Name: Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a avaliar mecanismos de controlo vascular em artérias de resistência isoladas de ratos utilizando microscopia de vídeo in vitro. Este método permite estudar a reatividade vascular e função endotelial em ambiente controlado.

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Os autores expressam seus sinceros agradecimentos Katie Fink e Lynn Dondlinger por sua inestimável ajuda na preparação deste manuscrito.
Suporte de Grant: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; e #R01-HL128242.

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Como observado na introdução, este artigo descreve o uso da microscopia de televisão e artéria resistência isolada se aproxima para avaliar a função vascular não só em modelos do rato padrão (como empregada no vídeo), mas também em altamente especializada geneticamente cepas de rato engenharia, que mostram o romance e insights poderosos que podem ser adquiridos utilizando essas abordagens. O uso destas técnicas poderosas para avaliar o tom de ativo e passivas propriedades mecânicas das artérias de resistência pequena pod...

Os primeiros estudos da função vascular nas artérias utilizadas eletroduto artérias e em muitos casos, a aorta. Geração de força nas grandes artérias geralmente foi estudada por anexar um segmento de anel da artéria de um transdutor de força em um banho de tecido; no caso da aorta, por corte helicoidal tiras do navio para que as fibras musculares lisas foram orientadas na direcção longitudinal entre o ponto de fixação e o transdutor de força, para fornecer a melhor estimativa da força gerada pela contração do o músculo liso ao longo do eixo longitudinal. A técnica padrão para o corte de tiras helicoidais da aorta foi colocar uma vareta de vidro no lúmen do vaso, fazer um corte na parede do vaso no ângulo desejado, e espere até o fim da borda exposta da parede do vaso, como o corte foi estendido para produzir todo um faixa de helicoidal do navio. Nesse ponto, o lado endotelial do vaso era geralmente apagado para remover detritos antes de acoplar a tira de navio para o transdutor de força e submergindo a preparação em um oxigenado e temperatura controlada banho de tecido. Eventualmente, que a abordagem levou a uma das mais famosas e importantes descobertas na história da fisiologia por Furchgott e Zawadski1, ou seja, o papel do endotélio derivado fator relaxante (EDRF), posteriormente identificado como óxido nítrico, em regulação da função vascular. O evento crucial, levando a essa descoberta foi uma situação em que os investigadores mantiveram um endotélio intacto, evitando o contato do lado endotelial da artéria com superfícies estrangeiras, em notei que a tira da aorta não exibem o esperado contração de acetilcolina (ACh), mas em vez disso relaxado em resposta a ACh. Baseia essa observação, os investigadores desenvolveram uma preparação de "sanduíche" em que eles ligados a um segmento da aorta com um endotélio intacto (mas incapaz de gerar força contrátil) para uma faixa padrão helicoidal da aorta e convertido o ACh-induzido contração em um relaxamento.
Dois grandes avanços nesta área que são extensivamente usados hoje são o desenvolvimento de preparações para medir a força contrátil ativa na resistência de pequenas artérias2,3 (tais como aqueles no mesentério intestinal3 ) e canulados resistência artéria preparações4,5,6. Em um dos primeiros relatórios, Mulvany e Halpern3 descreveu a utilização da preparação de myograph de fio para estudar a força contrátil activa nas artérias de resistência isolada do mesentério intestinal de ratos de espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos controles WKY. Na sequência do desenvolvimento do sistema de myograph do fio, resistência canulado artéria preparações foram desenvolvidas para permitir estudos dos vasos mais perto na vivo condições4,5,6.  Enquanto ambas as abordagens fornecem resultados valiosos, a preparação de artéria canulada tem as vantagens de mais eficazmente preservando intrínseca Tom ativo nas artérias; e permitindo que os investigadores a estudar ativas miogênico respostas a alterações nas respostas de pressão e navio transmural a mudanças na taxa de fluxo e tensão de cisalhamento endotelial (ver revisão por Halpern e Kelley6).
Dos principais objetivos do presente trabalho é descrever como a empregar a técnica time-honored de vídeo microscopia usando artérias de resistência isolada, canulados para obter informações precisas sobre os mecanismos que regulam o tônus ativo nestes crucial vasos, independentes das influências de células neurais, humoral ou parenquimatosa. Esta informação básica, empregando um modelo do rato padrão e exemplos de nossos estudos de novo geneticamente modificadas cepas de rato, irá fornecer o leitor com uma ideia dos tipos de insights sobre a função vascular que pode ser adquirida com televisão abordagens de microscopia, e que podem ser empregadas em estudos envolvendo qualquer controle e grupo experimental (s) de escolha do investigador, incluindo poderosos novos modelos de rato experimental produzido por endogamia seletiva e recentemente desenvolvido da genética técnicas de engenharia.
Graças à precisão das abordagens de microscopia de televisão, medição de mudanças de diâmetro em preparações de artéria canulada pode fornecer altamente valiosas informações sobre mecanismos endotélio-dependente e independente de endotélio de vascular relaxamento, bem como alterações importantes (e às vezes inesperadas) em mecanismos de controlo vascular, ocorrendo com hipertensão, dieta alta em sal e outras intervenções experimentais. Além disso, a medição de relações de pressão-diâmetro em isolado e canulado artérias de resistência que estão relaxadas màxima por tratamento com Ca2 +-livre solução ou uma droga farmacológica vasodilatador, permite que o investigador avaliar mudanças estruturais nas artérias devido à remodelação vascular e para calcular o passivo de tensão-deformação relacionamentos7 que pode fornecer importantes insights sobre as mudanças nas propriedades mecânicas passivas das artérias que podem afetar a função arterial independente de (ou além de) alterações nos mecanismos de controle ativo. Também é importante observar que as informações obtidas a partir de estudos das artérias de resistência isolada podem ser complementadas por informações obtidas utilizando LDF, um método prático para avaliar a perfusão do tecido a todo animal nível8,9 ,10, e por informações obtidas de avaliar a densidade de microvessel usando fluorescente etiquetado GS1 lectina, que vincula especificamente para partes de glicoproteína na membrana do porão de pequenas arteríolas e capilares11 , 12. o último método fornece uma estimativa altamente precisa da densidade de microvessel que não está sujeita as clássicas dificuldades em estimar a densidade de microvessel pela contagem de vasos na vivo, por exemplo, faltando não perfundidos vasos onde o fluxo sanguíneo é interrompido devido ao fechamento ativo das arteríolas. Quando usados em conjunto, estas abordagens podem fornecer uma visão importante para correlacionar alterações funcionais nas artérias de resistência isolada para alterações na perfusão do tecido a nível microcirculatory; e alguns exemplos do uso dessas abordagens valiosos em conjunto com técnicas de artéria canulada também serão fornecidos no presente manuscrito.
O presente trabalho centra-se na utilização de técnicas de vídeo microscopia para avaliar alterações vasculares nas artérias de outbreds ratos Sprague-Dawley. No entanto, é importante salientar que estas técnicas têm provado para ser altamente valioso na elucidação de alterações fenotípicas em cepas de ratos geneticamente modificados altamente especializado criadas por reprodução seletiva ou gene utilizando técnicas de edição. Neste manuscrito, proporcionamos exemplos de técnicas de microscopia como vídeo forneceram informações importantes sobre a função vascular em um número de rato valioso modelos, incluindo a variedade de rato, um rato puras de (SS) sal-sensíveis de Dahl que é o mais amplamente utilizado o modelo experimental para estudar os mecanismos de sal sensível hypertenson18,19,20,21,22,23; e ratos consomic criados por meio de reprodução seletiva de ratos SS com a cepa de rato marrom Noruega (BN) diferenciação de sal. Os painéis de rato consomic, cada cromossoma de rato a Noruega de Brown tem sido meio individualmente para o fundo genético26 de25,Dahl SS24,. Uso de painéis de rato consomic forneceu pistas valiosas sobre cromossomos específicos que contribuem para a sensibilidade de sal da pressão arterial e outros fenótipos, incluindo a reatividade vascular24,25,26 de27, ,28.
Estratégias de reprodução seletiva utilizando SS ratos e ratos consomic carregando cromossomos individuais de BN também permitiram a geração de cepas congenic estreitada com pequenos segmentos do meio de cromossomos individual Brown Noruega em SS Dahl genética fundo de22,29. Estes podem fornecer extremamente valiosos entrada em genes específicos ou estreitas regiões dos cromossomos que podem afetar a cruciais variáveis fisiológicas, tais como pressão arterial, dano renal e reatividade vascular22,29. Outra adição poderosa para a caixa de ferramentas genéticas do rato é o desenvolvimento de modelos de nocaute do gene do rato utilizando gene avançada técnicas, incluindo ZFNs, transcriptional activator-como-effector nucleases (TALENS) e mais recentemente CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. O advento dessas técnicas poderosas que permitem que os genes ao ser nocauteado no rato é um desenvolvimento extremamente importante porque gene nocaute estudos até à data utilizaram (e continuam a usar) ratos quase exclusivamente. Outro componente experimental no presente trabalho demonstra o valor da artéria canulada técnicas e vídeo microscopia para avaliar os mecanismos de controle fisiológico em ratos nocaute falta a transcrição de proteção antioxidante e célula mestre fator, fator nuclear (eritroide-derivado 2) - como - 2 (NRF2)30,31, que foram desenvolvidos usando tecnologia TALEN no fundo genético de Sprague-Dawley17. Esses experimentos, foram utilizadas em vitro vídeo microscopia técnicas para fornecer uma verificação funcional de perda do gene NRF2 e testar uma abordagem terapêutica potencialmente valiosa baseada em directo upregulation de antioxidante NRF2-mediada defesas. NRF-2 é de substancial importância terapêutica no combate à estresse oxidativo vascular em seres humanos, à luz dos resultados decepcionantes de ensaios clínicos envolvendo a administração direta de antioxidantes como as vitaminas C e E32.

<table><tbody><tr><td>SS Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>Cepa SS / JHsd / Mcwi</td><td>Entre em contato com o Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr> <tr><td>SS.5BN Faculdade de Medicina de Ratos Consômicos</td><td>de Wisconsin</td><td>SS-Chr 5BN / Mcwi cepa</td><td>Entre em contato com o Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr> <tr><td>SS.13BN Faculdade de Medicina de Ratos Consômicos</td><td>de Wisconsin</td><td>SS-Chr 13BN / Mcwi</td><td>cepa Entre em contato com o Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr> <tr><td>Ren1-BN Faculdade de Medicina de Ratos Congênitos</td><td>de Wisconsin</td><td>SS. Cepa BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi</td><td>Entre em contato com o Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSA Congênita</td><td>Rat Medical College of Wisconsin</td><td>SS. Cepa BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi</td><td>Entre em contato com o Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSB Faculdade de Medicina de Ratos Congênitos</td><td>de Wisconsin</td><td>SS. Cepa BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi</td><td>Entre em contato com o Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Nrf2(-/-) Rato nocaute e irmãos de ninhada do tipo selvagem</td><td>Faculdade de Medicina de Wisconsin</td><td>SD-Nfe212em1Mcwi cepa</td><td>Entre em contato com o Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Rat Chow com baixo teor de sal (0,4% NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113755</tr><tr><td>ração de rato com alto teor de sal (4% NaCl) -AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113756</tr><tr><td>Colorado Video Caliper</td><td>Colorado Video, Inc.</td><td>Câmera de vídeo modelo 308</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>KPM1AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus Life Science</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Monitor de televisão</td><td>Panasonic</td><td>WVBM1410</td><td></td></tr><tr><td>Transdutores de pressão</td><td>Stoelting</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de exibição de pressão arterial</td><td>Stoelting</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de artéria canulada</td><td>Instrumentação de Sistemas Vivos</td><td>CH-1</td><td>Câmara de vaso único para uso geral</td></tr><tr><td>Controlador de Temperatura para Instrumentação</td><td>de Sistemas Vivos</td> de Câmara Única <td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Dispersão de Gás, Miniatura, Reta</td><td>Instrumentação de Sistemas Vivos</td><td>GD-MS</td><td>Fornece aeração no banho do vaso</td></tr><tr><td>Oxigenador de Troca Gasosa,</td><td>Instrumentação de Sistemas Vivos</td> em Miniatura <td>OX</td><td>Permite a troca gasosa com perfusato</td></tr><tr><td>Medidor de vazão Laser-Doppler</td><td>Perimed PeriFlux</td><td>5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>GS1 Lectin</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidro para micropipetas</td><td>Fredrich Haer Co.</td><td>27-33-1</td> Extrator de pipeta vertical de <td>2 mm ODX1 mm ID</td></tr><tr><td></td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 700C</td><td></td></tr><tr><td>Material de sutura de nylon (10/0)-3 PLY</td><td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td><td>114-ANM-10</td><td>Fios simples de sutura de nylon de 3 camadas provocados para uso em vasos</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fórceps-Inox</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras Vannas Ferramentas</td><td>de Ciências Finas</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Protandim</td><td>Protandim</td><td></td><td>NRF2 Indutor: Entre em contato com o Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td></tr> <tr><td>Biorreagentes Fisher</td> <td>de cloreto de sódio</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (d-glicose) anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4-7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880-500 G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2-2 H2O)</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio-monobásico (NaH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>P217-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico di-hidratado (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>ED255-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação dos mecanismos de controlo vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Este protocolo descreve o uso da microscopia em vitro de televisão para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral isolada (e outros vasos) e descreve técnicas para avaliar a perfusão do tecido usando Laser Doppler Flowmetry (LDF ) e microvessel densidade utilizando fluorescente etiquetado lectina de Griffonia simplicifolia (GS1). Métodos atuais para o estudo isolaram artérias de resistência no transmural pressões encontradas na vivo e na ausência de células parenquimais influências fornecem uma ligação crítica entre estudos em vivo e informações obtidas a partir de molecular abordagens reducionistas que fornecem a limitada visão Integrativa respostas a nível de todo animal. LDF e técnicas para identificar seletivamente arteríolas e capilares com fluorescente-etiquetadas GS1 lectina fornecem soluções práticas para permitir que os investigadores estender os conhecimentos adquiridos em estudos de artérias de resistência isolada. Este documento descreve a aplicação destas técnicas para obter conhecimentos fundamentais da fisiologia vascular e patologia no rato como modelo experimental geral e em uma variedade de especializados geneticamente cepas de rato "designer" que podem fornecer importantes insights sobre a influência de genes específicos na importantes fenótipos vasculares. Utilizando essas abordagens experimentais valiosas em cepas de ratos desenvolvidas pela reprodução seletiva estratégias e novas tecnologias para a produção de modelos de gene nocaute no rato, vai expandir o rigor das instalações científicas desenvolvidas em modelos do rato nocaute e Estenda esse conhecimento para um modelo animal mais relevante, com um fundo fisiológico bem compreendido e aptidão para estudos fisiológicos devido ao seu tamanho maior.

In vitro microscopia das artérias canuladas resistência permite o estudo dos fatores que influenciam o Tom ativo na resistência de pequenas artérias (e maiores arteríolas) a normal na vivo pressões transmurais e na ausência de células parenquimais influências. Além de avaliar a reatividade dos navios aos vários estímulos de vasodilatador e vasoconstritor e miogênico respostas para elevação de pressão transmural no PSS normal, o Ca2 +-PSS gratuito pode ser adic...

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar artérias resistentes isoladas para testar a reatividade do vaso frente a estímulos vasoativos. Também mostrará como avaliar alterações nos mecanismos de controle do músculo liso e nas propriedades mecânicas passivas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia vascular sobre os mecanismos de controle endotelial e do músculo liso vascular em artérias de pequena resistência durante diversas condições.A principal vantagem desta técnica é que artérias de pequena resistência podem ser isoladas do ambiente celular parenquimatoso e mantidas na sua pressão normal enquanto são testadas as respostas a estímulos vasoativos. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia e o diagnóstico da disfunção vascular. Esse tipo de manipulação não é possível in vivo.Embora este método possa fornecer informações sobre doenças vasculares periféricas, ele também pode ser aplicado à doença arterial coronariana. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de microcânulação são difíceis de aprender devido à delicadeza do procedimento e à necessidade de evitar danos à artéria. No dia do experimento, pr

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Nós demonstramos um modelo de ligadura arterial novel no músculo spinotrapezius murino, incluindo um procedimento passo-a-passo e uma descrição da instrumentação necessária. Descrevemos a cirurgia e avaliação dos resultados relevantes referentes à remodelação da rede vascular e vasodilatação funcional usando microscopia intravital e confocal.

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

Em Miografia pressão, um pequeno segmento de um vaso intacto é montado sobre duas pequenas cânulas e pressurizado a uma pressão adequada luminal. Aqui, descrevemos o método para medir a resposta vasorelaxation do mouse...

Avaliando Murino Resistência Função Usando Miografia Pressão Arterial

Miografia pressão é utilizado para avaliar a vasoactividade das pequenas artérias que se desenvolvem constrição prolongada quando pressurizado. Este manuscrito proporciona um protocolo detalhado para avaliar em segmentos isolados de pequenas artérias mesentéricas de ratos, vasoactividade e o efeito da pressão intraluminal no diâmetro vascular.

Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

Sistemas de tele-microscopia são usados para examinar as propriedades funcionais das arteríolas isoladas de tecido adiposo em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos. Esta técnica pode ser usada para examinar fenótipos microvasculares em domínios diferentes de tecido adiposo em seres humanos obesos.

Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

O protocolo descreve o uso de miografia de arame para avaliar a tensão isométrica transmural de artérias mesentéricas isoladas de camundongos, com especial consideração da modulação por fatores liberados das células endoteliais e dos tecidos adiposos perivasculares.

Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

O presente protocolo descreve os conceitos e a aplicação técnica da técnica do miógrafo tensométrico utilizando um sistema de miógrafo multicâmara na avaliação experimental ex vivo da função endotelial da aorta em camundongos.

Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume

O presente protocolo descreve a técnica de miógrafo de fio para medir a reatividade vascular da artéria coronária do rato.

Preparação padronizada do anel coronário de rato e gravação em tempo real de mudanças dinâmicas de tensão ao longo do diâmetro do vaso

Twin-to-twin síndrome de transfusão e seqüência policitemia twin anemia são dois problemas potencialmente devastadores na medicina perinatal. Ambos os distúrbios ocorrem apenas em gêmeos monocoriônicos e resultam de fluxo sanguíneo através da placenta desequilibrada anastomoses vascular. Nós fornecemos um protocolo simples para avaliar com precisão a presença de anastomoses vascular usando injeção de tinta colorida dos vasos da placenta após o nascimento.

Avaliação precisas e simples de anastomoses vasculares em Placenta monocoriônicas usando Dye Colorido

Aprenda a avaliar mecanismos de controlo vascular em artérias de resistência isoladas de ratos utilizando microscopia de vídeo in vitro. Este método permite estudar a reatividade vascular e função endotelial em ambiente controlado.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

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