Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

O objetivo geral deste procedimento é avaliar simultaneamente vários locais potenciais de fosforilação e identificar locais para validação subsequente por mutantes do local de fosforilação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da bioquímica e da biologia celular sobre o papel das modificações pós-traducionais na sinalização celular. Essa técnica permite uma triagem preliminar fácil e econômica para locais de fosforilação e a proteína de interesse.

A implicação dessa técnica se estendeu ao diagnóstico e terapia de doenças, incluindo inflamação e câncer, porque a fosforilação é um evento bioquímico importante nas vias de sinalização em doenças humanas. Ajudando na demonstração estaria Sol-Bi Shin, um estudante de pós-graduação do meu laboratório que, durante a realização de mutagênese dirigida ao local. Primeiro, combine 50 nanogramas do plasma pGEX JST NRF2, 125 nanogramas de primer direto, 125 nanogramas de primer reverso, um microlitro de mistura DNTP, 2,5 unidades de PFU DNA polimerase e 10x tampão de reação em gelo.

Adicione água destilada estéril para aumentar o volume para 50 microlitros. Realize PCR para incorporar a fita mutante e, em seguida, resfrie a amostra em gelo por dois minutos. Adicione um microlitro de enzima de restrição DPNI à amostra resfriada.

Misture a amostra com pipetagem suave e, em seguida, centrifugue a amostra por um minuto a 13.000 vezes G. Incube a amostra a 37 graus Celsius por duas horas para digerir o DNA de fita dupla parental. Em seguida, jogue células de E.coli supercompetentes com mutações endA1 e RACA1 no gelo. Adicione 50 microlitros da mistura de reação às células resfriadas e incube no gelo por 30 minutos.

Enquanto isso, pré-aqueça um bloco de aquecimento a 42 graus Celsius. Quando a incubação estiver completa, aqueça a mistura a 42 graus Celsius por 90 segundos e depois resfrie a mistura no gelo por dois minutos. Adicione caldo de lisogenia pré-aquecido às células transformadas.

Incube a mistura a 37 graus Celsius por uma hora enquanto agita a 180 RPM. Em seguida, espalhe as células em placas de ágar ampicilina LB e incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Transfira uma única colônia para cinco mililitros de caldo de lisogenia com ampicilina.

Incube as amostras durante a noite a 37 graus Celsius enquanto agita a 180 RPM. Extraia o DNA da amostra usando um mini kit de preparação padrão para análise de sequência de DNA. Execute pelo menos 200 nanogramas de HDNA em um analisador de DNA para verificar a sequência mutante.

Expresse e purifique a proteína NRF2 mutante validada. Determinar a quantidade de NRF2 mutada produzida antes de proceder ao ensaio de quinase. Para iniciar o ensaio de competição de peptídeos, prepare uma solução tampão de quinase 5X com uma concentração de monofosfato de adenosina de 500 micromolar.

Em seguida, descongele amostras congeladas de NRF2 humano do tipo selvagem AMPK e três oliogopeptídeos imitando os locais de fosforilação de AMPK de NRF2. Para cada peptídeo, enquanto estiver no gelo, combine 0,43 miligramas do peptídeo com 0,15 microgramas de AMPK, 0,4 microgramas de NRF2 e seis microlitros de tampão quinase 5X. Adicione água destilada estéril para atingir um volume final de 30 microlitros.

Em seguida, em uma área blindada, defina um bloco de aquecimento para 30 graus Celsius. Adicione um microcurie de gamma 32P ATP a cada tubo, misturando bem cada solução pipetando para cima e para baixo. Incubar as misturas de reação a 30 graus Celsius por 15 a 30 minutos.

Durante a incubação, prepare o gel 7,5%STS PAGE. Em seguida, adicione três microlitros de tampão de amostra 10X STS a cada tubo e misture bem para interromper a reação da quinase. Execute as amostras no gel a 70 volts por 20 minutos e depois a 140 volts por uma hora.

Ao completar a eletroforese em gel, remova cuidadosamente o gel altamente radioativo abaixo da linha azul de bromofenol. Transfira suavemente o gel do rodízio para um tubo de vidro. Fixe o gel em uma solução de 50% de metanol, 40% de água e 10% de ácido acético por 20 minutos.

Em seguida, coloque delicadamente o gel em papel de filtro e cubra-o com filme transparente. Seque o gel com um secador de gel a vácuo por uma hora a 80 graus Celsius. Expor o gel seco a uma tela de fósforo ou a um filme de raios-x por aproximadamente 16 horas por dois dias, respectivamente.

Use um Phosphorimager para gerar um arquivo TIFF ou Bitmap de alta resolução da tela. Para iniciar o ensaio de atividade da AMPK, descongele amostras de AMPK e de GST NRF2 do tipo mutante e selvagem em gelo. Combine 0,4 microgramas de GST NRF2 mutante com 0,15 microgramas de AMPK e seis microlitros de tampão quinase 5X.

Adicione água destilada estéril para aumentar o volume para 30 microlitros. Prepare outra mistura de reação desta forma com 0,4 microgramas de GST NRF2 do tipo selvagem. Adicione um microcurie de gamma 32P ATP a cada frasco para injetáveis de reação.

Pipetar as misturas várias vezes para cima e para baixo e, em seguida, centrifugar brevemente as misturas. Incube as misturas a 30 graus Celsius por 30 minutos em uma área blindada e, em seguida, termine a reação de quinase com três microlitros de tampão de amostra 10X STS. Execute STS PAGE, fixe o gel e seque o gel usando as mesmas condições do ensaio de quinase competitiva.

Exponha o gel a uma tela de fósforo durante a noite e escaneie a tela com o Phosphorimager. Um ensaio in vitro de AMPK foi realizado na presença de três oligopeptídeos de 10 resíduos que imitam os locais de fosforilação da AMPK em NRF2 humano. O oligopeptídeo que mimetiza o sítio Serine 558 ofereceu a maior competição pela fosforilação da AMPK.

Um mutante NRF2 substituindo a serina 558 por alanina foi então sintetizado e avaliado em um ensaio de atividade in vitro. Muito pouca fosforilação de AMPK do mutante S558 A foi observada, indicando que a AMPK fosforila diretamente o NRF2 humano na Serina 558. Como os peptídeos se ligam competitivamente às proteínas, o princípio desse método também pode ser aplicado para identificar outras pós-traduções e modificações, como acetilização e resíduos de lisina e interações proteínas-proteínas.

Não se esqueça de que trabalhar com isótopos de rádio pode ser extremamente perigoso. O treinamento de segurança de isótopos de rádio já deve ser feito antes de realizar este procedimento.