Biofilme oral amostragem para análise de Microbiome em crianças saudáveis
December 31st, 2017
Mudanças na microbiome oral ao longo da infância são motivo de crescente interesse. Comparação de diferentes microbiome estudos revela uma falta de protocolos padronizados de amostragem. Espaço limitado faz amostragem do som sulco subgengival de crianças desafiadoras. Papel do ponto de amostragem é apresentada aqui em detalhe como o método de escolha para esta área.
O objetivo geral deste procedimento é apresentar um método padronizado para amostragem de biofilme oral para análise de microbioma em crianças saudáveis. Isso é feito primeiro preparando e esterilizando instrumentos e materiais. Em seguida, a criança é preparada para amostragem de biofilme.
Em seguida, a amostragem de biofilme é realizada em três locais, o sulco subgengival, a mucosa da prega vestibular e a saliva. Finalmente, as amostras são armazenadas sistematicamente. Em última análise, as análises do microbioma oral serão realizadas para responder a questões clínicas e científicas.
Olá, sou Elizabeth e sou ortodontista. Minha pesquisa se concentra nas alterações do microbioma oral que acompanham o tratamento ortodôntico. A amostragem de biofilme oral pode ser complicada.
O espaço no sulco subgengival é limitado, especialmente em crianças. Comparando nossos dados de microbioma com pesquisas mundiais, encontramos uma falta de protocolos de amostragem padronizados. Com este vídeo, damos o primeiro passo para preencher essa lacuna.
Pontas de papel calibradas e estéreis que geralmente são usadas na terapia endodôntica são cortadas na primeira marca do anel para padronizar seu comprimento. Após o corte, as pontas de papel devem ser irradiadas por UV para evitar a contaminação por DNA e RNA. Os tubos para armazenamento serão autoclavados e irradiados com UV também.
Antes da amostragem do biofilme, os dentes precisam ser limpos completamente, começando com a aplicação de manteiga de cacau. Em seguida, os dentes são manchados com a revelação da placa. Após a coloração, a boca é enxaguada com água.
Os dentes são escovados adequadamente com uma escova de dentes elétrica e água. Nenhum creme dental é aplicado, pois isso alteraria o biofilme oral. Um afastador de bochecha e língua é usado para manter a boca aberta e seca.
A colocação do afastador requer mãos habilidosas e firmes, de modo a minimizar o desconforto da criança e manter o procedimento o mais curto possível. Pinças dentárias estéreis são usadas e o local de amostragem permanece inalterado durante todo o procedimento. Os dentes são limpos e secos com cotonetes estéreis para evitar a absorção de líquido supragengival durante a amostragem de pontos de papel.
Diferentes métodos podem ser usados para amostragem de biofilme na cavidade oral. Devido ao espaço limitado no sulco subgengival das crianças, a amostragem pontual em papel é o método de escolha. As pontas do papel são inseridas tangencialmente até um comprimento definido de quatro milímetros por 20 segundos.
Cuidados especiais devem ser tomados para não traumatizar o epitélio juncional. As pontas de papel são então cortadas na terceira marca em um comprimento padronizado de quatro milímetros. A ponta de papel também pode ser inserida simultaneamente no mesmo local ou as amostras podem ser agrupadas de vários locais.
O aparelho de campo seco é removido para amostragem de mucosa e saliva. As pontas de papel podem ser aplicadas da mesma forma para amostrar o biofilme da mucosa na prega vestibular. O biofilme salivar pode ser coletado cuspindo saliva não estimulada.
Dependendo do desenho do estudo, os pontos de papel serão armazenados como amostras únicas, agrupadas ou paralelas. Um sistema de armazenamento codificado por cores facilitará ainda mais o gerenciamento de amostras. Finalmente, as amostras são armazenadas para análises de microbioma a menos 80 graus Celsius.
Vários kits comerciais foram desenvolvidos para a identificação rápida e precisa de bactérias periodontopatogênicas. Os pontos de papel são enviados para laboratórios especializados. A extração, preparação e análise de DNA são realizadas em três horas.
O DNA também pode ser usado em pesquisas para estudos de microbioma. O sequenciamento de próxima geração, por exemplo, resulta em conjuntos de dados completos de microbioma. A abundância relativa geral de certas espécies bacterianas pode ser analisada, assim como as mudanças na microbiota devido às mudanças nas condições.
Este gráfico de barras e mapa de calor exibem a abundância relativa na microbiota subgengival no filo e no nível da ordem. Diferenças na composição microbiana ao longo do tempo, comparações entre ou dentro de indivíduos ou diferentes métodos de amostragem são apresentados em histogramas. Esta figura mostra os resultados de uma comparação de dois métodos de amostragem, Modo A e Modo B, em diferentes níveis taxonômicos.
A análise estatística dos valores criados com o sequenciamento de próxima geração pode ser apresentada em tabelas. Diferentes pontos de tempo, conforme mostrado nesta tabela, podem ser analisados em diferentes níveis taxonômicos. Os valores de p são calculados para provar achados significativos.
Finalmente, o microbioma oral no nível da OTU pode ser visualizado com análises de coordenadas principais. Esta figura mostra diferenças intra e interindividuais em cinco sujeitos. Um agrupamento de certos grupos pode mostrar mudanças na composição do microbioma.
Esta animação 3D mostra os resultados de um estudo de caso-controle. Pontos vermelhos são os casos. Os pontos azuis são os controles.
Um agrupamento claro dos casos após a intervenção ortodôntica em T3, os grandes pontos vermelhos, visualizam uma mudança no microbioma. Os pontos azuis que mostram o grupo de controle são distribuídos uniformemente. Este método pode fornecer informações sobre a amostragem clínica de biofilme no sulco subgengival de crianças saudáveis.
Escolhemos os pontos de papel como os mais adequados para este compartimento vulnerável. Neste vídeo, aplicamos o método apenas à condição permanente. Também pode ser aplicado a condições mistas ou maduras.
Com alguns dos pacientes, você também pode amostrar locais com doenças periodontais de acordo com o mesmo protocolo. Olá, meu nome é Barbara e sou microbiologista molecular. Quando analiso biofilme no laboratório, preciso contar com uma biblioteca de amostras clínicas imparciais.
Cada etapa no campo interdisciplinar da pesquisa microbiana oral deve ser totalmente padronizada. E há mais um fato importante. Você só pode ter sucesso em uma equipe.
Portanto, sempre trate bem seus colegas.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método padronizado para amostragem de biofilme oral em crianças saudáveis, focando nos desafios da amostragem no espaço limitado do sulco subgengival. O método visa melhorar a confiabilidade das análises do microbioma abordando a falta de protocolos padronizados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa em microbioma oral
- Odontopediatria
- Técnicas de amostragem microbiana
Fundamentos
- Mudanças no microbioma oral durante a infância são cada vez mais estudadas.
- Estudos atuais de microbioma carecem de protocolos padronizados de amostragem.
- A amostragem no sulco subgengival de crianças apresenta desafios únicos.
- A amostragem com ponto de papel é proposta como um método adequado para esta área.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para amostragem de biofilme oral em crianças.
- Padronizar procedimentos para análise do microbioma.
- Facilitar comparações entre dados de microbioma em diferentes estudos.
Métodos Utilizados
- Preparação e esterilização de instrumentos e materiais.
- Limpeza e preparação dos dentes da criança antes da amostragem.
- Amostragem do sulco subgengival, mucosa e saliva usando pontos de papel.
- Armazenamento sistemático das amostras para análise do microbioma.
Principais Resultados
- A amostragem padronizada com ponto de papel efetivamente coleta amostras de biofilme.
- As amostras podem ser agrupadas ou armazenadas individualmente para análise.
- O sequenciamento de próxima geração fornece conjuntos de dados detalhados do microbioma.
- Análises estatísticas revelam diferenças significativas na composição microbiana.
Conclusões
- O método proposto melhora a confiabilidade dos estudos de microbioma oral em crianças.
- A padronização é crucial para pesquisas interdisciplinares em microbiologia oral.
- A colaboração entre pesquisadores é essencial para resultados bem-sucedidos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Standardized oral biofilm sampling in children addresses a critical gap in pediatric microbiome research, enabling reliable data generation for target validation in oral health interventions. The method supports mechanistic de-risking by providing reproducible biological samples that reflect true microbial composition, reducing variability in preclinical assessments. This enhances predictive confidence in early discovery stages where oral microbiota shifts may indicate disease susceptibility or treatment response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oral microbiome composition as a biomarker for cariogenic and periopathogenic mechanisms in children.
- Operational Value: Provides a standardized sampling protocol that reduces technical variability in microbiome data generation.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing regarding microbial shifts during childhood development and intervention periods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream NGS and bioinformatic analysis, ensuring assay readiness.
- Operational Value: Facilitates sample pooling or parallel processing, improving throughput and standardization across study sites.
- Scientific Value: Generates quantitative microbial abundance data suitable for assay optimization and screening campaign design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant samples from healthy pediatric oral sites, establishing baseline for comparative disease modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of microbiome shifts, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into host-microbe interactions that inform target selection and validation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying standardized biological inputs for microbiome profiling, which informs target identification and validation efforts prior to lead generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbial community shifts linked to oral health status and developmental stages.
- Screening: Delivers reproducible samples enabling consistent NGS-based microbial profiling for comparative compound or intervention evaluation.
- Analytics: Generates relative abundance and diversity metrics that allow cross-condition comparison and statistical assessment of microbial changes.
- Translational Research: Connects discovery-phase microbiome data to preclinical continuity by establishing healthy baselines for disease model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sampling protocol applicable across pediatric oral health studies, reducing protocol redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-associated target validation by minimizing sampling-induced noise.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization across sites and time points, critical for multi-center studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision reliability in oral health programs by reducing false positives from methodological artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oral microbiome targets based on robust, comparable longitudinal data.
Implementation Considerations
- Requires training in pediatric dental techniques and sterile handling to ensure sample integrity and child cooperation.
- Dependent on access to UV irradiation, autoclaving, and cold storage (-80°C) infrastructure for contamination control and sample preservation.
- Necessitates cross-disciplinary coordination between dental clinicians and molecular biologists for standardized execution.
- Requires adaptation considerations when applying to mixed dentition or periodontally diseased sites, as noted in the protocol.
- Limited by the physical constraints of subgingival access in very young children, which may affect sampling consistency.
