Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas de ligação ao RNA em células vivas e mapear suas regiões de ligação ao RNA usando fotoreticulação mediada por UV seguida de espectrometria de massa. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, como quais reguladores epigenéticos estão ligados ao RNA e quais regiões de proteínas são necessárias para as interações. A principal vantagem dessa técnica é que ela não envolve a purificação dos complexos de RNA de proteína e, portanto, requer pouco material e identifica proteínas ligadas a qualquer tipo de RNA.

Conforme apresentado, este método se concentra em proteínas nucleares porque esse é o nosso interesse científico, mas com pequenas modificações nas etapas de fracionamento, ele poderia ser usado para estudar RNA e proteínas de ligação em outros compartimentos estudandulares. Depois de cultivar e expandir as ESCs de camundongos de acordo com o protocolo de texto, expanda as células para o número necessário de placas de 10 centímetros. Antes que as placas atinjam a confluência, adicione quatro SU diretamente no meio até uma concentração final de 500 micro molares.

Deixe os pratos de controle 4sU sem tratamento. Agite suavemente as placas para distribuir homogeneamente o 4sU por todo o meio e, em seguida, devolva as placas à mesma incubadora de cultura de tecidos por duas horas. A eficiência da incorporação de 4sU varia entre os tipos de células e, portanto, pode ser necessário otimizar sua concentração e tempo de incubação para garantir uma reticulação eficiente e minimizar a toxicidade.

Em seguida, transfira os pratos para um balde de gelo e descarte o meio. Em seguida, use 5 mililitros de PBS gelado para enxaguar suavemente as placas. Adicione 2 mililitros de PBS gelado e coloque as placas sem tampas em um reticulador equipado com lâmpadas emissoras de UV-B.

Irradie as placas a uma configuração de energia de 1 Joule por centímetro quadrado. A reticulação UV eficiente é fundamental. Recomendamos o uso de luz UV-B, mas UV-A também pode ser usado.

Em qualquer caso, a quantidade de energia UV utilizada deve ser otimizada e pode ser monitorada por PAR-CLIP ou ChIRP. Use elevadores de células para coletar as células e transferi-las para PBS gelada em tubos cônicos. Em seguida, centrifugue as células a 2000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de PBS gelado com 2 milimolares de EDTA e 0,2 milimolar de PMSF. Com um hemocitômetro, conte as células. Espere cinco a dez e dez a vinte milhões de células de placas de 10 centímetros e 15 centímetros, respectivamente.

Em seguida, centrifugue as células a 2000 vezes g e 4 graus Celsius por cinco minutos. Para isolar os núcleos das células, prepare o tampão A gelado conforme descrito no protocolo de texto. Antes de usar, adicione 0,5 milimolar DTT e 0,2 milimolar PMSF à quantidade desejada de tampão A.Adicione 2 mililitros do tampão frio às células para lavá-las e, em seguida, gire as células a 2500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e adicione o tampão A suplementado com 0,2% de um detergente não iônico e não desnaturante e, em seguida, gire a amostra a 4 graus Celsius por cinco minutos. Depois de girar as células a 2500 vezes g por cinco minutos, remova o sobrenadante. O pellet compreende núcleos intactos desprovidos de citoplasma.

Para lisar os núcleos, adicione 200 microlitros de tampão de lise ao tubo. Use uma sonda de 1/8 de polegada para sonicar a amostra para cisalhar a cromatina em uma configuração de amplitude de 50% por cinco a dez segundos. Gire a amostra a 12000 vezes g por cinco minutos e colete apenas 175 microlitros de sobrenadante para evitar o pellet.

Em seguida, meça a concentração de proteína por meio do ensaio de Bradford ou técnica semelhante. Em seguida, use o tampão de lise para diluir a proteína nas diferentes amostras para 1 miligrama por mililitro ou a concentração mais baixa da amostra. Adicionar solução de DTT 5 milimolares ao lisado nuclear e incubar a amostra à temperatura ambiente durante uma hora.

Em seguida, adicione 14 milimolares de iodoacetamida de estoque fresco e incube o lisado em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Diluir o lisado com cinco vezes o volume de bicarbonato de amônio 50 milimolar e, em seguida, adicionar tripsina. Incubar a amostra a 37 graus Celsius durante a noite.

Para preparar uma ponteira de platina personalizada por amostra, coloque um disco de material C18 de extração em fase sólida no fundo de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros. Adicione 50 microlitros de resina de fase reversa Oligo R3 em cima do disco C18, coloque a ponta do estágio dentro de um adaptador de centrifugação e coloque o adaptador dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 100 microlitros de acetonitrila 100% às pontas para lavá-las.

Em seguida, centrifugue as pontas a 1000 vezes g por um minuto para remover o solvente. Equilibre as pontas com 50 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1% ou TFA. Em seguida, gire-os novamente.

Adicione 100% de ácido fórmico à amostra de proteína digerida para diminuir o PH para 2 a 3. Em seguida, carregue a amostra em uma ponta de platina feita sob medida e centrifugue a amostra a 1000 vezes g por um minuto até que toda a amostra passe pela ponta. Lave os peptídeos ligados com 50 microlitros de 0,1 por cento de TFA.

Então, depois de girar a amostra a 1000 vezes g por um minuto, eluir os peptídeos adicionando 50 microlitros de tampão de eluição à ponta do estágio e centrifugue a 1000 vezes g por um minuto para forçar o tampão de eluição para fora da ponta. Utilizar uma centrifugadora de vácuo regulada para 150 vezes g e 1 a 3 quilopascais durante uma hora para secar a amostra. Para remover o RNA reticulado da amostra, ressuspenda o pellet em 50 microlitros de tampão nuclease 2x.

Meça a concentração de peptídeos em 280 nanômetros assumindo 1 miligrama por mililitro de peptídeos para e A280 de 1. Use 2x tampão de nuclease para ajustar todas as amostras para um miligrama por mililitro ou para a concentração mais baixa e, em seguida, prepare uma mistura principal de 50 microlitros de água mais 1 microlitro de nuclease de alta pureza por amostra. Combine 50 microlitros de amostra de peptídeo com 50 microlitros de água mais mistura principal de nuclease.

Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por uma hora. Por fim, realizar cromatografia nanolíquida, espectrometria de massa e processamento de dados de acordo com o protocolo de texto. Esta figura mostra um gráfico de vulcão de um resultado de ID RBR de ESCs de camundongos.

Os peptídeos que se sobrepuseram a um domínio de motivo de reconhecimento de RNA estão em azul e mostram níveis de depleção altamente consistentes. Um peptídeo de ligação ao RNA do HNRNPC é destacado em vermelho. Aqui é mostrado um mapa de calor das pontuações de id RBR que são calculadas como uma estimativa da probabilidade de ligação ao RNA de uma região de proteína.

O escore é projetado na superfície da subunidade spliceossômica U1-70k. A cor vermelha brilhante nas proximidades do contato do RNA, conforme determinado pela estrutura cristalina, indica a identificação correta da interação do RNA da proteína. Nesta figura, o TET2 é apresentado como um novo RBP e a atividade de ligação ao RNA é mapeada para uma região terminal C, traçando a pontuação de id RBR ao longo da sequência primária da proteína.

Finalmente, o requisito para este novo RBR pode ser verificado realizando PAR-CLIP usando a sequência do tipo selvagem e comparando o sinal com o de um mutante sem o RBR previsto. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete a oito horas ao longo de dois dias, se for executada corretamente. Antes da reticulação, as células podem ser estimuladas com vários tratamentos para responder a perguntas adicionais, como como a diferenciação começa ou como o ciclo celular regula as interações das proteínas de RNA.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar extras contendo complexos de RNA de proteína reticulados para identificar locais de interações de RNA de proteína com espectrometria de massa.