Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

O objetivo geral deste procedimento é utilizar artérias de resistência isoladas para testar a reatividade do vaso a estímulos vasoativos. Também mostrará como avaliar as mudanças nos mecanismos de controle do músculo liso e nas propriedades mecânicas passivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia vascular sobre os mecanismos de controle endotelial e do músculo liso vascular em artérias de pequena resistência durante várias condições.

A principal vantagem dessa técnica é que as artérias de pequena resistência podem ser isoladas do ambiente celular parenquimatoso e mantidas em sua pressão normal enquanto as respostas aos estímulos vasoativos são testadas. As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico de disfunção vascular. Este tipo de manipulação não é possível in vivo.

Embora esse método possa fornecer informações sobre doenças vasculares periféricas, ele também pode ser aplicado à doença arterial coronariana. A demonstração visual desse método é fundamental, pois as etapas de microcanulação são difíceis de aprender devido à delicadeza do procedimento e à necessidade de evitar danos à artéria. No dia do experimento, prepare dois litros de uma solução salina fisiológica em um frasco Erlenmeyer de dois litros.

Ao adicionar o estoque tampão 20X, certifique-se de que a solução esteja continuamente se equilibrando com a mistura de gases e agitando-a com uma barra de agitação magnética. Em seguida, observe o pH enquanto adiciona 0,28 gramas de fosfato monossódico à mistura. Conforme necessário, ajuste o pH adicionando gotas de ácido clorídrico normal seis ou solução de hidróxido de sódio normal 6,5 de uma pipeta Pasteur para que o pH permaneça em 7,4.

Em seguida, adicione 1,98 gramas de glicose à solução salina fisiológica. Em seguida, prepare 500 mililitros de uma solução salina fisiológica sem cálcio diluindo a solução estoque 20X em água deionizada. Em seguida, adicione 25 mililitros do estoque tampão 20X em um frasco Erlenmeyer e adicione 0,07 gramas de fosfato monossódico à solução enquanto monitora e ajusta o pH da solução.

Use tubos de tetrafluoretileno para conectar um tanque de gás contendo a mistura de gases apropriada ao banho de órgãos. Borbulhar continuamente a solução a uma taxa suficiente para garantir o borbulhamento contínuo, mas não turbulento, da solução que flui para a câmara do recipiente. Além disso, coloque uma pequena pedra de ar conectada à mistura de gases de equilíbrio na câmara do vaso para ajudar a manter a composição fisiológica do gás da solução salina

Coloque a solução salina fisiológica em uma garrafa Mariotte de dois litros. Adicione um tubo de vidro central a uma rolha para servir como um reservatório que fornecerá continuamente a solução salina fisiológica no banho de órgão farmacológico que fornece a solução à câmara do vaso. Coloque a abertura do tubo de vidro central na garrafa Mariotte no mesmo nível que a parte superior da solução salina fisiológica no banho de órgãos.

Isso garantirá uma carga de pressão hidrostática constante para a entrega da solução salina fisiológica no banho do órgão. Use um tubo de polietileno conectado a um tubo de vidro em forma de J para fornecer a solução salina fisiológica da garrafa Mariotte e no banho do órgão. Para profusão luminal, use tubos de polietileno para conectar a pipeta de entrada a um reservatório de solução salina fisiológica composto por uma seringa plástica de 66 CC elevada a uma posição que mantenha a pressão de entrada desejada.

Monitore a pressão conectando um transdutor de pressão ao sistema por meio de uma torneira. Em seguida, conecte a pipeta de saída a um tubo de polietileno a um reservatório semelhante ao reservatório de entrada para permitir que a solução salina fisiológica flua através do vaso em resposta a um gradiente de pressão. Além disso, use uma torneira semelhante e uma conexão de transdutor de pressão para monitorar a pressão de saída.

Remova o cérebro de um rato Sprague Dawley e coloque-o em decúbito dorsal em uma placa de Petri de vidro cheia de solução salina fisiológica gelada. Em seguida, coloque o prato sob um estereoscópio. Use uma tesoura Vannas e uma pinça de ponta fina Dumont número cinco para extirpar as artérias cerebrais médias do cérebro.

Em seguida, limpe qualquer tecido cerebral residual da artéria cerebral média usando o fórceps. Transfira a artéria para a câmara do vaso, segurando-a suavemente pela extremidade do segmento excisado e coloque-a cuidadosamente na câmara. Em seguida, rosqueie a artéria cerebral na micropipeta de entrada, puxando-a em direção à base da pipeta até que a ponta avance para o lúmen da artéria.

Prenda a artéria na pipeta de entrada amarrando um laço preparado a partir de uma fibra de fio único previamente provocada a partir de suturas 10-0 ao redor da artéria. Em seguida, prenda a extremidade oposta da artéria cerebral média à pipeta de saída, apertando uma segunda alça de sutura ao redor do vaso e use o micrômetro conectado ao suporte da pipeta de entrada para esticar a artéria até seu comprimento in situ. Amarre todos os ramos laterais usando fios simples provocados de suturas 10-0 para manter uma pressão constante na artéria.

Em seguida, configure um microscópio de vídeo que consiste em uma câmera de vídeo conectada a um microscópio de dissecação conectado a um micrômetro de vídeo e a um monitor de televisão. Use esta configuração para medir o diâmetro interno da artéria. Avalie o tônus miogênico e as respostas dos vasos aos estímulos vasodilatadores, certificando-se de que a artéria exiba um nível adequado de tônus ativo antes do experimento.

Descarte todas as artérias sem tônus ativo em repouso, com exceção de vasos como pequenas artérias mesentéricas que normalmente não exibem tônus ativo de repouso. Em seguida, adicione concentrações crescentes de acetilcolina à câmara do vaso e meça os diâmetros dos vasos para testar a reatividade dependente do endotélio da artéria de resistência canulada. Neste exemplo, a artéria exibe disfunção endotelial, conforme demonstrado por sua falha em dilatar em resposta à acetilcolina.

No final do experimento, determinar o diâmetro máximo da artéria adicionando solução salina fisiológica isenta de cálcio ao perfusato e ao superfusato. Use esta medida para calcular a porcentagem de tom de repouso ativo. A demonstração de uma dilatação máxima em solução salina fisiológica livre de cálcio verifica que a falha da artéria em dilatar em resposta à acetilcolina foi devido à disfunção endotelial e não devido à incapacidade da artéria de relaxar devido à remodelação estrutural do vaso.

Esta figura ilustra as respostas ao vasodilatador dependente do endotélio acetilcolina em artérias cerebrais médias isoladas de ratos machos sensíveis ao sal de Dahl nas três cepas congênitas estreitas. Isso mostra que a dilatação dependente do endotélio para acetilcolina estava ausente na cepa parental sensível ao sal e em ambas as cepas congênitas que retinham o alelo Renan sensível ao sal. A dilatação normal foi restaurada na cepa congênita que carregava o alelo marrom Noruega Renan no fundo genético sensível ao sal, apoiando a hipótese de que a disfunção endotelial em ratos SS é devida a uma regulação prejudicada do gene Renan.

Neste experimento, o fracasso da dieta rica em sal em eliminar a dilatação dependente do endotélio em acetilcolina em uma cepa particular de rato, os achados sobre os contribuintes para o estresse oxidante vascular e disfunção endotelial durante elevações na ingestão de sal na dieta. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a 3 horas e meia se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear a artéria isolada com muito cuidado para evitar danos ao músculo liso e especialmente ao endotélio.

Após esse procedimento, outros métodos, como a adição de agonistas vasoconstritores e vasodilatadores ou antagonistas de receptores, podem ser realizados para responder a perguntas, incluindo mecanismos que afetam a reatividade vascular a diferentes substâncias e mecanismos de ação de drogas nos vasos sanguíneos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de biologia vascular e fisiologia microcirculatória explorarem o músculo liso e a função endotelial em artérias de resistência de diferentes leitos vasculares de animais experimentais e humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar esse método para avaliar os mecanismos de controle do músculo liso endotelial e vascular em pequenas artérias de resistência de diferentes leitos vasculares.