Name: Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a avaliar a reserva de cálcio do retículo sarcoplasmático e a remoção diastólica em cardiomiócitos ventriculares isolados. Este método auxilia no estudo do manuseio de cálcio intracelular em condições patológicas como diabetes e insuficiência cardíaca.

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Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), a medicina e saúde ciência programa da província de Zhejiang (n. º 201646246, Dongwu Lai) e a ciência de saúde e Plano de tecnologia da cidade de Hangzhou (n. º 2013A28, Ding Lin).

todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de uso no centro de pesquisa Experimental, China Academy de chinês ciências médicas e Universidade de Zhejiang e institucional Cuidado Animal.
 1. preparação da solução <ol><li>preparar todas as soluções, conforme descrito na tabela 1.</li></ol>
 2. isolamento de esquerda Ventricular (LV) Cardiomyocytes Nota: LV cardiomyocytes são isolados enzimaticamente usando um sistema de perfusão Langendroff como descrito anteriormente, 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
<ol><li>Configurar o sistema de perfusão Langendroff. Encher o sistema de perfusão com solução de Tyrode Normal (NT), defina a temperatura de 36,5 ° c e eliminar quaisquer bolhas de ar no tubo.</li>
	<li>Pesar e anestesiar um rato Sprague-Dawley por injeção intraperitoneal (ip) de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirmar o estado anestésico através da avaliação da resposta de pitada de cauda ou dedo do pé após 5 min.</li>
	<li>Abrir a cavidade abdominal sob o apêndice xifoide com uma tesoura cirúrgica, levantar o processo xifoide e abra o baú com a tesoura. Remover o pericárdio, ligeiramente levantar o coração com pinça curvada, identificar o arco aórtico e cortou o coração pela tesoura da raiz da aorta.</li>
	<li>Transferir o coração para um prato de 60 mm e lavá-lo com solução de NT. Segure a aorta com duas pinças microdissecando, monte-a da cânula de perfusão de Langendorff e então firmemente ligate da aorta para a cânula usando suturas cirúrgicas. 
	Nota: Um operador hábil pode terminar este processo no prazo de 15 s.</li>
	<li>Perfundir o coração com solução de 30ml NT para recuperar a circulação das artérias coronárias. Em seguida, alternar o perfusato para 30ml Ca 2 +-livre solução de Tyrode (10mm taurina, 1 mg/mL BSA) para parar o batimento cardíaco. Em seguida, alternar o perfusato para solução de isolamento de colagenase A (0,6 mg/mL) para a digestão enzimática. 
	Nota: Utilização. um colagenase, para experimentos com ratos diabéticos, ou colagenase II para experimentos sem ratos diabéticos.</li>
	<li>Após digestão por 20-25 min, alterar rapidamente a solução de perfusão para o Ca 2 +-livre solução de Tyrode para parar mais a digestão. Em seguida, segurar o coração com fórceps, cortá-lo da cânula e colocar o coração em um prato de 35 mm, contendo solução KB (ver tabela 1).</li>
	<li>Dissecar a parede de LV com tesoura e pinça. Corte o átrio, o ventrículo direito e a área de junção atrioventricular. O tecido remanescente é o LV; transferi-lo para uma nova placa de 35 mm com solução KB. Picar o tecido LV em pedaços pequenos.</li>
	<li>Suavemente Pipetar as peças com um conta-gotas plástico filtrada e ressuspender em solução 10ml KB.</li>
	<li>Filtrar as células com 150 µm filtro de aço inoxidável de abertura e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 150 x g, durante 30 s e descartar o sobrenadante. Ressuspender os miócitos em solução 10ml KB, gratuito se contentar com 6 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em solução 10ml KB. 
	Nota: Todas as medidas foram realizadas a 36 ° C em soluções gaseadas com 100% O 2.</li>
</ol> 3. Reintrodução de cálcio <ol><li>depois de ter resolvido por 20 min em solução KB, desprezar o sobrenadante e ressuspender os miócitos com solução de reintrodução de cálcio A (0,3 mM Ca 2 +, 4,5 mL de Ca 2 +-livre solução de Tyrode, NT de 1,5 mL de solução) durante 10 min.</li>
	<li>Repita o procedimento acima com solução de reintrodução de cálcio B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL de Ca 2 +-livre solução de Tyrode, NT de 3 mL de solução).</li>
	<li>Repita o procedimento acima com solução NT (1.2 mM) Ca 2 + para purificar os miócitos disponíveis. Armazenar os miócitos LV isolados nesta solução e estudá-los dentro de 4-6 h.</li>
</ol> 4. Set Up de perfusão sistema <ol><li>conectar o tubo de entrada com a solução de NT para perfusão de câmara ( figura 1A).</li>
	<li>Para perfusão de agulha de miócito o alvo, ligue a Multi barril ponta múltipla (por exemplo, lápis de perfusão, doravante conhecido como lápis), fixado no micromanipulador, com a válvula controlada sistema de perfusão. Adicionar a solução de NT e solução de cafeína de 10 mM para cada coluna do lápis ( figura 1A).</li>
	<li>Evacuar quaisquer bolhas de ar nos tubos para evitar o bloqueio de ar.</li>
	<li>Contar o número de gotejamento da ponta micron do lápis para 10 s e manualmente ajustar o regulador de fluxo para manter a velocidade de fluxo a uma velocidade aproximada de 3 s. gotejamento/10</li>
</ol> 5. Medições de intracelular Ca 2 + transitório e encurtamento do sarcômero 7 , 8 , 9 <ol><li>suspensão de células pipeta de 10 µ l do slide, contar o número de células por um contador de células sob o microscópio e calcular a densidade. Diluir miócitos para uma concentração aproximada de 50.000 células/mL.</li>
	<li>Adicionar o Fura-2 acetoximetil (AM) estoque (um corante sensível de cálcio) em uma suspensão de 1 mL de miócitos para trazer a concentração final de 2 µM. manter no escuro por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar 150g por 30 s e ressuspender o cardiomyocytes com solução NT 2 vezes.</li>
	<li>Turn off a luz e manter as células no escuro. Coloca os miócitos na câmara de perfusão por 15 min. Então comece a perfusão de câmara (1,5 mL/min) com solução de NT. Ritmo, os miócitos com estimulação de campo 1 Hz usando um estimulador (duração onda 4,0 ms, amplitude de pulso 8.0 V) 5 min.</li>
	<li>Selecione um miócito com boa forma (forma de haste, borda em ponto e limpar as estrias transversais) e contração muscular estimulada estável (nenhuma contração espontânea) sob o microscópica lente objetiva de 10x. Em seguida, alterar a ampliação microscópica de 40x e girar a orientação da câmera CCD para manter o miócito na posição horizontal.</li>
	<li>Frame o único miócito ajustando o adaptador de enquadramento de célula. Certifique-se de que o plano de fundo é claro.</li>
	<li>Expor os miócitos a luz emitida por uma lâmpada de xénon, com 340 ou 380 nm de comprimento de onda da excitação filtros e os miócitos através de um objectivo de 40 x da imagem. Detectar o sinal de fluorescência em 510 nm. Entretanto, observe as mudanças de comprimento do sarcômero dos miócitos e gravar usando o módulo de macio-borda simultaneamente.</li>
	<li>Registro de fluorescência por um sistema de photomultiplier dual-excitação da fluorescência. Execute o programa de gravação para o cálcio, sistema de imagem, clique em &#34; arquivo/novo arquivo &#34; para criar um novo arquivo de gravação e clique no &#34; iniciar &#34; botão para comprimento de fluorescência e sarcômero sincronicamente registro.</li>
</ol> 6. Avaliação do SR Ca 2 + reserva e diastólica Ca 2 + função de remoção de 7 , 8 , 9 <ol><li>Interlink o &#34; Aux Out &#34; porto em o estimulador com o &#34; analógico em &#34; porto no sistema de controle de válvula (por exemplo, comandante da válvula, consulte Tabela de materiais) por um cabo BNC (para sincronizar o sinal TTL).</li>
	<li>Um programa para mudar as válvulas de perfusão automaticamente como descrito anteriormente 8 , 9; pré-estabelecido As etapas detalhadas para a operação são listadas como seguindo.
	<ol><li>Preset os parâmetros na válvula controlam de software de acordo com a tabela 2 e clique o &#34; Download &#34; o botão para baixar a sequência carregado no programa. Clique o &#34; Trigger &#34; botão para habilitar a função de gatilho. 
		Nota: O sistema de controle de válvula pode executar a sequência depois de receber sinal TTL.</li>
		<li>Pré-ajuste o estimulador para o modo de sequência e definir os parâmetros conforme tabela 3.</li>
	</ol></li> <li>Definir o estimulador em &#34; passo S1 &#34; ao ritmo do LV miócitos de 1 Hz. iniciar a perfusão de agulha na velocidade de 1,5 mL/min com solução NT. 
	Nota: Porque a velocidade do fluxo de agulha é mais rápido do que a perfusão de câmara, a refração de luz do fluxo de agulha é diferente da luz refração da perfusão de câmara. A diferença de refração de luz indica o intervalo de perfusão de agulha eficaz, que rodeia o alvo miócito.</li>
	<li>Selecione um miócito alvo sob a visão microscópica de baixa potência (na sequência de jusante para montante), e certifique-se que pode ser alcançado pela micro ponta do lápis. Altere a ampliação do microscópio para 400 x. Gire a orientação da câmera CCD para manter o miócito na posição horizontal. Ajuste a abertura retangular sob o adaptador de enquadramento de célula para uma janela apropriada que enche os miócitos. Certifique-se de que não há fundo mínimo; Não permita que outros miócitos ou restos de células mortas nesta janela.</li>
	<li>Ajustar a posição do lápis fixada sobre o micromanipulador e cuidadosamente coloque a ponta micro à distância do raio de campo de visão para o miócito alvo menos de 400 x ampliação do microscópio.</li>
	<li>Ajustar o intervalo de fluxo de agulha para principalmente cobrir o alvo miócito e certifique-se de que o miócito não pode ser arrastado pelo fluxo agulha.</li>
	<li>Após 60 s básica de estimulação, role o cursor estimulador para o &#34; D2 passo &#34;. 
	Nota: O resto do protocolo será executado automaticamente pelo sistema de controle de válvula e estimulador. Com base na configuração acima, o protocolo pode ser executado automaticamente como Figura 2A, 1 Hz básica de estimulação com solução NT para 60 s. Então pausar o ritmo e atraso de 2 s, alternar rapidamente para perfusão de cafeína 10 mM por 15 s (para funcionalmente versão Ca 2 + armazenamento no SR) e em seguida, mudar novamente para solução NT.</li>
	<li>No final da gravação, detectar a fluorescência de fundo para myocytes individuais. Clique o &#34; pausa &#34; botão para pausar a gravação, o arquivo mover a visualização microscópica de uma área em branco nas proximidades. Clique o &#34; registro &#34; o botão para retomar a gravação por segundos e gravar numérica 340 e 380 nm intensidade valores para correção de fundo.</li>
	<li>Aberto a &#34; constante de operação/&#34; caixa de diálogo e preencher os valores para o &#34; fundo &#34; formar, respectivamente, o software pode corrigir valores de proporção Fura 2 subtraindo-se o plano de fundo.</li>
</ol> 7. Análise de dados 9 <ol><li>para medições de transientes de cálcio e sarcômero encurtamento na fase de estimulação básica, média os impulsos de contração muscular e em seguida analisar parâmetros dinâmicos, tais como transientes de cálcio, a constante de tempo decaimento de transiente de cálcio (Tau-1 Hz), usando o software automaticamente. 
	Nota: Se o software não encaixava bem no segmento de decadência, o rastreamento de declínio para o encaixe de curva mono-exponencial manual de exportação.</li>
	<li>Para pulsos de cálcio induzida por cafeína, selecione apenas o pulso com uma onda íngreme para análise da função de remoção de cálcio. Excluir células com perturbação do sinal, pulso anormal ou aqueles que fluiu fora midway.</li>
	<li>Medir a amplitude do pulso induzida por cafeína cálcio (Ca-cafeína, um índice da SRCa 2 + reserva).</li>
	<li>Obter a constante de tempo de queda do pulso de cálcio induzida por cafeína (Tau-cafeína) por mono-exponencial curva encaixe (duração de 10 s) manualmente do software ( Figura 2).</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li>
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<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+inhibition+in+heart+failure%2C+beneficial%2C+harmful%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Fluxo de cálcio libertado o SR é a principal fonte de Ca2 + para sístole no coração. Em certa medida, a amplitude do SR Ca2 + conteúdo e o fracionário Ca2 + libertado o SR refletir SR Ca2 + reserva disponível para a contração cardíaca. Por outro lado, a Ca2 + reserva de SR depende da capacidade de recaptação de SR Ca2 + , Ca2 + vazamento de SR e seu equilíbrio através do SR durante a diástole12,<sup class="xref...

Cálcio intracelular ([Ca2 +]eu) reciclagem desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes1. Como sabemos, induzida por cálcio Ca2 + versão inicia o acoplamento, excitação-contração que traduzir o sinal elétrico para a contração. Despolarização da membrana ativa mecanismos L-tipo Ca2 + canais, que induzem Ca2 + lançamento do SR para o citoplasma via receptores ryanodine 2 (RyR2). Os transientes elevados citoplasmática Ca2 + inicia a contração das miofibrilas. Durante a diástole, citoplasmática Ca2 + é reuptaken para o SR mediante o SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) e bombeado fora os casos atravésdo nd+-Ca 2 + trocador (NCX)2. Este processo leva a reciclagem nos casos de contração-relaxamento.
O SR cardíaca é uma rede intracelular da membrana que rodeia a maquinaria contrátil. Ele serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, e ele reabsorve intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para a contratilidade cardíaca. Entretanto, a remoção do intracelular Ca2 + é crítica para a diástole cardíaca. Sob algumas condições fisiopatológicas, loja em cardiomyocytes como diabetes e insuficiência cardíaca, prejudicada Ca2 + desembaraço e deprimido SR Ca2 + pode estar envolvida no processo de disfunção cardíaca2,3 ,4.
Para medir o SR Ca2 + liberação e diastólica Ca2 + remoção em cardiomyocytes, existem duas abordagens amplamente utilizadas: a integridade da corrente NCX baseado no remendo-braçadeira5,6e o Ca induzida por cafeína 2 + pulso baseado no Ca2 + fluorescência de imagem7,8,9. A primeira abordagem depende do fato de que o Ca2 + libertado o SR é largamente bombeado fora da célula por NCX. No entanto, essa abordagem é limitada pela sua exigência de equipamento avançado e hábil operação. No presente estudo, descrevemos uma abordagem conveniente para avaliar SR Ca2 + reserva e Ca2 + remoção em miócitos medindo induzida por cafeína Ca2 + pulso com base em um Ca2 + fluorescência sistema de imagem. Brevemente, intracelular Ca2 + fluorescência é indicada pelo Fura-2. Pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão, apresentamos um programa para mudar a perfusão e automaticamente o sistema de estimulação. cafeína de 10 mM foi empregada para induzir rapidamente total Ca2 + lançamento no Sr. As constantes de tempo de decaimento exponencial (Tau) de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio foram obtidas de mono-exponencial curva de encaixe, que refletem a contribuição da SERCA e NCX para remoção de Ca2 + diastólica em conformidade.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutâmico</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>cafeína</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Langendorff</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Links</td><td></td>Marchauser <td>MM33</td></tr><tr><td>Câmara de perfusão</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>Válvula Sistema de perfusão por gravidade controlada</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>software de comando de válvula</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de fluxo de precisão</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Lápis de perfusão de coletor multibarril</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Micron Ponta Removível</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um I.d.</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de Medição de Fluorescência e Dimensionamento de Células</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Software de gravação</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Ratos Sprague-dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em cardiomyocytes ventricular isolado

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Retículo sarcoplasmático cardíaco (SR) serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, que reuptakes intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para contractibility cardíaca, e a remoção de intracelular Ca2 + é crítica para a função cardíaca diastólica. Sob algumas condições fisiopatológicas, tais como diabetes e insuficiência cardíaca, liberação de cálcio prejudicada e SR Ca2 + loja em cardiomyocytes podem estar envolvidos no progresso da disfunção cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar SRCa2 + reserva e diastólica Ca2 + remoção. Brevemente, um único casos estava enzimaticamente isolado, e a intracelular Ca2 + fluorescência indicada pelo Fura-2 foi gravada por um sistema de imageamento de cálcio. Para empregar a cafeína para indução total SR Ca2 + lançamento, nós um programa de interruptor automático perfusão pré-estabelecido pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão. Em seguida, o encaixe de curva mono-exponencial foi usado para a análise de constantes de tempo de decaimento de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio. Nesse sentido, a contribuição do SR Ca2 +-ATPase (SERCA) e at+-Ca2 + trocador (NCX) para remoção de cálcio diastólica foi avaliada.

Aqui, ilustramos estreptozotocina (STZ) - induzida ratos diabéticos (DM) e idade-combinadas Sprague - Dawley (SD) ratos por exemplo. ratos machos de SD 8 semanas (200 ± 20 g) receberam uma única injeção intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para o buffer de grupo ou citrato de DM para o grupo de controle. Uma semana após a administração de STZ, ratos com glicemia &#62; 16.7 mmol/L foram considerados diabéticos. Depois de 8 semanas, os miócitos de LV foram enzimaticamente isolados. Após a ...

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca2 + reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a reserva de cálcio do retículo sarcoplasmático e a função de remoção intracelular de cálcio diastólico em cardiomiócitos isolados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o mecanismo de manuseio intracelular de cálcio em certas condições fisiopatológicas, como diabetes e insuficiência cardíaca. A principal vantagem desta técnica é a conveniência e a menor dependência de equipamentos e habilidades técnicas especializadas.Para iniciar este procedimento, monte o sistema de perfusão Langendorff. Encha o sistema de perfusão com solução NT, ajuste a temperatura para 36,5 graus Celsius e elimine todas as bolhas de ar no tubo. Em seguida, abra a cavidade abdominal sob o processo xifoide, levante o processo xifoide e abra o tórax com uma tesoura.Em seguida, remova o pericárdio, levante levemente o coração com pin&ccedil;as curvas, identifique o arco a&oacute;rtico e corte o coração na raiz da aorta. Depois disso, transfira o coração para uma placa de 60 mil&iacute;metros e lave-o com solu&ccedil;&atilde;o NT. Segure a aorta com duas pin&ccedil;as microcir&uacute;rgicas e monte-a na cânula de perfus&atilde;o Langendorff.Em seguida, ligue firmemente a aorta à cânula utilizando fios cirúrgicos. Posteriormente, perfunda o coração com 30 mililitros de solução NT para recuperar a circulação das artérias coronárias. Em seguida, mude o perfusato para 30 mililitros de solução de Tyrode livre de cálcio para interromper os batimentos cardíacos.Em seguida, troque o perfusato pela solução de isolamento com colagenase A para a digestão enzimática. Após a digestão por 20 a 25 minutos, mude rapidamente a solução de perfusão para a solução de Tyrode sem cálcio para interromper a digestão adicional. Em seguida, segure o coração com pinça, corte-o da cânula e coloque o coração em uma placa de 35 milímetros contendo solução KB.Em seguida, identifique a área do ventrículo esquerdo. Remova o átrio, o ventrículo direito e a região da junção átrio-ventricular. Em seguida, transfira o ventrículo esquerdo para um novo recipiente de 35 milímetros contendo solução KB e pique o tecido em pequenos pedaços.Pipete suavemente os fragmentos com uma pipeta plástica filtrada. Em seguida, filtre as células com um filtro de aço inoxidável de 150 micrômetros de abertura e transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Após isso, centrifugue a amostra a 150 ×g por 30 segundos e descarte o sobrenadante.Resuspenda os miócitos em 10 mililitros de solução KB e deixe repousar por seis minutos. Posteriormente, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de solução KB por 20 minutos. Após repouso na solução KB por 20 minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda os miócitos com a solução A de reintrodução de cálcio. Repita o procedimento acima com a solução B de introdução de cálcio. Em seguida, repita o procedimento acima com a solução NT para purificar os miócitos disponíveis.Armazene os miócitos ventriculares esquerdos isolados nesta solução e analise-os dentro de quatro a seis horas. Em seguida, adicione solução NT e solução de cafeína 10 milimolar a cada coluna do lápis. Remova todas as bolhas de ar presentes nos tubos para evitar obstrução por ar.Agora, conecte o tubo de entrada à solução NT para a perfusão da câmara. Para a perfusão com agulha do miócito-alvo, conecte a ponta do manifold multicanal ao sistema de perfusão controlado por válvula. Em seguida, conte o número de gotas provenientes da ponta micrométrica do lápis durante 10 segundos e ajuste manualmente o regulador de fluxo para manter a velocidade do fluxo em aproximadamente três gotas a cada 10 segundos.Neste procedimento, adicione o estoque de fura-2-acetoximetil em um mililitro da suspensão de miócitos para obter uma concentração final de dois micromolares. Mantenha-os no escuro por 20 minutos à temperatura ambiente. Após esse período, descarte o sobrenadante e ressuspenda os cardiomiócitos com solução NT duas vezes.Em seguida, desligue a luz e mantenha as células no escuro. Coloque os miócitos na câmara de perfusão por 15 minutos antes de perfundi-los com solução NT. Estime os miócitos com estimulação de campo de um hertz por cinco minutos usando um estimulador.Agora, selecione um miócito com boa forma e contração estimulada estável sob a lente objetiva do microscópio de 10X. Clique em Arquivo Novo Arquivo para criar um novo arquivo de gravação. Em seguida, altere a ampliação do microscópio para 40X e gire a orientação da câmera CCD para manter o miócito em posição horizontal.Em seguida, enquadre o miócito individual ajustando o adaptador de enquadramento celular e certifique-se de que o fundo esteja limpo. Posteriormente, exponha os miócitos à luz emitida por uma lâmpada de xenônio com filtros de excitação de comprimento de onda de 340 ou 380 nanômetros e visualize os miócitos por meio de uma objetiva de 40X. Detecte o sinal fluorescente em 510 nanômetros.Clique no botão Iniciar para gravar simultaneamente a fluorescência e o comprimento do sarcômero utilizando o sistema de fotomultiplicador de fluorescência com excitação dupla. Observe as alterações no comprimento do sarcômero dos miócitos e realize a gravação simultaneamente usando o módulo soft edge. Neste procedimento, conecte a porta aux out do estimulador à entrada analógica do sistema de controle de válvula por meio de um cabo BNC.Em seguida, ajuste os parâmetros no software de controle da válvula, clique no botão de download para baixar a sequência carregada no programa e clique no botão de gatilho para habilitar a função de gatilho. Depois, configure o estimulador no modo de sequência e defina os parâmetros. Posteriormente, ajuste o estimulador no passo S1 para estimular os miócitos do VE a um hertz.Inicie a perfusão com a agulha na velocidade de 1,5 mililitros por minuto com a solução NT. Selecione um miócito-alvo sob a visão microscópica de baixo aumento e certifique-se de que ele possa ser alcançado pela microponta do lápis. Em seguida, altere a magnificação do microscópio para 400X.Gire a orientação da câmera CCD para manter o miócito na posição horizontal. Em seguida, ajuste a abertura retangular sob o adaptador de enquadramento da célula para uma janela adequada que seja preenchida pelos miócitos. A seguir, ajuste a posição do lápis fixado no micromanipulador e coloque cuidadosamente a microponta à distância do raio do campo de visão em relação ao miócito-alvo.Em seguida, ajuste a faixa do fluxo da pipeta para cobrir principalmente o miócito-alvo e certifique-se de que o miócito não possa ser arrastado pelo fluxo da pipeta. Após 60 segundos de estimulação básica, mova o cursor do estimulador para o passo D2. O restante do protocolo será executado automaticamente pelo estimulador e pelo comandante de válvulas.Clique no botão Pausar para interromper a gravação do arquivo e mova a visão microscópica para uma área em branco próxima. Em seguida, clique no botão Gravar para retomar a gravação por segundos e registrar os valores numéricos de intensidade nas nanometragens de 340 e 380 para correção do fundo. Depois disso, abra a caixa de diálogo Constante de Operação e preencha os valores no formulário de fundo.O software pode corrigir os valores da razão fura-2 subtraindo o fundo. Aqui é mostrada uma ilustração do protocolo para alternar automaticamente as válvulas de perfusão e o sistema de marca-passo. Esta figura mostra os valores estatísticos da reserva de cálcio do retículo sarcoplasmático e da liberação fracional de cálcio para contrações estimuladas a um hertz nos grupos diabético e Sprague Dawley.O grupo diabético apresentou reserva de cálcio no retículo sarcoplasmático e liberação fracional de cálcio pelo retículo sarcoplasmático significativamente reduzidas em comparação com o grupo Sprague Dawley. Aqui, o painel do software mostra um ajuste manual de curva monoexponencial para a constante de tempo de decaimento do pulso de cálcio induzido por cafeína. Esses gráficos de barras comparam a Tau-cafeína e a relação Tau-1Hz/Tau-cafeína entre os grupos diabético e Sprague Dawley.O grupo diabético apresentou valores significativamente aumentados de Tau-cafeína e Tau-1Hz/Tau-cafeína em comparação com o grupo Sprague Dawley. Este procedimento fornece uma ferramenta viável e conveniente para explorar o mecanismo de manuseio intracelular de cálcio na disfunção cardíaca. Ao tentar realizar este procedimento, existem alguns pontos-chave que devem ser observados, como a aderência estável dos miócitos à placa, o envolvimento da chave de canal, o controle da velocidade de fluxo da perfusão por agulha e a distância apropriada entre a ponta da agulha e o miócito-alvo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Este trabalho descreve um protocolo que avalia as alterações da sensibilidade do miofilamento Ca2+ durante a contração em miócitos cardíacos isolados do coração de ratos. Juntamente com a eletrofisiologia cardíaca, os níveis sistólicos/diastólicos de citosol Ca2+ e a contração/relaxamento, essa medição é imperativa para sustentar os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaca em corações saudáveis e doentes.

Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Aqui, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial de um modelo do rato de metabólica relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada. Uma regulação manual da pressão intraluminal de cavidades cardíacas é implementada para render funcionalmente intactos miócitos apropriados para estudos de acoplamento excitação-contração.

Isolamento dos Cardiomyocytes Atrial de um modelo do rato de metabólicas relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada

Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

Este protocolo visa descrever passo a passo a técnica de extração e avaliação da função cardíaca utilizando cardiomiócitos esfolados. Esta metodologia permite a medição e a sintomadulação aguda da função de miofilament usando pequenas biópsias congeladas que podem ser coletadas de diferentes locais cardíacos, de camundongos a homens.

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (&lt;50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.

Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Um conjunto de protocolos são apresentados que descrevem a medida da função contrátil via detecção do comprimento do sarcômero juntamente com a medição transitória de cálcio (Ca2+) em miócitos isolados de ratos. A aplicação desta abordagem para estudos em modelos animais de insuficiência cardíaca também está incluída.

Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores

Este protocolo descreve um método para medir simultaneamente o diâmetro citosólico, de cálcio livre [Ca2+]i e do vaso em vasos linfáticos em contração em tempo real e, em seguida, calcular as concentrações absolutas de Ca2+ , bem como os parâmetros de contratilidade/ritmidade. Este protocolo pode ser usado para estudar Ca2+ e dinâmica contrátil em uma variedade de condições experimentais.

Avaliação em tempo real de Ca2+ absoluto, citosólico, livre e contratilidade correspondente em vasos linfáticos isolados e pressurizados

Aprenda a avaliar a reserva de cálcio do retículo sarcoplasmático e a remoção diastólica em cardiomiócitos ventriculares isolados. Este método auxilia no estudo do manuseio de cálcio intracelular em condições patológicas como diabetes e insuficiência cardíaca.

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Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

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