Name: Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a identificar tipos de fibras musculares esqueléticas em camundongos usando imunohistoquímica e um algoritmo semi-automatizado. Este método computacional acelera a análise morfológica e auxilia pesquisas em biologia muscular e doenças.

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Estamos gratos à Fundação Boettcher e a associação de esclerose Lateral amiotrófica (#17-II-344) pelo apoio da pesquisa.

todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê de uso e Universidade do Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care (91813(05)1D).
 1. dia 1: primária (1°) imunocoloração com bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) <ol><li>ar seco seções congeladas do músculo do membro posterior de rato (por exemplo, tibial anterior, sóleo) montagem em slides carregados para ~ 30 min 11. desenhar uma borda ao redor as seções usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta.</li>
	<li>Lugar ~ 250 µ l de soro de 5% BSA/tampão de fosfato (BSA/PBS) em cada slide para bloquear a ligação do anticorpo específico. Incubar em temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Enquanto bloqueia, 01:50 de preparar diluições do anticorpo 1 ° sobrenadante em 5% BSA/PBS (todos são anticorpos monoclonais de rato, ver tabela 1 6 , 12); preparar 250 µ l de solução por slide. Manter estoques de anticorpo de 1° e diluições na Ice.</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> tabela 1: os anticorpos primários usados para distinguir MyHCs.
<ol start="4"> <li>após a aspiração da solução bloqueio 5% BSA/PBS, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 1° para os slides adequados. Adicionar 250 µ l de 5% BSA/PBS para controlo de negativo somente anticorpo secundário (2°) slides.</li>
	<li>Incubar a 4 ° C por 24-48 h em um ambiente úmido. 
	Nota: Um prato de Petri coberto com folha de alumínio com papel de filtro umedecido pode servir como uma câmara de incubação adequado.</li>
</ol> 2. Dia 2:2 ° imunocoloração com anticorpos fluorescentes <ol><li>aspirar solução de anticorpo 1° ou 5% BSA/PBS solução de controle. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA.</li>
	<li>Durante a lavagem, preparar diluições de 1: 200 dos anticorpos purificado, fluoróforo conjugado 2 ° em 5% BSA/PBS (ver tabela 2, todos são anti-rato cabra). Prepare 250 µ l de solução por slide. Manter anticorpos fluoróforo conjugado de 2° às escuras na Ice.</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> tabela 2: anticorpos secundarios conjugados fluoróforo usado para visualizar de primária do anticorpo reconhecimento do MyHCs.
<ol start="3"> <li>após aspiração da terceira aplicação da solução a 5% BSA/PBS bloqueio, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 2° a todos os slides. Incubar durante 90 min à temperatura ambiente em um ambiente escuro, úmido.</li>
	<li>Solução de anticorpo 2° aspirado. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA/PBS.</li>
	<li>Lavagem com PBS. Seca durante 10 min.</li>
	<li>Montar a lamela com um meio de não-permanentes, baixa viscosidade montagem aquoso.</li>
	<li>Quando seco, selar as bordas de slide com as unhas pintadas. Secar e armazenar em um escuro slidebox.</li>
</ol> 3. Slides com microscopia de epifluorescência de imagem <ol><li>limpar os slides com uma pequena, 70% etanol-embebido laboratório-limpeza.</li>
	<li>Obter imagens digitais das seções de músculo immunostained usando um microscópio de epifluorescência, equipado com um aparelho fotográfico (consulte a Tabela de materiais).
	<ol><li>Selecione uma área de aproximadamente 1 mm 2 (objetivo de 10 X, at 1.4).</li>
		Filtro de passa-tempo <li>Vista fluorescência de anticorpos conjugados a Alexa 488 2° através de um 505 nm. Ver os a fluorescência gerada pela excitação dos anticorpos conjugados a Alexa 594 2° através de um filtro de passa-tempo 595 nm. Digitalize imagens com um computador PC equipado com um software de imagem compatível. Incluem a barra de escala da imaging software para análise posterior.</li>
	</ol></li></ol> 4. Análise de imagens com Fiji Nota: antes de prosseguir com a análise, Fiji (disponível livremente o National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve ser instalado através de https://imagej.net/Fiji/Downloads. Além disso, a macro usada neste processo é fornecida no Arquivo suplementar. Coloque o arquivo de macro em um diretório acessível.
<ol><li>Carga brightfield uma imagem de uma seção selecionada em Fiji. Navegue até Plugins &#8594; segmentação &#8594; segmentação Weka Trainable.</li>
	<li>a fim de estipular as áreas celulares da seção, desenhar uma linha em uma fibra e clique em &#34; adicionar a classe 1 &#34;. Em seguida, desenhe uma linha no espaço entre as fibras e clique &#34; adicionar a classe 2 &#34; para marcar os domínios extracelulares. Repita até que há 5-10 etiquetas em cada classe.
	Classificador de trem clique <ol><li>. Sobre a sobreposição resultante de vermelha e verde, adicionar rótulos mais manualmente (consulte a etapa 4.2) incorretamente segmentado pedaços da imagem, se necessário. Repita até fibras (vermelho) são separadas adequadamente o espaço entre as fibras (verde).</li>
	</ol></li> <li>Clique &#34; probabilidade de obter &#34; e salvar a imagem em uma pasta recém rotulada.</li>
	<li>Repita o procedimento acima (passos 4.2-4.3) com a imagem fluorescente tirada do mesmo campo. Rotular as fibras immunostained como &#34; classe 1 &#34; e todas as regiões não-fluorescente como &#34; classe 2 &#34;. Salvar o mapa resultante de probabilidade para a mesma pasta onde a imagem processada brightfield é armazenada.</li>
	<li>Abrir um dos mapas probabilidade salvo anteriormente em Fiji. Desenhe uma linha reta na barra de escala fornecida pelo software da imagem latente. Vá para analisar &#8594; definir escala. Altere os parâmetros (ou seja, distância conhecida, unidade de comprimento) para seus valores apropriados como determinado pela barra de escala e, em seguida, verificar o &#34; Global &#34; caixa para padronizar a escala para cada imagem.</li>
	<li>Navegar para Plugins &#8594; Macros &#8594; executar &#8594; Tyagi et al fibra quantificação macro.ijm (consulte o Arquivo suplementar). Imediatamente, um painel de navegação irá aparecer. Abra a imagem &#39; pasta do host s; uma caixa de diálogo será exibida. Para cada caixa de diálogo, alterar o &#34; fundo &#34; valor de lista suspensa para &#34; luz. &#34; Nota: A pasta agora será preenchida com imagens dos contornos da fibra e arquivos de software de planilha dos resultados (diâmetro CSA e Ferrari são mais pertinentes ao quantificar a morfologia das fibras; parâmetros medidos podem ser ajustados em analisar medidas de conjunto). Dados de morfologia de fibra gerados pela função dos poros-análise de Fiji serão automaticamente transferidos para arquivos de software de planilha para ambas as imagens fluorescentes e brilhante campo.</li>
	<li>Calcular a fração de fibras expressando um determinado MyHC em um campo, dividindo o número de fibras fluorescentes no campo com o número de fibras totais na imagem correspondente campo claro.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

Os autores têm sem interesses conflitantes para divulgar.

Aqui, nós fornecemos orientação útil para a identificação dos tipos de fibra de músculo esquelético. Ao fazê-lo, descrevemos um novo algoritmo para análise dos dados.
Desde que nossos resultados, em grande parte, confirmam os anteriores relatórios5,8,10 e refletem nossa própria medição manual, o algoritmo aparece ser exato. Ainda, encontramos algumas armadilhas experimentais infrequentes, incluindo bo...

-Já há algum tempo que o músculo esquelético é composto por fibras simples de muitos tipos1. Inicialmente, dois grupos de fibras foram caracterizados com base em suas propriedades contráteis e chamado, apropriadamente, contração lenta (tipo I) e contração rápida (tipo II). Estas categorias eram ainda mais diferenciadas com base no metabolismo de fibra. Desde tipo I fibras são ricas em mitocôndrias e dependente do metabolismo oxidativo, eles foram elucidados por robustamente positivo dinucleótido de nicotinamida e adenina-tetrazólio redutase (NADH-TR) face2 ou Succinato desidrogenase (SDH)3 a coloração. Por outro lado, as fibras do tipo II exibiram menor e graus variáveis de NADH-TR face ou SDH manchando e foram divididos em dois subgrupos de contração rápida (tipo IIA e IIB) um pouco grosseira com base na sua capacidade oxidativa relativa. Essas distinções entre fibras tem sido visualizadas mais eficazmente pela miosina-ATPase coloração onde tipo I fibras mancham escuras depois de uma pré-incubação a pH 4.0 e tipo IIB fibras absorvem precipitada seguir pré-incubação com fibras de tipo IIA pH 10,0 coloração intermediària4.
Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino de fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibras podem ser todos identificadas com precisão com base no seu perfil MyHC. Além disso, um outro tipo de rápido-contração muscular metabolicamente intermediário-fibra, tipo IIX, tem sido identificados6. Fibras de híbrido expressar mais do que um MyHC também foram confirmados5,7,8. Algumas espécies como o gato e o babuíno são conhecidos para não expresso tipo IIB MyHCs6. Apesar de imunocoloração MyHC atualmente é a avaliação do estado-da-arte da composição muscular, a análise dos dados obtidos através desta técnica é complicado e demorado sem assistência automatizada. Para este fim, um punhado de métodos semi automatizados para analisar esses dados foram desenvolvidos5,9,10. Aqui, apresentamos um protocolo relativamente padrão para identificação de imuno-histoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, , juntamente com um romance semi-automático algoritmo que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra com precisão.

<table><tbody><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% em PBS</td></tr><tr><td>Barreira hidrofóbica Pap Pen</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Microscópio de Fluorescência Invertida e Campo Claro</td><td></td><td>Descontinuado</td><td></td></tr><tr><td>SPOT RT/KE</td><td>SPOT Imaging Solutions</td><td>RT940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 Estudos</td> de Desenvolvimento de Anticorpo <td>Primário Banco de Hibridoma na Universidade de Iowa</td><td></td><td>camundongo monoclonal IgG2b; 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Estudos de Desenvolvimento de Anticorpos Primários</td><td>Banco de Hibridoma na Universidade de Iowa</td><td></td><td>camundongo monclonal IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Estudos de Desenvolvimento de Anticorpos Primários</td><td>Banco de Hibridoma na Universidade de Iowa</td><td></td><td>camundongo monoclonal IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Estudos</td> de <td>Desenvolvimento de Anticorpos Primários Banco de Hibridoma na Universidade de Iowa</td><td></td><td>camundongo monoclonal IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>cabra anti-mouse; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>cabra anti-mouse; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>cabra anti-mouse; 1:200</td></tr><tr><td>OUT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>isopentano</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>frio com nitrogênio liguid</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, diluir para 1x</td></tr><tr><td>lenços umedecidos Kim</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Durante anos, distinções entre os tipos de fibra de músculo esquelético foram melhor visualizadas pela coloração de miosina-ATPase. Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino do tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, IIX e tipo IIB fibras agora podem ser identificadas com precisão, com base no seu perfil de MyHC; no entanto, a análise manual desses dados pode ser lento e baixo-direita tedioso. A este respeito, avaliação rápida, exata da composição da fibra-tipo e morfologia é uma ferramenta muito desejável. Aqui, apresentamos um protocolo para coloração imuno-histoquímica estado-da-arte da MyHCs nas seções congeladas obtidas de músculo do membro posterior do mouse em conjunto com um algoritmo semi-automático de romance que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra. Como esperado, o músculo sóleo exibido mancha para tipo I e fibras IIA, mas não para as fibras tipo IIX ou tipo IIB. Por outro lado, o músculo tibial anterior era composto predominantemente de tipo IIX e tipo IIB fibras, uma pequena fração de fibras de tipo IIA e pouco ou nenhum tipo I fibras. Várias transformações de imagem foram utilizadas para gerar mapas de probabilidade, com a finalidade de medir os diferentes aspectos da morfologia das fibras (ou seja, área da seção transversal (CSA), diâmetro de Feret máxima e mínima). Os valores obtidos para estes parâmetros foram então comparados com os valores obtidos manualmente. Não há diferenças significativas foram observadas entre o modo de análise em relação ao CSA, diâmetro de Feret máximo ou mínimo (todos os p &#62; 0,05), indicando a precisão do nosso método. Assim, nosso protocolo de análise de imunocoloração pode ser aplicado para a investigação dos efeitos na composição muscular em muitos modelos de envelhecimento e miopatia.

Músculos do membro posterior (ou seja, tibial anterior, sóleo) dissecados de um rato masculino de C57BL/6 de idade desconhecida foram flash congelado pelo afundamento de um molde de plástico que contém o músculo em OCT composto em isopentano arrefecido a nitrogênio líquido. Em seguida, usando um cryotome, 8-10 µm serial seções foram cortadas a-20 ° C e transferidas para lâminas de vidro carregado positivamente diferentes12.
<p class="jove_content" fo:k...

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar a imuno-histoquímica de última geração para identificar com precisão e rapidez os tipos de fibras musculares esqueléticas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia muscular, como se as alterações no tipo de fibra são desencadeadas pela perda de proteínas funcionais. Embora este método possa fornecer insights sobre diversos modelos de doenças musculares, ele também pode ser empregado em sistemas como modelos de inserção genética (knock in) e modelos de inativação gênica (knock out) para revelar o impacto mais amplo de uma única molécula na função muscular básica.Para começar, deixe secar ao ar cortes congelados de músculo de camundongo em lâminas carregadas por cerca de meia hora. Após a secagem, desenhe uma borda ao redor dos cortes em cada lâmina usando uma caneta hidrofóbica PAP. Em seguida, para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos, adicione cerca de 250 microlitros de BSA a 5% em PBS dentro das bordas desenhadas e incube as lâminas à temperatura ambiente por uma hora.Enquanto isso, prepare uma diluição de um para 50 do anticorpo primário em PBS com 5% de BSA. Prepare cerca de 250 microlitros por lâmina e armazene a diluição do anticorpo no gelo. Após o período de bloqueio, aspire a solução de bloqueio das lâminas e adicione alíquotas de 250 microlitros da diluição do anticorpo.Como controle negativo, aplique 5% de BSA em PBS sem o anticorpo primário. Em seguida, coloque uma folha de papel filtro umedecido no interior da placa de Petri e cubra com papel alumínio para formar uma câmara de incubação. Incube então as lâminas a quatro graus Celsius por 24 a 48 horas na câmara ou em um ambiente semelhante com a mesma umidade.Após a incubação com o anticorpo primário, aspire a solução das lâminas e lave-as três vezes. Em cada lavagem, aplique cerca de 250 microlitros de BSA a 5% em PBS por aproximadamente 10 minutos. Enquanto lava as lâminas, prepare diluições de um para 200 dos anticorpos secundários conjugados com fluoróforo purificados.Prepare pelo menos 250 microlitros por lâmina e mantenha a solução no escuro e sobre gelo. Após a terceira lavagem, adicione 250 microlitros da diluição do anticorpo secundário às lâminas. Em seguida, incube as lâminas por 90 minutos à temperatura ambiente em um ambiente úmido e escuro.Após a incubação, aspire a solução de anticorpo e lave as lâminas três vezes como antes. Após remover todo o anticorpo secundário em excesso, enxágue as lâminas com PBS e deixe secar ao ar por 10 minutos. Por fim, monte as lâminas utilizando um meio de montagem aquoso de baixa viscosidade não permanente.Após a secagem do meio, vedar as bordas da lamínula com esmalte de unha e transferir as lâminas para uma caixa opaca de armazenamento. Antes de obter imagens de uma lâmina, limpar a lamínula com etanol 70%. Em seguida, obter imagens digitais utilizando um microscópio de epifluorescência.Em baixa ampliação, selecione uma área de interesse de um milímetro quadrado. Para visualizar anticorpos conjugados com Alexa 488, utilize um filtro passa-longo de 505 nanômetros. Para visualizar anticorpos conjugados com Alexa 594, utilize um filtro passa-longo de 595 nanômetros.Com os filtros devidamente configurados, inicie a coleta de imagens digitais. Certifique-se de incluir uma barra de escala para a análise subsequente. Para a análise, instale o Fiji no macro fornecido com esta publicação.Armazene o arquivo macro em um diretório de fácil acesso. Agora, carregue uma imagem em campo claro de uma seção selecionada e navegue até a opção de segmentação treinável pelo WEKA. Para delimitar as áreas celulares da seção, desenhe uma linha sobre uma fibra e clique em adicionar à classe um.Em seguida, para marcar os domínios extracelulares, desenhe uma linha no espaço entre as fibras e clique em adicionar à classe dois. Repita este processo até que cinco a dez rótulos de cada classe tenham sido definidos. Pode ser difícil marcar os limites intersticiais.O uso da função de zoom permite marcar esses limites com maior precisão. Em seguida, selecione a opção treinar classificador. Na sobreposição resultante em vermelho e verde, adicione manualmente mais rótulos a quaisquer partes da imagem que foram segmentadas incorretamente pelo processo automatizado.Faça isso até que as fibras marcadas em vermelho estejam adequadamente separadas dos espaços intermediários marcados em verde. Em seguida, clique em obter probabilidade e salve a imagem em uma nova pasta de arquivo. Agora, repita todo o processo utilizando a imagem fluorescente obtida do mesmo campo.Rotule as fibras imunomarcadas como classe um e todas as regiões não fluorescentes como classe dois. Por fim, salve o mapa de probabilidade resultante na mesma pasta onde a imagem de campo claro processada foi armazenada. Agora, abra um dos mapas de probabilidade previamente salvos no Fiji.Traceje uma linha reta na barra de escala fornecida pelo software de imagem. Selecione definir escala e insira os valores corretos com base na barra de escala. Em seguida, ative a opção global para padronizar a escala em todas as imagens.Agora, execute a macro Tyagi para quantificação de fibras e o painel de navegação será exibido. Em seguida, abra a pasta de origem das imagens. Na caixa de diálogo associada, altere o valor do menu suspenso de plano de fundo para claro.A função de medições definidas pode ser usada para especificar quais parâmetros devem ser medidos. A área da seção transversal (CSA) e o diâmetro das fibras são as medidas mais relevantes para quantificar a morfologia das fibras. Após executar a macro, a pasta será preenchida com imagens dos contornos das fibras e planilhas com as medições realizadas pela função de análise de fibras.Os músculos tibial anterior e sóleo foram analisados usando os métodos descritos porque são compostos principalmente por fibras de contração rápida ou contração lenta. Várias cadeias pesadas diferentes de miosina foram identificadas usando anticorpos específicos. Uma fração substancial das fibras musculares do sóleo expressou cadeias pesadas de miosina do tipo um e do tipo dois A, e uma quantidade considerável das fibras restantes foi positiva para o tipo dois X. Em contraste, praticamente não foram evidentes fibras do tipo dois B.Por comparação, os músculos tibial anterior corados eram compostos principalmente por fibras de cadeia pesada da miosina tipo dois B e tipo dois X, com menores contribuições de fibras que expressam cadeias tipo dois A e praticamente nenhuma fibra expressava cadeias tipo um. A análise morfométrica de um músculo tibial anterior sondado com anticorpos SC-71 direcionados à cadeia pesada da miosina tipo dois A forneceu várias transformações de imagem utilizadas para criar mapas de probabilidade. A partir dessa análise automatizada simples, os dados demonstraram ser totalmente comparáveis aos dados gerados por meio de cálculos manuais muito mais trabalhosos.No total, a análise gerou dados de cerca de 6.000 fibras individuais. A alta produtividade dos dados tornou a análise estatística muito mais viável. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imunomarcação em seções musculares e utilizar o software semiautomatizado fornecido para facilitar a análise do tipo e da composição das fibras musculares.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o músculo pode ser regionalmente heterogêneo e que a análise de diversos campos musculares é necessária para uma avaliação rigorosa do tipo e da composição das fibras musculares. Em conjunto com este procedimento, outros métodos, como a coloração Tricrômica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se o desenvolvimento de fibrose ocorre em paralelo às alterações na composição dos tipos de fibras.

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Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

Aqui, apresentam-se um protocolo para a fibra muscular rápida análises, o que permite melhor qualidade de coloração, e assim aquisição automática e quantificação de populações de fibras utilizando o software ImageJ livremente disponíveis.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Evidências crescentes indicam que a infiltração excessiva de lipídios dentro do músculo esquelético resulta em lipotoxicidade e diabetes. Aqui, apresentamos um protocolo completo, incluindo processamento de tecidos, coloração com Bodipy, aquisição de imagens e análise, para quantificar o tamanho, densidade e distribuição subcelular de gotículas lipídicas de forma específica do tipo fibra.

Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético

Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.

Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Injeções locais de um corante mitocondrial marcando mitocôndrias da célula terminal de Schwann in vivo para microscopia confocal. Esse método utiliza prova de conceito demonstrada em tecido muscular esquelético de camundongos com músculo saudável ou doente para fornecer visualização mitocondrial de alta resolução.

Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Um conjunto simples e direta de métodos para isolar e determinar a identidade das proteínas mais abundantes expressa no músculo esquelético. Cerca de 800 spots são discernidos em um gel de duas dimensões de 10 mg do músculo, o que permite a determinação de gênero específico expressão da proteína. Esses métodos produzem resultados equivalentes na maioria dos tecidos.

Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

Aprenda a identificar tipos de fibras musculares esqueléticas em camundongos usando imunohistoquímica e um algoritmo semi-automatizado. Este método computacional acelera a análise morfológica e auxilia pesquisas em biologia muscular e doenças.

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

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