Um método geral para detectar a formação de Nitrosamide no metabolismo In Vitro de nitrosaminas por citocromo P450s

O objetivo geral desta metodologia é determinar se o citocromo P450s pode oxidar processivamente n nitrosaminas em n nitosamidas in vitro. Este método beneficia o campo da toxicologia, avaliando se as nitosaminas são metabolizadas diretamente em nitrosamidas. Como as nitrosamidas são relativamente estáveis no DNA alquilado, elas podem desempenhar um papel na carcinogênese.

A principal vantagem desta técnica é o uso de um espectrômetro de massa altamente sensível que fornece limites de detecção mais baixos do que os alcançados anteriormente para ensaios semelhantes de metabolismo de nitrosaminas in vitro. Para iniciar este procedimento, coloque um balão redondo de fundo de 25 ml, contendo uma barra de agitação magnética, em uma estufa. Seque por 16 horas a 140 graus Celsius.

Em seguida, transferir o balão para uma hotte e arrefecê-lo sob uma corrente de nitrogênio. Adicione 31,8 miligramas de norcotinina, cinco mililitros de anidrido acético e um mililitro de ácido acético ao frasco e comece a mexer. Transfira o balão para um banho de água gelada.

Adicione 33,3 miligramas de nitrito de sódio. Continue mexendo por 2,5 horas e, em seguida, despeje a reação em 18 mililitros de água gelada para extinguir a reação. Transferir imediatamente a solução para uma ampola de separação contendo 18 mililitros de DCM e extrair a solução aquosa.

Extraia a camada aquosa mais duas vezes, usando 9 mililitros de DCM de cada vez. Em seguida, seque os orgânicos agrupados com mais de 100 miligramas de sulfato de magnésio por dois minutos. Após a filtragem, use um evaporador rotativo para concentrar a solução a 30 graus Celsius para produzir um óleo amarelo bruto.

Purificar o composto bruto por cromatografia em coluna, conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, dissolva o composto puro em um mililitro de clorofórmio deuterado. Usando RMN, confirme a estrutura e a molaridade da solução conforme descrito no protocolo de texto.

Armazene esta solução no escuro a uma temperatura entre dois e oito graus Celsius até que seja necessário. Em seguida, confirme a massa original precisa e determine as massas de íons do produto da solução NNC pura por infusão direta em um espectrômetro de massa de alta resolução, conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, remova os reagentes necessários de um freezer de 80 graus Celsius e descongele no gelo.

Um descongelado, use um tampão de reação de força 0,5 para diluir os baculossomos no sistema de regeneração NADPH 1-10 e 1-50, respectivamente, em um tubo de um mililitro. Em seguida, adicione três microlitros da solução estoque de NADP a um tubo de um mililitro contendo 97 microlitros de um tampão de reação de força de 0,5. Para cada incubação, prepare um tubo de um mililitro adicionando 40 microlitros de uma solução NNN de quatro micromolares feita com tampão de reação.

Adicione 50 microlitros de solução enzimática contendo cinco picomoles de P450 2A6 a cada tubo. Pré-incubar em banho-maria a 37 graus por dois minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros de solução diluída de NADP+ a cada tubo.

Incube a 37 graus Celsius por um a 30 minutos. Depois disso, adicione primeiro 10 microlitros de sulfato de zinco normal 3.0 e, em seguida, adicione 10 microlitros de hidróxido de bário normal 3.0 para extinguir a reação. Vortex a solução para formar um precipitado branco.

Em seguida, centrifugue a oito mil Gs por quatro minutos. Colete imediatamente o sobrenadante e analise dois microlitros por cromatografia líquida em alta resolução de ionização por nanoeletrospray positivo Neste estudo, a norcotinina é nitrosada a NNC de forma limpa e de alto rendimento, produzindo um padrão para uso no experimento in vitro.

O sucesso da reação é verificado por análise espectroscópica, incluindo espectrometria de massa em tandem de alta resolução, que confirmou que a massa do pai está dentro de cinco partes por milhão do valor teórico. A fragmentação da espectrometria de massa em tandem do NNC é então usada para determinar as massas de íons do produto mais abundantes. Como pode ser visto, os dois íons de produto mais abundantes são 134 e 162, com detecção de massa precisa com cinco casas decimais.

O NNC sintetizado é então utilizado como padrão para o ensaio de metabolismo P450 in vitro. Nas condições usadas, o NNC sintético elui em aproximadamente 17,5 minutos, com picos bem resolvidos nos canais iônicos do pai e do produto. De acordo com o controle positivo, a formação de NNC é observada nas incubações de um minuto, cinco minutos e 10 minutos.

Se realizada corretamente, a análise espectroscópica da síntese de nitrosamida pode ser feita em aproximadamente seis horas. Da mesma forma, o ensaio in vitro com múltiplas incubações não deve levar mais de oito horas. As implicações dessa técnica se estendem à avaliação de risco para cânceres relacionados ao tabaco, porque a medição de biomarcadores relacionados à nitrosamida pode ser informativa sobre a ativação individual da nitrosamina.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de processar incubações enzimáticas rapidamente. As nitrosamidas hidrolisam nessas condições e não devem ficar muito tempo antes da análise de espectrometria de massa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar os padrões de nitrosamida e avaliar se eles são formados in vitro pelo sistema adequado de nitrosamina citocromo P450.

Não se esqueça de que trabalhar com NNN, NNC ou agentes cancerígenos relacionados pode ser perigoso. Esses compostos devem sempre ser manuseados em um exaustor usando jaleco, óculos de segurança e luvas. Além disso, todos os resíduos cancerígenos devem ser devidamente armazenados e rotulados.