Name: Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a identificar proteínas de ligação ao RNA e mapear suas regiões em células vivas usando fotocrosslinking UV e espectrometria de massa. Este método avançado estuda interações epigenéticas sem purificação.

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R.B. foi apoiada pelo programa de estudiosos de Searle, Fundação Smith W.W. (C1404) e a marcha de Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconhece que o apoio do NIH concede R01GM110174 e NIH R01AI118891, bem como DOD conceder BC123187P1. R.W. '-T. foi apoiada pelo subsídio de formação de NIH T32GM008216.

1. cultura e expansão de mESCs Nota: as células estaminais embrionárias de rato são fáceis de cultura e pode ser expandidas rapidamente para os grandes números exigidos pelo bioquímicas experiências graças a seu tempo de ciclagem rápida. MESCs saudáveis dobrar a cada 12 h.
<ol><li>MESCs expandir para o número desejado em placas gelatinizadas no mESC médio (veja abaixo) em uma incubadora de cultura de tecidos mantido a 37 ° C, 5% de CO 2, e &#62; 95% de umidade. 
	Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 milhões de células) é mais do que suficiente para replicar cada biológico.</li>
	<li>o meio de mESCs é composto por Dulbecco &#39; s modificado águia &#39; meio de s (DMEM) suplementado com 15% soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 0.5 x penicilina/estreptomicina, 1 x não aminoácidos essenciais, 100 µM beta-Mercaptoetanol, 1.000 U /mL leucemia inibitório fator (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.</li>
	<li>Antes de passagem mESCs, prepare o número desejado de placas de 10 cm.
	<ol><li>Adicionar 4 mL de 0.1% de gelatina em água, certificando-se de que toda a superfície da placa é coberta; incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT); remover a solução de gelatina.</li>
	</ol></li> <li>Passagem de células quando atingirem 10 milhões de células por prato, tipicamente ~ 48 h após a inoculação. 
	Nota: Como mESCs crescer em colônias densas, placas nunca poderão alcançar confluência de 100%, como observado por linhas de células que crescem em monocamadas (por exemplo, HEK293 ou células 3T3). Uma placa de mESC deve ser passada quando ~ 50% confluente e definitivamente antes o meio fica amarela.
	<ol><li>Para separar as células, lavar pratos com culturas densas mESC uma vez em 1 x solução salina tampão fosfato (PBS) suplementada com 2 mM de EDTA, em seguida, adicionar tripsina 0,05% dissolvida em DMEM e retornar placa a incubadora por 5 min (37 ° C, 5% de CO 2, e &#62; 95% umidade).</li>
		<li>Retirar a placa da incubadora e ressuspender as células com igual volume de DMEM pipetando subindo e descendo vigorosamente várias vezes.</li>
		<li>Contar células usando hemocytometer e certifique-se de que as células formam uma suspensão de célula única (ou seja, sem clusters), centrifugar célula mistura 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender células em 1-2 mL DMEM.</li>
		<li>Inocular as células em uma densidade de 10.000 células/cm 2 no meio de mESC (ou seja, ~ 800.000 células por placa de 10 cm) usando as placas revestidas gelatina preparadas na etapa 1.3.1.</li>
	</ol></li></ol> 2. Ligação cruzada de proteínas &#8211; interações RNA nas células ao vivo Nota: reticulação de RNA-proteína é mediada pelo ribonucleoside foto-ativável analógico 4-thiouridine (4SU). 4SU tem um máximo de absorbância mais tempo do que endógenos nucleotídeos e só pode ser incorporada do RNA; Portanto, o intermediário-comprimento de onda UVB pode ser usado para seletivamente crosslink RNA proteínas 25 , 26. Tratamento de UVB de células tratadas 4SU leva a ligações covalentes cruzadas entre 4SU contendo RNA e aminoácidos, com uma preferência relatado por Tyr, Trp, Met, Lys e Cys 27.
<ol><li>MESCs expandir para o número necessário de placas de 10 cm, como descrito no passo 1. 
	Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 milhões de células) é suficiente para cada biológico replicar.</li>
	<li>Antes que as chapas atinjam a confluência, adicionar 4SU diretamente em meio a uma concentração final de 500 µM. deixe - 4SU pratos de controle não tratados.</li>
	<li>Placas de agitar suavemente para distribuir o 4SU homogênea em toda a mídia. Devolvê-los para a mesma cultura de tecidos incubadora para 2h (37 ° C, 5% de CO 2, e &#62; 95% de umidade).</li>
	<li>Placas de transferência para um balde de gelo e descarte o meio.</li>
	<li>Lavar a placa suavemente com 5 mL de PBS gelado. 
	Nota: Lave suavemente ou células podem desanexar.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de placas geladas de PBS e lugar sem tampas em um agente reticulante equipado com lâmpadas emissoras de UVB (312 nm). A irradiação de placas em uma configuração de energia de 1 J/cm 2. 
	Nota: É fundamental que tampas plásticas são removidas ou pode proteger as células de luz UV e evitar reticulação.</li>
	<li>Recolher pilhas usando levantadores de célula e transferir para PBS gelado em tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 x g por 5 min, 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender células em 5 mL PBS gelado com 2 mM EDTA e 0,2 mM phenylmethylsulfonyl flúor (PMSF).</li>
	<li>Contagem de células usando um hemocytometer. Esperar 5-10 e 10 milhões de células das placas de 10 cm e 15 cm, respectivamente.</li>
	<li>Centrifugar 2.000 x g por 5 min, 4 ° C. 
	Nota: Células peletizadas podem ser imediatamente usadas para a etapa 3 ou pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.</li>
</ol> 3. Isolamento dos núcleos Nota: núcleos são isolados para remover proteínas citoplasmáticas e aumentar a cobertura de proteínas nucleares. Esta etapa pode ser substituída por outras formas de fracionamento celular para estudar RBPs em diferentes compartimentos celulares.
<ol><li>Preparar gelo frio Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM KCl). Use pelo menos 2,5 mL por 10 milhões de células (como contou na etapa 2.9) para a extração. 
	Nota: As existências de tampão A (por exemplo, uma garrafa de 500 mL) podem ser preparadas com antecedência e armazenadas a 4 ° C por 6 meses.
	<ol><li>Antes da utilização, adicionar 0,5 mM ditiotreitol (DTT) e 0,2 mM PMSF ao montante desejado (2,5 mL por 10 milhões de células) do buffer gelada r.</li>
	</ol></li> <li>Lavar as células usando 2 mL de tampão A por 10 milhões de células. Girar a 2.500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Discard sobrenadante, adicionar tampão A suplementado com 0,2% de um detergente não iônico, não-desnaturação, tais como octil-fenoxi-polyethoxy-etanol (veja a Tabela de materiais), 500 µ l por 10 milhões de células. Gire por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 2.500 x g, durante 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante; a pelota compreende núcleos intactos desprovido de citoplasma. 
	Nota: Núcleos podem ser usados imediatamente para a etapa 4 ou congelado em nitrogênio líquido e armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.</li>
</ol> 4. Lise dos núcleos Nota: núcleos de quitosana lysed em um buffer de espectrometria de massa compatível com a liberação de proteínas e complexos de RNA-proteína.
<ol><li>Adicionar tampão de lise (9 M de ureia, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µ l por 10 milhões de células. Proceda à sonicação para distorcer usando um 1/8 de cromatina &#34; sonda no ajuste de amplitude de 50% para s. 5-10</li>
	<li>Spin a 12.000 x g por 5 min e coletar 175 µ l do sobrenadante para evitar a pelota. 
	Nota: 100 µ l será usado para as próximas etapas de RBR-ID e os restantes 75 µ-l de lisado pode ser armazenado a-80 ° C para uso posterior e/ou análise ocidental do borrão.</li>
	Concentração de proteína medida através do ensaio de Bradford ou semelhante técnica 28 de <li>. Diluir a concentração de proteína nas diferentes amostras de 1 mg/mL ou a menor concentração de amostra usando quantidades apropriadas de Lise. 
	Nota: Os núcleos de 10 milhões de mESCs esperar 100-200 µ g de proteína.</li>
</ol> 5. Digestão do trypsin Nota: as proteínas são digeridas para gerar peptídeos suitable para análise de espectrometria de massa de baixo para cima (MS).
<ol><li>DTT adicionar solução para nuclear lisado (5mm final); incubar durante 1 h em RT.</li>
	<li>Adicionar o iodoacetamide do estoque fresco (14 mM final); incubar durante 30 min à RT no escuro.</li>
	<li>Dilua o lisado com 5 vezes o volume de 50 milímetros NH 4 HCO 3</li>
	<li>Adicionar tripsina (proteína µ g: tripsina µ g = 200:1); incubar a 37 ° C durante a noite.</li>
</ol> 6. Dessalinização de peptídeos <ol><li>preparar uma ponta do palco sob medida por exemplo.
	<ol><li>6.1.1. Coloque um disco de material de extração C18 de fase sólida na parte inferior de uma ponta de pipeta de 200 µ l.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de oligo R3 invertida resina fase em cima do disco C18. Coloque a ponta do palco dentro adaptador de centrifugação e a ponta de lugar com adaptador dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 100 µ l 100% acetonitrila dicas para lavar. Centrifugar a 1000 x g por 1 min remover o solvente.</li>
		<li>Equilíbrio com 50 µ l 0,1% ácido trifluoroacético (TFA). Centrifugar a 1000 x g por 1 min.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar 100% de ácido fórmico a amostra de proteína digerida para diminuir o pH a 2-3. 
	Nota: Isto deve exigir ~ 5 µ l / 1 mL da amostra diluída do peptide, mas pH deve ser medido e mais fórmico ácido adicionado se necessário.</li>
	<li>Amostra de carga na ponta do palco sob medida, centrifugar a 1000 x g por 1 min, até que todos da amostra passa a dica.</li>
	<li>Lavagem vinculado peptídeos com 50 µ l 0,1% TFA. Centrifugar a 1000 x g por 1 min.</li>
	<li>Eluir peptídeos pela adição de tampão de eluição 50 µ l (75% acetonitrila, 0.025% TFA) a ponta do palco e centrifugar a 1000 x g por 1 min forçar o tampão de eluição fora da ponta.</li>
	<li>Secar a amostra utilizando uma centrífuga vácuo fixado em 150 x g e 1-3-kPa para 1 h. 
	Nota: Peptídeos secos podem ser armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.</li>
</ol> 7. Remoção do RNA de quitosana Nota: tratar de peptídeos com nuclease remover quitosana RNA.
<ol><li>Resuspenda o pellet em 50 µ l 2 x buffer de nuclease (100mm NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2).</li>
	Concentração <li>peptídeo medida utilizando absorbância em 280 nm, supondo que 1 mg/mL de peptídeos para um um 280 de 1. 
	Nota: A concentração esperada é de 1 mg/mL.</li>
	<li>Ajustar todas as amostras de 1 mg/mL ou para a menor concentração usando 2x buffer de nuclease.</li>
	<li>Preparar uma mistura de mestre de 50 µ l de H 2 O + nuclease de alta pureza de 1 µ l (&#8805; 250 U) (consulte a Tabela de materiais) por exemplo.</li>
	<li>Levar 50 µ l de amostra do peptide e adicionar 50 µ l de H 2 O + nuclease mestre mistura.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C por 1 h. seguir para realizar a espectrometria de massa. 
	Nota: Os peptídeos estão agora prontos para espectrometria de massa. Podem ser analisados imediatamente ou armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.</li>
</ol> 8. Nano de cromatografia líquida, espectrometria de massa e processamento de dados Raw Nota: porque 4SU-reticulação altera a massa do peptide, seus íons não contam para a intensidade do peptide não-quitosana durante o LC-MS/MS, que, portanto, parece ser diminuiu a reticulação. O grau e a consistência desta diminuição reflecte o grau de reticulação de RNA-proteína para cada peptídeo 24.
<ol><li>HPLC preparar amortecedores da seguinte forma: 0,1% de ácido fórmico em água de qualidade para HPLC (tampão A); 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila grau CLAE (Buffer B).</li>
	<li>Se um nano-HPLC estiver disponível, conecte uma nano-coluna com as seguintes especificações: diâmetro interno 75 µm; embalado com partículas C18-AQ; comprimento 20-25 cm. 
	Nota: Se o HPLC disponível é executado em taxas de fluxo maiores utilize um tamanho de coluna adequada para a taxa de fluxo indicado. Cromatografia de fluxo maior diminui a sensibilidade.</li>
	Programa de <li>o método HPLC como segue: fluxo taxa de 250-300 nL/min; gradiente de 2 a 28% tampão B em 120 min, de 28 a 80 B para o próximos 5 min e isocrática 80% B durante 10 min. 
	Nota: Se não tiver um carregamento de amostra prévia de equilibração coluna automatizado, a HPLC iniciar o programa com 10 min a 0% B antes de carregar a amostra.</li>
	<li>o método de aquisição de MS para realizar aquisição de dados dependentes (DDA) como experimentos de proteomics espingarda padrão do programa. O ciclo de dever de instrumento deve alternar análises completas de MS com tandem MS scans (ou MS/MS) dos sinais mais intensos. Use as configurações ideais para proteômica MS funciona. 
	Nota: Para resultados confiantes, uso de instrumentos que podem executar pelo menos a MS completa varredura em modo de alta resolução (por exemplo, orbitrap, tempo-de-voo). Para quantificação exacta, certifique-se que intervalos entre análises completas de MS não são mais do que 3 ciclos mais s. podem impedir a definição precisa dos cromatogramas de íons extraídos.</li>
	<li>1-2 µ g de amostra para a coluna HPLC de carregar e executar o método de HPLC-MS/MS, conforme programado. Para cada biológico replicar realizar pelo menos duas pistas independentes e tratá-los como técnicas repetições.</li>
	<li>Depois de MS, importar os arquivos raw para um pacote de software de proteômica para identificação de espectros de MS/MS e quantificação de peptídeo através de cromatografia iônica extraídos. Recomendamos os pacotes de software que podem executar alinhamento cromatográfico de múltiplas MS é executado (veja a Tabela de materiais) 29 , 30.</li>
	<li>Se a opção está disponível na suíte de software, permitem &#34; correspondência entre execuções &#34; antes de iniciar o processamento de dados.</li>
	<li>Quando a análise estiver concluída, exportar a lista de peptídeo juntamente com os valores de quantificação.</li>
</ol>

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<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descreveremos um protocolo experimental pormenorizado para executar RBR-ID em mESCs e, com modificações apropriadas, em qualquer célula que pode incorporar 4SU em RNA. Outros tipos de células podem exigir a otimização da abordagem para garantir um suficiente sinal à relação de ruído. Além disso, enquanto o protocolo descrito neste documento concentra-se no exame do RBPs nucleares, a tecnologia de RBR-ID deve ser facilmente adaptada para diferentes compartimentos celulares, como o citoplasma ou organelas específicas, pelo...

O objetivo do método RBR-ID é identificar novas proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) e mapear as regiões de RNA-obrigatórias (RBRs) com resolução de peptídeo-nível para facilitar o design de mutantes de RNA-obrigatórias e a investigação da biológicas e bioquímicas funções de interações proteína-RNA.
O RNA é único entre biomoléculas pode atuar como um mensageiro carregando informação genética e também dobrar em estruturas tridimensionais complexas com funções bioquímicas mais parecidas com as de proteínas1,2. Um corpo crescente de evidências sugere que o RNA não-codificante (ncRNAs) desempenhar um papel importante em diversos genes vias regulamentares e epigenéticas3,4,5 e, normalmente, essas funções reguladoras são mediadas em concerto com proteínas que interagem especificamente com um determinado RNA. De particular importância, um conjunto de proteínas de interação foi recentemente identificado para o ncRNA longo intensamente estudada (lncRNA) Xist, fornecendo insights valiosos sobre como este lncRNA Medeia a inativação do cromossomo x em células femininas6,7 ,8. Notavelmente, várias destas proteínas Xist-interagindo não contêm qualquer de domínios de RNA-ligação canônica9, e, portanto, sua atividade RNA-ligação não poderia ser previsto em silico com base em sua sequência primária sozinha. Considerando que milhares de lncRNAs são expressos em qualquer determinada célula10, é razoável supor que muitos deles podem agir através de interações com o ainda a ser descoberto proteínas RNA-obrigatórias (RBPs). Uma estratégia experimental para identificar essas novela RBPs, portanto, iria facilitar grandemente a tarefa de dissecar a função biológica de ncRNAs.
Tentativas anteriores para identificar RBPs empiricamente têm invocado polyA + RNA seleção acoplada a espectrometria de massa (MS)11,12,13,14,15. Embora estas experiências adicionado muitas proteínas à lista do RBPs putativos, por design, que só podiam detectar proteínas vinculadas a polyadenylated transcrições. No entanto, a maioria dos RNAs pequeno e muitos lncRNAs não são polyadenylated. 16 , 17 e suas proteínas de interação teria provavelmente sido perdidas nesses experimentos. Um estudo recente da proteína-proteína interactome bancos de dados para identificar as proteínas que co purificado com vários conhecidos RBPs e mostraram que esses parceiros RBP recorrentes eram mais prováveis de possuir RNA-obrigatórias atividades18aplicada aprendizado de máquina. No entanto, essa abordagem baseia-se na mineração de bancos de dados existentes de grande interação e só podemos identificar as proteínas que podem ser co purificadas em condições não-desnaturação com conhecidos RBPs, excluindo assim a partir da análise, insolúvel, membrana-incorporado e escassa proteínas.
A identificação de uma proteína como uma bona fide RBP muitas vezes não produz automaticamente informações sobre a função biológica e/ou bioquímica da interação da proteína-RNA. Para resolver este ponto, é geralmente desejável para identificar os proteína domínio amino-ácido resíduos e envolvidos na interação, para que os mutantes específicos podem ser projetados para testar a função de ligação de RNA no contexto de cada novela RBP19, 20. esforços anteriores do nosso grupo e outros usaram fragmentos de proteína recombinante e exclusão mutantes para identificar RNA vinculação regiões (RBRs)19,20,21,22; no entanto, tais abordagens são trabalhosas e incompatível com as análises de alta produtividade. Mais recentemente, um estudo descreveu uma estratégia experimental para mapear as atividades de RNA-obrigatórias em uma moda de alta produtividade usando espectrometria de massa23; no entanto, esta abordagem baseou-se em uma seleção duplo polyA + RNA e assim, carregava as mesmas limitações que as abordagens de identificação RBP descritas acima.
Desenvolvemos uma técnica, denominada RNA vinculação região identificação (RBR-ID), que explora a proteína-RNA photocrosslinking e espectrometria de massa quantitativa para identificar proteínas e regiões da proteína interagindo com RNA em células vivas sem fazer suposição sobre o estatuto de poliadenilação RNA, incluindo assim RBPs vinculado a polyA-RNAs24. Além disso, esse método depende exclusivamente de reticulação e tem sem requisitos na solubilidade de proteínas ou acessibilidade e, portanto, é adequado para mapear as atividades de RNA-obrigatórias dentro membranas (por exemplo, o envelope nuclear) ou compartimentos pouco solúvel ( por exemplo, a matriz nuclear). Descrevemos as etapas experimentais para executar RBR-ID para os núcleos de células estaminais embrionárias de rato (mESCs), mas com pequenas modificações este protocolo deve ser apropriado para uma variedade de tipos de células, desde que eles eficientemente podem incorporar 4SU da cultura médio.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, qualificado, origem americana</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>solução de L-Glutamina 200</td><td>mM Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de aminoácidos não essenciais (100 vezes;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Fator Inibidor de Leucemia (LIF)</td> <td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gelatina, 2% em água</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-tiouridina</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM estoque em água</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Forma comercial de octil-fenoxi-polietoxi-etanol detergente</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grau de sequenciamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore disco de extração em fase sólida</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 Invertido - Resina de Fase</td><td>Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>Nuclease de alta pureza</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Modelo 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>descontinuado</td><td>atualizado com FB505110</td></tr><tr><td>Acetonitrila de grau HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>Material de embalagem para coluna de HPLC</td></tr><tr><td>Capilar para nano colunas (75 &micro; m)</td> <td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>software MaxQuant</td><td>Instituto Max Planck de Bioquímica</td><td></td><td>Pode realizar o alinhamento cromatográfico de várias execuções de MS</td></tr></tbody></table>

preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de rna

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

RNA não-codificante desempenham papéis importantes em diversos processos nucleares, incluindo a regulação da expressão gênica, estrutura da cromatina e reparação do DNA. Na maioria dos casos, a ação de RNA não-codificante é mediada por proteínas que por sua vez, cujas funções são regulamentadas por essas interações com RNA não-codificante. Consistente com este, um número crescente de proteínas envolvidas em funções nucleares têm sido relatado para vincular o RNA e em alguns casos as regiões de RNA-ligação destas proteínas foram mapeadas, muitas vezes através de métodos laboriosos, baseado no candidato.
Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado para realizar uma identificação imparcial elevado-throughput, proteoma-largo de RNA-proteínas e suas regiões de RNA-obrigatórias. A metodologia baseia-se na incorporação de uma uridina fotorreativas analógica no RNA celular, seguido de reticulação de RNA-proteína mediada por UV e análises de espectrometria de massa para revelar o RNA-quitosana péptidos dentro do proteoma. Embora nós descrevemos o procedimento para as células estaminais embrionárias de rato, o protocolo deve ser facilmente adaptado a uma variedade de culturas de células.

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho RBR-ID. Devido a reticulação relativamente baixa eficiência dessa técnica, é muito importante levar em consideração tanto a nível de esgotamento e a consistência do efeito observado (P -valor) através de réplicas biológicas. A Figura 2 mostra uma trama de vulcão de resultado RBR-ID. Peptídeos que sobrepostas domínio de motivo (RRM) de reconhecimento de RNA mostram nível de esgotament...

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas que se ligam ao RNA em células vivas e mapear suas regiões de ligação ao RNA utilizando fotoconjugação mediada por UV seguida de espectrometria de massas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da epigenética, como quais reguladores epigenéticos estão ligados ao RNA e quais regiões proteicas são necessárias para essas interações. A principal vantagem desta técnica é que ela não envolve a purificação de complexos proteína-RNA, exigindo, portanto, pouca quantidade de material e identificando proteínas ligadas a qualquer tipo de RNA.Como apresentado, este método foca em proteínas nucleares porque esse é o nosso interesse científico, mas com pequenas modificações nos passos de fracionamento, ele poderia ser usado para estudar RNA e proteínas ligantes em outros compartimentos celulares. Após o cultivo e expansão de ESCs de camundongo de acordo com o protocolo descrito, expanda as células até o número necessário de placas de 10 centímetros. Antes que as placas atinjam confluência, adicione quatro SU diretamente ao meio, até uma concentração final de 500 micromolares.Deixe as placas controle com 4sU sem tratamento. Agite suavemente as placas para distribuir homogeneamente o 4sU por todo o meio, em seguida, retorne as placas ao mesmo incubador de cultura de tecidos por duas horas. A eficiência da incorporação de 4sU varia entre os tipos celulares, portanto, pode ser necessário otimizar sua concentração e o tempo de incubação para garantir uma reticulação eficiente e minimizar a toxicidade.Em seguida, transfira as placas para um recipiente com gelo e descarte o meio. Depois, use 5 mililitros de PBS gelado para lavar suavemente as placas. Adicione 2 mililitros de PBS gelado e coloque as placas sem tampas em um cross-linker equipado com lâmpadas que emitem UV-B.Irradie as placas com uma configuração de energia de 1 Joule por centímetro quadrado. A reticulação eficiente por UV é essencial. Recomendamos o uso de luz UV-B, mas a UV-A também pode ser utilizada.Em qualquer caso, a quantidade de energia UV utilizada deve ser otimizada e pode ser monitorada por PAR-CLIP ou ChIRP. Use espátulas para células para coletar as células e transferi-las para PBS gelado em tubos cônicos. Em seguida, centrifugue as células a 2000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Remova o sobrenatante e re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de PBS frio com 2 milimolares de EDTA e 0,2 milimolar de PMSF. Com um hemocitômetro, conte as células. Espere de cinco a dez milhões e de dez a vinte milhões de células provenientes de placas de 10 centímetros e 15 centímetros, respectivamente.Em seguida, centrifugue as células a 2000 vezes g e 4 graus Celsius por cinco minutos. Para isolar os núcleos das células, prepare o tampão A gelado conforme descrito no protocolo textual. Antes do uso, adicione 0,5 milimolar de DTT e 0,2 milimolar de PMSF à quantidade desejada do tampão A. Adicione 2 mililitros do tampão frio às células para lavá-las, depois centrifugue as células a 2500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Descarte o sobrenatante e adicione o tampão A suplementado com 0,2 por cento de um detergente não iônico e não desnaturante; em seguida, gire a amostra a 4 graus Celsius por cinco minutos. Após centrifugar as células a 2500 ×g por cinco minutos, remova o sobrenatante. O pellet contém núcleos intactos, desprovidos de citoplasma.Para lisar os núcleos, adicione 200 microlitros de tampão de lise ao tubo. Use uma sonda de 1/8 de polegada para sonificar a amostra e fragmentar a cromatina em uma configuração de amplitude de 50 por cento por cinco a dez segundos. Centrifugue a amostra a 12000 vezes g por cinco minutos e colete apenas 175 microlitros do sobrenadante para evitar o precipitado.Em seguida, meça a concentração proteica por meio do ensaio de Bradford ou técnica semelhante. Então, use o tampão de lise para diluir a proteína nas diferentes amostras até 1 miligrama por mililitro ou até a menor concentração entre as amostras. Adicione solução de DTT 5 milimolar ao lisado nuclear e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, adicione iodoacetamida 14 milimolar proveniente de estoque fresco e incube o lisado à temperatura ambiente, no escuro, por 30 minutos. Dilua o lisado com cinco vezes o volume de bicarbonato de amônio 50 milimolar, depois adicione tripsina. Incube a amostra a 37 graus Celsius durante a noite.Para preparar uma ponta tipo stage personalizada por amostra, coloque um disco de material C18 de extração em fase sólida no fundo de uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Adicione 50 microlitros de resina reversa Oligo R3 sobre o disco de C18, em seguida coloque a ponta tipo stage dentro de um adaptador de centrifugação e posicione o adaptador dentro de um tubo microfuge de 1,5 mililitro. Adicione 100 microlitros de acetonitrila a 100 por cento nas pontas para lavá-las.Em seguida, centrifugue as ponteiras a 1000 ×g durante um minuto para remover o solvente. Equilibre as ponteiras com 50 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1 por cento ou TFA. Depois, centrifugue-as novamente.Adicione ácido fórmico a 100% à amostra de proteína digerida para reduzir o pH a 2-3. Em seguida, carregue a amostra em uma ponta de coluna caseira e centrifugue a amostra a 1000 × g por um minuto até que toda a amostra atravesse a ponta. Lave os peptídeos retidos com 50 µL de TFA a 0,1%.Em seguida, após centrifugar a amostra a 1000 vezes g por um minuto, elua os peptídeos adicionando 50 microlitros de tampão de eluição ao stage tip e centrifugue a 1000 vezes g por um minuto para forçar a saída do tampão de eluição da ponta. Utilize um evaporador a vácuo ajustado a 150 vezes g e 1 a 3 quilopascals por uma hora para secar a amostra. Para remover o RNA reticulado da amostra, re-suspenda o precipitado em 50 microlitros de tampão de nuclease 2x.Meça a concentração do peptídeo em 280 nanômetros, assumindo 1 miligrama por mililitro de peptídeos para um A280 de 1. Use tampão 2x de nucleases para ajustar todas as amostras a 1 miligrama por mililitro ou à menor concentração, depois prepare uma mistura-mestra contendo 50 microlitros de água mais 1 microlitro de nuclease de alta pureza por amostra. Combine 50 microlitros da amostra de peptídeo com 50 microlitros da mistura-mestra de água mais nuclease.Em seguida, incubar a amostra a 37 graus Celsius por uma hora. Por fim, realizar a nanocromatografia líquida, espectrometria de massas e processamento de dados conforme o protocolo descrito no texto. Esta figura mostra um gráfico de vulcão de um resultado de RBR id obtido a partir de ESCs de camundongo.Os peptídeos que se sobrepõem a um domínio de motivo de reconhecimento de RNA estão em azul e mostram níveis altamente consistentes de esgotamento. Um peptídeo de ligação ao RNA de HNRNPC está destacado em vermelho. É apresentado aqui um mapa de calor de escores id RBR, calculados como uma estimativa da probabilidade de ligação ao RNA de uma região proteica.A pontuação é projetada na superfície da subunidade do spliceossomo U1-70k. A cor vermelha intensa na proximidade do contato com o RNA, conforme determinado pela estrutura cristalina, indica a identificação correta da interação proteína-RNA. Nesta figura, TET2 é apresentado como uma nova proteína ligadora de RNA (RBP) e a atividade de ligação ao RNA é mapeada para uma região C-terminal, representando graficamente a pontuação do identificador RBR ao longo da sequência primária da proteína.Por fim, o requisito para este novo RBR pode ser verificado realizando-se o PAR-CLIP usando a sequência do tipo selvagem e comparando o sinal com o de um mutante que carece do RBR previsto. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete a oito horas distribuídas em dois dias, se for executada corretamente. Antes da reticulação, as células podem ser estimuladas com diversos tratamentos para responder perguntas adicionais, como como começa a diferenciação ou como o ciclo celular regula as interações entre RNA e proteína.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar extratos contendo complexos de proteína e RNA reticulados para identificar os sítios de interação entre proteína e RNA por espectrometria de massas.

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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A tecnologia MAPS foi desenvolvida para examinar o targetome de um RNA regulatório específico in vivo. O sRNA de interesse é marcado com um aptamer MS2 permitindo a co-purificação de seus parceiros RNA e sua identificação por sequenciamento de RNA. Este protocolo modificado é particularmente adequado para bactérias Gram-positivas.

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O protocolo fornece instruções para modificar o RNA com sulfato de dimetilo para experimentos de perfil mutacional. Inclui sondagem in vitro e in vivo com dois métodos alternativos de preparação de bibliotecas.

Sondando a estrutura do RNA com perfil mutacional de sulfato de dimetilo com sequenciamento in vitro e em células

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Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

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