Name: Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Aprenda a avaliar funções efetoras mediadas por Fc de anticorpos contra hemaglutinina do vírus influenza usando células HEK293. Este método rápido de 24 horas auxilia pesquisas em imunologia e vacinologia.

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Este projecto foi financiado em parte com fundos federais do Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas, National Institutes of Health, departamento de saúde e serviços humanos, sob CEIRS P01AI097092-04S1 (P.E.L.) do contrato.

Os experimentos pré-formado neste manuscrito foram feitos institucional código do seguir Icahn da faculdade de medicina de ética e regulamentação.
1. expressão de hemaglutinina do vírus da gripe através de transfeccao ou infecção
Transfecção:
<ol><li>Células de rim humano embrionário (HEK 293T) placa em uma densidade de 2 x 104 células/poço em cultura de tecido branca trataram placa de 96 poços e deixem descansar por 4 horas em uma incubadora de 37 °C (com 5% CO2).</li>
	<li>Transfect células com 100 ng de DNA que codifica para a hemaglutinina viral e 0,2 µ l de reagente de transfeccao por bem em um volume total de 50 μL. Nota: Ambos reagente do plasmídeo e transfectant são diluídos em 1 x Opti-mínimo essencial Media (MEM) reduzida média de soro.</li>
	<li>Incubar as placas em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 para 18 h, depois de remover mídia do transfection.</li>
</ol>2. infecção
<ol><li>Células de rim canino A549 placa ou Madin Darby em uma densidade de 2 x 104 células/poço em cultura de tecido branca trataram placa de 96 poços e crescerem pelo menos 18 h numa incubadora 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Vírus diluído em 1 x MEM e infectar células em uma multiplicidade de infecção de 0,33 por 1h em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2, 1 ou 3. Volume total deve ser igual 100 μL. Nota: 10 x MEM é diluída com água para fazer um estoque de trabalho MEM para diluição de vírus mencionada acima de 1x.</li>
	<li>Após a infecção, remover o inóculo e adicionar 100 μL de 1 x MEM na placa na ausência de tripsina.</li>
	<li>Cresce células infectadas por 18 a 24 h em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2.</li>
</ol>3. avaliação da ativação FcRg/NFAT-mediada de Luciferase atividade por anticorpos monoclonais ou Sera
<ol><li>Primeiro, substitua a mídia de crescimento das células transfectadas ou infectadas com 25 µ l de mídia do ensaio (1 x RPMI 1640 suplementado com 4% (vol/vol) baixa IgG fetal bovino soros).</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços separada, realize quatro diluições dos anticorpos de interesse começando em 30 μg/mL, utilizando o meio de ensaio. Realizar diluições em triplica e um layout de placa de exemplo está ilustrado na figura 1A. Certifique-se de incluir um controle que exclui o anticorpo (sem controle de anticorpo) bem como um controle de fundo (buffer de ensaio sozinho). Nota: para ambos os 'sem anticorpos' e controles de fundo, adicione 25 µ l de tampão de ensaio em vez de anticorpo.</li>
	<li>Transferi 25 μL dos anticorpos serialmente diluídos de passo 3.2 para poços correspondentes na placa de células transfectadas ou células infectadas.</li>
	<li>Incube a placa em uma incubadora de 37 °C (com 5% CO2) por 15 min.</li>
	<li>Adicione 25 μL da célula apropriada effector modificados Jurkat expressando murino FcgRIV ou FcgRIIIa humano (75.000 células/poço). Volume total para cada bem deve ser 75 µ l e a concentração inicial e final do anticorpo é a 10 µ g/mL (figura 1B). Nota: Para o controle de fundo, adicione 25 µ l de buffer de ensaio em vez de células efetoras. Para examinar a fagocitose de mediada por células dependente de anticorpo, uma célula modificada de Jurkat expressando a FcgRIIa humana pode ser usada.</li>
	<li>Incube a placa em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 para 6 h.</li>
	<li>Degelo e tampão de substrato luciferase quente em uma água de 37 °C por cerca de 1h antes da utilização. Nota: Para fazer o tampão de substrato de luciferase, reconstitua o liofilizado luciferase ensaio substrato no buffer de ensaio fornecido. O tampão de substrato reconstituído pode ser armazenado a-30 °C até-10 °C por até seis semanas.</li>
	<li>Adicione 75 μL/poço do tampão de substrato de luciferase para todos os poços excepto o controle de fundo.</li>
	<li>Ler um luminómetro.</li>
	<li>Calcular a indução de dobra com a seguinte equação: dobre a indução = (valor de valor-Background induzida) / (nenhum valor de valor-fundo de mAb).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
<li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li>
<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
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<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+specificity+plays+a+critical+role+in+regulating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus.</a> PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).</li>
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<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies%3A+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610(2015).</li>
<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
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<li>Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fc%CE%B3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors.</a> J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li>
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</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

O método descrito aqui permite que o usuário medir a capacidade de um anticorpo monoclonal de HA-específicas para envolver o FcγRIV murino. O antígeno alvo, hemaglutinina do vírus da gripe, é expressa na superfície das células após a infecção por vírus ou transfeccao de Plasmideo DNA. O ensaio é mais ameno com diferentes proteínas virais superfície-expresso em combinação com outros FcγRs (humanos ou murino). Além disso, nós usamos amostras de soros para avaliar a capacidade de anticorpos em um contexto policlonal para in...

Imunidade fornecida pela vacina contra a gripe sazonal tradicionalmente tenha sido avaliada pela hemaglutinação (HI) de inibição do ensaio1, que mede a presença de anticorpos que visam o sítio de ligação do receptor da hemaglutinina. Estes anticorpos HI-ativo podem conferir imunidade esterilizante, mas são geralmente estreitos em sua amplitude de proteção, oferecendo imunidade para apenas um seleto poucos estirpes do vírus gripe. O isolamento e caracterização de amplamente reativos anticorpos monoclonais que reconhecem a hemaglutinina (HA) sugerem que o desenvolvimento de uma vacina universal da gripe está ao alcance de3,2,4, 5 , 6 , 7 , 8. um dos objectivos principais de uma vacina universal da gripe é induzir uma resposta do anticorpo forte em direção as regiões conservadas do vírus da gripe9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. amplamente reativos anticorpos que reconhecem estes resumos conservados, composto de neutralizantes e não-neutralizando anticorpos17,18, foram mostrados para exigir Fc-FcγR interações para ideal proteção na vivo e destacar a contribuição da imunidade mediada por Fc para a resposta imune geral a gripe vírus19,20.
Correlações de proteção são cruciais na avaliação de imunidade à infecção. Essas métricas permitem que os cientistas e médicos estimar a eficácia das vacinas, o significado dos dados e o curso do tratamento. O único estabelecido correlato de proteção contra a infecção pelo vírus da gripe é o ensaio de inibição da hemaglutinação. Um título de 01:40 é associado com uma redução de 50% no risco de doença1,21 – e reflete a presença de anticorpos que inibem a aglutinação alvejando o receptor binding site localizado na cabeça globular do HA. No entanto, também deve ser notado que respostas de células T podem ser uma melhor correlação de proteção contra a infecção pelo vírus da gripe em idosos. Curiosamente, um relatório recente sugere que a atividade de inibição de neuraminidase pode ser um melhor preditor de imunidade à gripe22. Felizmente, típico em vitro ensaios tais como ensaios de inibição de neutralização ou neuraminidase podem medir os anticorpos de talo ou neuraminidase-específicos HA. A maioria destes ensaios convencionais em vitro , no entanto, só leva em conta a função da região de ligação do antígeno do anticorpo e não meça o papel da região de Fc. Além disso, a contribuição dos anticorpos não neutralizantes que proteger via Fc receptor noivado na vivo não são detectados17,18. Para medir a proteção conferida pelos anticorpos que induzem a imunidade mediada por Fc como citotoxicidade mediada de célula dependente de anticorpo (ADCC), é necessário um ensaio robusto em vitro .
O método descrito abaixo avalia a capacidade de murino anticorpos monoclonais para induzir funções Fc-mediada através da utilização de uma linhagem de células Jurkat geneticamente modificada expressando uma ativando murino digite 1 FcR, FcγRIV. Noivado de anticorpo da FcγR transduces esse fator nuclear de gatilhos de atividade luciferase mediada por células T ativadas de sinalização intracelular. O ensaio tem várias vantagens sobre as técnicas tradicionais que exigem isolamento e cultura de células efetoras primário e o uso da citometria de fluxo para detectar a ativação do efetor mediada por Fc funções19,23,24 ,25,26. Em primeiro lugar, o protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para incorporar diferentes alvos virais, FcγRs e anticorpos de diferentes espécies (humanos e murino). Em segundo lugar, o uso de um modificado células Jurkat linha expressando uma FcγR com um gene do repórter do luciferase sob um fator nuclear das células T ativadas (NFAT) permite a um ensaio de grande formato que pode ser facilmente analisado usando um leitor de placa medindo luminescência. Aqui, a tradicional ativação de células efetoras primário é substituída com a indução do NFAT-luciferase sobre noivado de anticorpo de um FcγR na superfície da célula Jurkat. Este ensaio de formato de placa de 96 poços permite a medição de até quatro diferentes amostras em triplica com sete diluições – um número de amostras que poderia ser complicado usando técnicas tradicionais. Existem pontos adicionais a serem considerados com este ensaio que pode afetar o projeto de experimentos e interpretação de dados. O alvo viral deve ser expressos na superfície da pilha em ordem para reconhecimento de anticorpos. Para atenuar isso, o antígeno alvo (por exemplo, uma proteína viral interna) pode ser revestido diretamente na superfície de uma placa. No entanto, isto não ainda foi rigorosamente testado. Além disso, a linhagem de células Jurkat modificada expressa apenas um tipo de ativação FcγR e não expressa qualquer FcγRs inibitório, enquanto linhas de célula primária expressam todos os receptores em um contexto fisiológico.
Utilizámos anteriormente neste ensaio para demonstrar que o epítopo especificidade em um contexto de polyclonal desempenha um papel crucial na regulação de funções efetoras mediada por Fc e que ideal ativação da resposta de mediada por células dependente de anticorpo requer dois pontos de contato27,28. Aqui, descrevemos um método que avalia a capacidade dos anticorpos monoclonais específicos do talo para engajar e ativar o murino ativando FcγRIV. Embora haja exceções29,30, um grande número de anticorpos reativos amplamente região da haste antigenicamente conservada a hemaglutinina de destino e, portanto, desempenhar um papel importante no desenvolvimento de uma gripe universal vacina.

<table><tbody><tr><td>Células A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>Células epiteliais basais alveolares humanas adenocarcinômicas</td></tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Células renais embrionárias humanas</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Reagente de</td><td>transfecção</td>11668019</tr><tr><td>1X Opti-MEM Soro Reduzido Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos brancos</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3917</td><td>placas de ensaio</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Célula Jurkat expressando murino FcgRIV</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>Kit fornece inclui células, sistema de ensaio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e baixo soro IgG</td></tr><tr><td>Célula Jurkat expressando humano FcgRIIIa</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>Kit fornece inclui células, sistema de ensaio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e soro</td></tr> <tr><td>baixo IgGO</td> kit <td>Promega</td><td>G9901</td> de FcgRIIa humano que expressa células Jurkat <td>fornece inclui células, sistema de ensaio de Luciferase Bio-Glo, 1X RPMI e soro de baixa IgG</td></tr><tr><td>Luminômetro Leitor</td> de <td>placas de luminescência</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase Bio-Glo Sistema de ensaio de luciferase</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>Contém tampão de ensaio de luciferase e substrato de ensaio de luciferase</td></tr><tr><td>Células renais caninas Madin Darby</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Células renais caninas</td></tr></tbody></table>

um método para avaliar funções efetoras mediada por fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Os anticorpos desempenham um papel crucial no acoplamento as respostas imune inatas e adaptativas contra patógenos virais através dos seus domínios de ligação do antígeno e Fc-regiões. Aqui, descrevemos como medir a ativação do Fc funções efetoras por anticorpos monoclonais visando a hemaglutinina do vírus da gripe com o uso de uma linhagem de células Jurkat geneticamente expressando uma ativação tipo Fc 1-FcγR. usando esse método, o contribuição de interações específicas de Fc-FcγR conferidos por imunoglobulinas pode ser determinada usando um ensaio em vitro .

Demonstrámos que um talo específicos mAb, 6F12, mas não específicos cabeça um cabeça específicos mAb, PY102, era capaz de ativar células primárias de assassinas naturais por estrogenos CD107a e interferon γ19. Para modelar a capacidade de um anticorpo específico de talo de ativar pilhas NK humanas primárias, mostramos que um mAb talo-específicas, 6F12, robustamente pode ativar a célula Jurkat modificada, expressando o murino FcγRIV por ~ 14-fold. Por outro lado, o mAb específico cabeça, PY102 e o ...

Nós descrevemos um método para medir a ativação das funções efetoras Fc-mediada por anticorpos que visam a hemaglutinina do vírus da gripe. Este ensaio também pode ser adaptado para avaliar a capacidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais soros visando outras glicoproteínas de superfície virais para induzir imunidade mediada por Fc.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

O objetivo geral deste protocolo é avaliar a capacidade de um anticorpo ou de uma amostra de soro de ativar funções efetoras mediadas pelo fragmento Fc. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de imunologia e vacinologia ao medir a ativação da imunidade mediada pelo fragmento Fc dependente de anticorpos. A principal vantagem desta técnica é que o experimento pode ser realizado em até 24 horas, desde o preparo do material até a análise dos dados.Demonstrando este procedimento será Mark Bailey, aluno de pós-graduação do laboratório de Peter Palese. Para induzir a expressão da hemaglutinina do vírus da gripe por meio de transfeção, plaque primeiro células renais embrionárias humanas 293 numa concentração de duas vezes 10 à quarta células por poço em uma placa de cultura de tecidos branca com 96 poços. Após quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2, transfecte as células com 100 nanogramas de DNA codificando para a hemaglutinina viral e 0,2 microlitros de reagente de transfeção por poço, em um volume total de 50 microlitros de meio ótimo com soro reduzido 1X.Adicione os complexos de DNA e lipossomos a cada poço para realizar a transfeção e devolva a placa ao incubador por mais 18 horas. Para induzir a expressão da hemaglutinina do vírus da gripe por meio de infecção, plaque células A549 numa concentração de duas vezes 10 à quarta células por poço em uma placa de 96 poços tratada para cultura de tecidos, de cor branca, e incube por pelo menos 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Ao final da incubação, dilua o vírus da gripe a uma multiplicidade de infecção de três em 100 microlitros de meio MEM 1X por poço e infecte as células A549 por uma hora no incubador de cultura celular.No final da incubação, substitua o inóculo por 100 microlitros de meio MEM 1X fresco sem vírus e retorne as células ao incubador por mais 18 a 24 horas. Para avaliar a capacidade de anticorpos específicos de interesse em direcionar as células que expressam hemaglutinina, substitua o sobrenadante das culturas celulares afetadas pelo vírus por 25 microlitros de meio do ensaio de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos ou meio ADCC. Em seguida, em uma placa separada de 96 poços, realize quatro diluições completas dos anticorpos de interesse em triplicata em meio ADCC fresco, começando com 10 microgramas por mililitro, conforme o esquema, tomando o cuidado de incluir os controles de fundo e sem anticorpo.Quando todo o anticorpo tiver sido diluído, transfira 25 microlitros do anticorpo diluído para os poços correspondentes apropriados na placa de células experimentais e coloque a placa no incubador de cultura celular. Após 15 minutos, adicione 7,5 vezes 10 à quarta de células Jurkat efetoras modificadas, expressando o receptor Fc apropriado, por poço, em 25 microlitros de meio ADCC, para um volume final de 75 microlitros de meio ADCC por poço. Retorne a placa ao incubador de cultura celular por seis horas, descongelando o tampão do substrato de luciferase em banho-maria a 37 graus Celsius durante a última hora da incubação.Quando o tampão estiver pronto, adicione 75 microlitros de tampão de substrato de luciferase a todas as cavidades, exceto à cavidade de controle de fundo, e leia a placa em um luminômetro. A indução relativa da citotoxicidade celular dependente de anticorpos nas culturas de células transfectadas ou infectadas pode então ser calculada. Neste experimento, um anticorpo monoclonal específico para o estoque ativou e modificou robustamente células Jurkat expressando o receptor Fc gama murino quatro em aproximadamente 14 vezes, em comparação com anticorpos monoclonais específicos para a cabeça e anticorpos IgG de controle.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um experimento para avaliar a capacidade de anticorpos específicos de interesse em ativar a imunidade mediada pelo fragmento Fc.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método simples blot slot foi desenvolvido para a quantificação da gripe hemaglutinina e neuraminidase viral utilizando anticorpos universal, direccionado para suas seqüências mais conservadas identificados através de análises de bioinformática. Esta abordagem inovadora pode fornecer uma alternativa útil para determinação quantitativa de todos os hemaglutinina e neuraminidase viral.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

O vídeo demonstra um ensaio de inibição da hemaglutinação para detectar anticorpos séricos contra antígenos específicos. A confirmação da inibição da hemaglutinação no poço de teste e da hemaglutinação no poço de controle é obtida por meio de padrões visuais distintos. Este ensaio desempenha um papel crucial na avaliação da resposta imune, na eficácia da vacina e no estudo de infecções virais em virologia e imunologia.

O ensaio de inibição da hemaglutinação para detectar anticorpos séricos contra um antígeno alvo

Este vídeo demonstra um ensaio que mede a ativação mediada por anticorpos das funções efetoras das células T. A adição de um anticorpo monoclonal específico para hemaglutinina (HA) do vírus influenza a células de mamíferos transfectadas que expressam HA resulta na formação de complexos imunes com HA. Ao introduzir células T modificadas que expressam receptores Fc e um repórter de luciferase, as células T são ativadas pelos complexos anticorpo-HA, e essa ativação é detectada adicionando um...

Medindo a ativação de funções efetoras mediadas por Fc por anticorpos HA

Este vídeo demonstra um ensaio que mede os títulos de anticorpos inibidores da neuraminidase (NA) da influenza em uma amostra de soro. Uma amostra de soro contendo anticorpos contra NA é adicionada a uma placa de micropoços revestida com fetuína. Ao adicionar o vírus, os anticorpos impedem que o NA viral clive a fetuína e exponha sua porção galactose. Uma lectina conjugada com peroxidase é então adicionada, que se liga à galactose exposta. O título de anticorpos inibidores de NA é determinado...

Um ensaio para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase da influenza

Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Descrevemos o ensaio de lectina enzimática (ELLA) para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase (NA) da influenza em soros. O ensaio usa aglutinina de amendoim para quantificar os resíduos de galactose que se tornam acessíveis quando a NA remove o ácido siálico de placas de 96 poços revestidas com fetuína.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Os protocolos apresentados descrevem como realizar um ensaio de inibição de hemaglutinação para quantificar os anticorpos específicos de gripe de amostras de soro de destinatários de vacina contra gripe. O primeiro ensaio determina as concentrações de antígeno viral ideal por hemaglutinação. O segundo ensaio quantifica anticorpos específicos da gripe através da inibição da hemaglutinação.

Um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação otimizado para quantificar os anticorpos específicos de gripe

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Nós apresentamos um protocolo para usar um microarray da proteína construído imprimindo antígenos da gripe em corrediças nitrocelulose-revestidas para sonda simultaneamente o soro para isotipos múltiplos do anticorpo de encontro a mais de 250 antígenos das tensões diferentes do vírus, assim permitindo a medida da amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus.

Uso de um microarray do antígeno da gripe para medir a amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

Aprenda a avaliar funções efetoras mediadas por Fc de anticorpos contra hemaglutinina do vírus influenza usando células HEK293. Este método rápido de 24 horas auxilia pesquisas em imunologia e vacinologia.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

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