Name: Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a dissecar a retina humana e o complexo RPE-coroide para análise proteômica. Este método permite coletar biópsias da fóvea, mácula e retina periférica com precisão.

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VBM é suportada por concessões de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 e pesquisa para evitar cegueira (RPB), New York, NY. MT e GV são suportados pelo NIH conceder T32GM007337.

este estudo foi aprovado pela Universidade de Iowa &#39; s Conselho de revisão institucional e adere aos princípios estabelecidos na declaração de Helsinque.
 1. Foveal e Macular soco biópsia <ol><li>aberto e borboleta olho humano, que consiste em 4 diferentes retalhos de tecido, conforme descrito em uma publicação anterior. 5</li> <li>começando com um borboleta olho humano colocado em uma placa de Petri, centralize uma ferramenta de biópsia do perfurador de 4 mm sobre a fóvea, pressione para baixo e role suavemente até que uma incisão é feita ao redor da fóvea.</li>
	<li>Em seguida, gerar uma incisão ao redor da mácula centralização e pressionando para baixo uma ferramenta de biópsia do perfurador de 8 mm da pele dentro das arcadas do macula, aplicando uma pressão suave e rolamento. Isto produzirá um anel exterior, segundo do tecido circundante a primeira.</li>
</ol> 2. Soco de biópsia da retina periférica ferramenta de biópsia <ol><li>uso o soco de 4 milímetros da pele para fazer uma série de socos na retina periférica, apenas fora da arcada. Aqui, fazer dois socos para cada aba quadrante. 
	Nota: Depois de todos os golpes são feitos, o olho terá dois socos concêntricos no centro, representando a fóvea e macula, e dois socos na base de cada aba-totalizando 8 socos na retina periférica.</li>
</ol> 3. Fóvea e coleção de biópsia Macula <ol><li>como o tecido está agora pronto para coleta, coletar todas as biópsias de tecido em tubos de microcentrífuga separado e congelamento com nitrogênio líquido para processamento a jusante. Armazenar todas as amostras a-80 ° C até utilização.</li>
	<li>Use uma pinça de Colibri 0.12 curvo para pegar as bordas do tecido translúcido da fóvea da retina. Para coletar, elevar e separar o tecido central do RPE-coroide subjacente.</li>
	<li>Da mesma forma, use a pinça Colibri 0,12 para agarrar o anel exterior do tecido translúcido mácula. Se o tecido ainda está anexado ao tecido subjacente ou adjacente, usar um par de tesoura Westcott para aparar cuidadosamente a borda, capturando apenas o componente da retina e dissecando afastado qualquer tecido de nervo óptico incluído no ponche.</li>
</ol> 4. Coleção de Retina periférica <ol><li>usar os fórceps de Colibri 0,12 curvados delicadamente, separar os discos de tecido da retina periférica da RPE coroide subjacente e coloque dentro de tubos de microcentrífuga individuais.</li>
	<li>No caso do gel vítreo residual, use a pinça para levantar e separar o gel fora tanto quanto possível antes da coleta do tecido retinal. Uma vez que a retina foi removida, a pigmentada RPE-coroide permanece abaixo.</li>
</ol> 5. Central e Macula RPE coroide coleção <ol><li>uso a 0,12 Colibri fórceps para apreender as bordas do tecido RPE coroide escuro que se encontra abaixo da área da fóvea removida. Separe com cuidado este tecido da esclera e coletar.</li>
	<li>Usando a pinça mesma, segure as bordas do anel externo de tecido de RPE coroide escuro subjacente a área macular removida. Separe com cuidado este tecido da esclera, segurando as bordas em pontos diferentes ao redor do anel e puxando levemente. Eventualmente, o anel de tecido RPE coroide vai ser desalojado e podem ser coletado. 
	Nota: Fórceps secundário na mão oposta pode ser útil em manipular o tecido RPE coroide durante a remoção. Como o tecido da retina, Wescott tesoura pode ser usada para auxiliar na remoção de qualquer tecido que não foi totalmente incisão usando a ferramenta do perfurador.</li>
</ol> 6. Coleção de RPE coroide Retina periférica <ol><li>usar a pinça Colibri 0,12 para descascar o RPE-coroide nas 8 áreas periféricas soco.</li>
	<li>Como anteriormente, coloque o tecido de RPE coroide em tubos de microcentrífuga e congelamento com nitrogênio líquido para processamento a jusante. Manter todas as amostras a-80 ° C até utilização.</li>
</ol> 7. Dissecação de tesoura Nota: se a lâmina de biópsia do perfurador é maçante ou a ferramenta de biópsia do perfurador é empurrada não dura o suficiente, pode não haver um Clean-Cut o tecido circundante.
<ol><li>Nestes casos, afastar o tecido tanto quanto possível e em seguida, use tesoura Westcott para aparar e separar.</li></ol>

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<li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).</li>
<li>Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+of+the+phosphoproteome+in+postmortem+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains.</a> PLoS One. 6 (6), e21405(2011).</li>
<li>Nagy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+postmortem+interval+on+biomolecule+integrity+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).</li>
<li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+frozen+tissue+samples+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection.</a> Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Depois de tecido recolha, manipulação de amostra e tratamento são cruciais considerações14. Preservação em nitrogênio líquido é preferida por fixação química, como o último pode resultar em danos à estrutura da proteína, que pode distorcer a análise a jusante. Além disso, a preservação de nitrogênio líquido é preferencial para métodos que não envolvem o congelamento de amostras. Notavelmente, Ferrer et al mostraram diferenças significativas nos níveis de proteína entre amostras de cérebro...

A retina, RPE e coroide são tecidos complexos que demonstram diferenças regionais importantes na expressão de proteínas, função fisiológica e patológica suscetibilidades1,2. Por exemplo, doenças como a Degeneração Macular Age-Related (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia serosa central cada demonstram característica localização dentro da fóvea, mácula ou retina periferia1,3, 4,6. Aqui, apresentamos um método demonstrando como distinta da retina regiões podem ser degustadas de forma independente. O objetivo geral deste método é fornecer um guia confiável para coleta de amostras de tecido da região macular, Central e periférica da retina humana e RPE coroide para análise proteômica. A justificativa para o desenvolvimento e a utilização desta técnica é que através da análise de proteomic destas regiões específicas da retina, importante introspecções moleculares podem ser adquiridas para as funções fisiológicas e fisiopatológicas destas regiões.
Esta abordagem promete revelar a base de proteomic para suscetibilidades doença regional relativo e para facilitar a identificação de novos alvos terapêuticos específicos. Com efeito, proteomic investigações sobre o vítreo e suas interações com a retina forneceu insights-chave na composição molecular e função dos tecidos saudáveis e doentes5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, análises de proteomic nítida de distintas regiões da retina são escassos. A técnica vai ajudar a apoiar estes estudos muito necessária, proporcionando vantagens sobre outros métodos demonstrando uma abordagem de coleta de tecido confiável e reprodutível. Mais ainda, a abordagem é muito acessível, aproveitando-se do ponche de tecido tamanho padrão e prontamente disponíveis a ferramentas de biópsia. Nossa técnica enfatiza a recolha e armazenamento de tecidos para proteomic processamento, fazendo considerações importantes para a estabilidade da proteína e degradação. Assim, este método é mais adequado para os investigadores a jusante análise molecular de proteomic factores a considerar.

<table><tbody><tr><td>Ferramenta de biópsia por punção cutânea de 4 mm</td><td>Miltex</td><td>REF 33-34</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de biópsia por punção cutânea de 8 mm</td><td>Miltex</td><td>REF 33-37</td><td></td></tr><tr><td>0.12 Pinça Colibri</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1145</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Wescott</td><td>Sklar Surgical Instruments</td><td>64-3146</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga</td><td>Eppendorf</td><td>#022364111</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Nitrogênio Líquido</td><td>Praxair, Inc.</td><td>7727-37-9 [R]</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecação da retina humana e rpe coroide para análise proteômica

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

A retina humana é composta da neuroretina sensorial e o epitélio pigmentado da retina subjacente (RPE), que é complexado com firmeza à camada vascular da coroide. Diferentes regiões da retina são anatomicamente e molecularmente distintas, facilitando as funções originais e demonstrando o diferencial susceptibilidade à doença. Análise proteômica de cada uma destas regiões e camadas pode fornecer insights vitais sobre o processo molecular de muitas doenças, incluindo Age-Related Degeneração Macular (AMD), diabetes mellitus e glaucoma. No entanto, separação de camadas e regiões da retina é essencial antes de análise proteômica quantitativa pode ser realizado. Aqui, descrevemos um método para dissecção e coleção de regiões da retina central, periféricas e maculares e subjacentes RPE coroide complexo, envolvendo regional soco biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano. Unidimensional de SDS-PAGE, bem como análise de proteomic a jusante, tais como líquida espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS), pode ser usado para identificar proteínas em cada camada da retina dissecada, revelando moleculares biomarcadores para doenças da retina.

Tecido de RPE coroide e da retina podem ser processadas de várias maneiras, de acordo com uma investigação individual. Após a coleta, o pesquisador possuirá amostras da retina e RPE coroide tecido da região central, exterior mácula e retina periférica (Figura 1). Especificamente, o soco de região central incluirá a fóvea, o parafovea e uma pequena quantidade do perifovea adjacente. O soco macular inclui o restante da região perifoveal, bem como uma pequena qu...

A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.

Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Este vídeo ilustrará como coletar biópsias de tecido da fóvea, mácula e retina periférica para pesquisas proteômicas. Em vários passos, utilizaremos uma ferramenta de biópsia de pele de quatro milímetros. O olho humano é colocado em uma placa de Petri após ter sido aberto em borboleta.O instrumento de biópsia por punção é centralizado exatamente sobre a fóvea, pressiona-se para baixo e gira-se levemente até que uma incisão seja feita ao redor da fóvea. Centralize e pressione uma biópsia por punção de oito milímetros dentro dos arcos da mácula, com pressão suave e movimento de rotação. Novamente, utilize a biópsia por punção de quatro milímetros para fazer uma série de punções na retina periférica, logo fora do arco.Obtemos dois punções para cada retalho. Após todas as punções serem realizadas, o olho terá uma aparência semelhante a esta. E estamos prontos para iniciar o processo de coleta de tecido.Utilizamos uma pinça curva Colibri 0,12 para segurar as bordas do tecido. Aqui, agarramos a borda da retina foveal. A mesma pinça é usada para segurar o anel de tecido macular.Neste caso, parece estar preso ao disco. Usando uma tesoura Westcott, você pode aparar a borda, de modo a captur

dissection-of-human-retina-and-rpe-choroid-for-proteomic-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este artigo descreve uma abordagem para microdissect retinas zebrafish com e sem epitélio pigmentar da retina em anexo, 1-3 embriões dia postfertilization.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Nós fornecemos um método reprodutível para monocamadas confluentes de cultura humana fetal células epitélio pigmentar da retina (hfRPE) células que apresentam morfologia, fisiologia, polaridade, e proteína e os padrões de expressão gênica do tecido nativo adulto. Este trabalho foi estendido para um modelo animal de várias doenças oculares.

Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

Este vídeo mostra uma técnica eficaz para diferenciar e dissecando os vários semi-transparente das estruturas do corpo humano na pós vítreos olhos mortem.

Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica

Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

Um método para o isolamento de um único células da retina e amplificação subsequente dos seus ADNc é descrito. Unicelulares Transcritômica revela o grau de heterogeneidade celular presente num tecido e descobre genes novo marcador de populações de células raras. O protocolo que acompanha pode ser ajustado para se adequar muitos tipos de células diferentes.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Descrevemos um método para separar eficientemente o epitélio pigmentar da retina (EPR) da retina em olhos humanos e gerar montagens planas inteiras de EPR/coroide para análises histológicas e morfométricas da EPR.

Geração eficiente e consistente de epitélio/coroide de pigmento da retina a partir de olhos humanos para análise histológica

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Este trabalho apresenta uma preparação alternativa de retina flatmount na qual a remoção de corpos celulares fotorreceptores permite uma difusão mais rápida de anticorpos e um melhor acesso da pipeta de remendo aos neurônios internos da retina para experimentos de imunohistoquímica, hibridização in situ e eletrofisiologia.

Split Retina como uma Preparação Flatmount Melhorada para o Estudo de Neurônios da Camada Nuclear Interna na Retina de Vertebrados

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