a lamínula da placa de 24 poços, invertendo a parte superior para que as células fiquem voltadas para o tampão de hibridização. Incube as lamínulas a 42 graus Celsius por 15 minutos. Pipetar 25 microlitros de uma solução de biotina oligo dT para o parafilme no forno de hibridização.

Em seguida, usando uma pinça, pegue a lamínula e seque sua borda contra um tecido de laboratório para remover o excesso de tampão de hibridização. Transfira a lamínula para a solução de oligo dT de biotina, certificando-se de que as células estejam voltadas para baixo e incubem a 42 graus Celsius por 60 minutos. Assim que a hibridização estiver concluída, adicione aproximadamente 500 microlitros de 2XSSC pré-aquecido aos poços da placa de 24 poços.

Em seguida, usando uma pinça, transfira a lamínula para o poço e incube-a a 42 graus Celsius por 10 minutos. Depois de corar ainda mais as células com solução de anticorpos, visualize as amostras usando um microscópio de fluorescência. Aqui são apresentadas imagens das células U-2 OS não tratadas que não contêm grânulos ou focos corados com marcadores de grânulos de estresse G3BP1, eIF4G e eIF3B.

Nas células U-2 OS tratadas com arsenito de sódio ou vinorelbina, foi induzida a formação de focos citoplasmáticos que contêm G3BP1, eIF4G e eIF3B. A co-localização desses marcadores foi confirmada pela análise de varredura de linha realizada para cada canal com aumento de aumento, seguida de superimposição dos gráficos obtidos. Além disso, os focos citoplasmáticos identificados nas células tratadas continham mRNA, conforme mostrado por poli A FISH.

O sinal oligo dT co-localizado com o sinal G3BP1 confirmando a identificação de grânulos de tensão. Uma vez dominado, todo esse fluxo de trabalho pode ser feito em três dias se for executado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imunofluorescência e hibridização fluorescente.

Etapas que são críticas para a correta caracterização e identificação de grânulos de tensão. Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso. Precauções como uso de EPI e ventilação adequada devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.