Name: Biofilme oral amostragem para análise de Microbiome em crianças saudáveis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a coletar biofilme oral padronizado em crianças saudáveis usando pontas de papel estéreis. Este método melhora a confiabilidade das análises de microbioma subgengival para pesquisa odontológica pediátrica.

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Os autores são gratos a Joachim Theussl (centro de pesquisa médica, universidade médica de Graz) para a excelente assistência técnica na produção da vídeo e a Monica Farrell (gestão de pesquisa, universidade médica de Graz) como talento de voz.

Protocolo e tiro vídeo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da universidade médica de Graz (Votum 27-126ex14/15). Consentimento por escrito para a publicação deste vídeo foi obtido por seu pai e o filho.
1. os instrumentos e materiais
<ol>
	<li>Corte calibrado (ISO 015/02) e pontos de papel estéril, geralmente utilizados na terapia endodôntica, na primeira marca de anel a fim de padronizar o seu comprimento (Figura 1).</li>
	<li>Aplicar a irradiação de luz UV a 260 nm por 30 min para evitar a contaminação de DNA e RNA dos pontos de papel (Figura 2).</li>
	<li>Autoclave os tubos para o armazenamento a 120 ° C e 1,2 bar por 20 min e UV-irradiar-lhes também ou empregar ready-to-use gama irradiados tubos.</li>
</ol>
2. preparação dos temas
Nota: Escrito consentimento informado foi obtido o filho e seu pai antes da inscrição.
<ol>
	<li>Aplique manteiga de cacau para os lábios.</li>
	<li>Montar a bochecha e língua afastador para completo de ambos os arcos dentários.</li>
	<li>Mancha a placa dentária com divulgação de placa.</li>
	<li>Retire o aparelho do campo seco.</li>
	<li>Enxague a boca com água até que a água é incolor.</li>
	<li>Escove bem os dentes com uma escova de dente elétrica na angulação de 45 °. Aplica água só, mas sem pasta de dente, como isto alteraria o biofilme oral.</li>
	<li>Monte o aparelho de campo seco novamente, incluindo a guarda de língua para manter a boca aberta e seca.</li>
	<li>Limpos e secos os dentes do índice cotonetes estéreis para evitar a absorção de fluido supragengival durante papel ponto de amostragem.</li>
</ol>
3. biofilme amostragem
<ol>
	<li>Ponto de amostragem do sulco subgengival de papel
	<ol>
		<li>Compreender os pontos de papel com uma pinça estéril de dental.</li>
		<li>Inserir pontos de papel tangencialmente até para um comprimento definido de 4 mm. Tome especial cuidado para não traumatizar o epitélio juncional (Figura 3).</li>
		<li>Remover pontos de papel após 20 s.</li>
		<li>Acumule pontos de papel diretamente nos tubos preparados: Coloque a ponta de papel ponto diretamente em um frasco estéril e livre de DNA e cortá-lo na terceira marca a um comprimento padronizado de 4 mm (Figura 4).</li>
		<li>Se indicado pelos protocolos de estudo, inseri dois pontos de papel paralelos e simultaneamente no mesmo local (Figura 5A).</li>
		<li>Alternativamente, recolher pontos de papel de vários sites, se o protocolo de estudo requer "amostras em pool" (Figura 5B).</li>
		<li>Retirar o aparelho do campo seco para mucosas e recolha de amostras de saliva.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Papel da mucosa ponto de amostragem
	<ol>
		<li>Aplicam-se pontos de papel para a prega vestibular da face superior (Figura 6).</li>
		<li>Feche a bochecha e massageá-lo brevemente.</li>
		<li>Abra a face e remover os pontos de papel após 20 s.</li>
		<li>Cortar os pontos do papel na terceira marca e colocá-los em um tubo estéril como indicado para amostragem subgengival.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Recolha de amostras de saliva
	<ol>
		<li>Deixe a criança cuspir saliva unstimulated dentro de um vaso coleção esterilizado (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. transferência e armazenamento
<ol>
	<li>Acumule pontos de papel como amostras simples, em pool ou paralelas, dependendo do projeto de estudo (Figura 8).</li>
	<li>Aplica um sistema de armazenamento codificados por cores para facilitar ainda mais a gestão de amostra (Figura 9).</li>
	<li>Finalmente, armazene as amostras em −80 ° C pendente microbiome análise.</li>
</ol>

<ol><li>Paster, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Diversity+in+Human+Subgingival+Plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque.</a> J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).</li>
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</ol>

Os autores relatam que não há conflitos de interesse relacionados com esta produção científica de vídeo.

As bactérias são encontradas em todos os locais dentro da cavidade oral24,25,26. Muitos estudos têm-se centrado sobre o uso de saliva como um meio de amostragem para mapear a colonização oral como isso facilmente pode ser saboreado através de cuspindo27,28,29,30,31, 32. No entanto, biofilme salivar não reflete composição do biofilme subgengival. Assim, o uso de outros métodos de amostragem é crucial para a criação de toda a imagem e evocará novas discussões na pesquisa odontológica. Vários artigos de comparam o uso de Curetas e pontos de papel para amostragem subgengival de indivíduos doentes remover8,33,34. Ainda nenhum grupo de pesquisa é conhecido por centraram-se sobre a aplicação de dispositivos de amostragem padronizada para diferentes faixas etárias, especialmente para crianças,19.
Neste vídeo, é apresentada o biofilme oral amostragem de três habitats orais em crianças saudáveis.
Modificações e solução de problemas:
O objetivo do manuscrito enfoca o protocolo clínico para recolha de amostras de biofilme subgengival de crianças saudáveis. O método de escolha refere-se ao som sulci subgengival onde o espaço limitado torna especialmente desafiador de amostragem. Neste vídeo, o método foi aplicado a dentição permanente precoce. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura e para crianças e/ou adultos. Nosso método de amostragem permite modificações como única ou em pool de amostras. Este último pode tornar-se um fator crucial para análises moleculares devido à pequena quantidade de DNA colecionável do sulco subgengival saudável. A escolha dos dentes índice pode ser modificada sob demanda; em particular, outro dente pode ser incluídos na amostra como uma alternativa quando o epitélio é traumatizado e sangrando, tornando o ponto de papel inutilizável. Amostragem paralela usando dois pontos de papel simultaneamente em um local processa amostra repetições em uma única etapa, além de encurtar o tempo de cadeira para crianças.
Com pequenas modificações podem ser degustadas doentes periodontais. Aqui pontos papel precisará ser inserido em todo o comprimento do bolso, que pode atingir até 10 mm. O comprimento e conus dos pontos de papel, bem como a profundidade de inserção devem ser adaptados ao habitat intra-oral de interesse, mas sempre deve ser padronizado pelo material e dimensões. Podem também ser recolhidas amostras de mucosa usando pontos de papel. Protocolos idênticos permitem comparações de diferentes habitats orais e vários materiais dentários. Preparação do paciente e armazenamento da amostra podem ser realizadas conforme descrito neste vídeo. Para pesquisa de metatranscriptome, RNA pode ser saboreado com o mesmo método. Assim, após a amostragem, os pontos de papel devem ser inseridos diretamente na solução de estabilização de RNA.
Limitações da técnica:
Independentemente de modificações, o método de amostragem clínicos que descrevemos é limitado ao som sulco subgengival. Outros locais de amostragem, quanto remover doentes bolsos de exemplo, não eram parte do nosso projeto de estudo. Como amostragem de toda a profundidade de tais bolsas é necessário, pontos de papel podem não ser grandes o suficiente para coletar amostras suficientemente. Se o objetivo experimental é comparar os dados amostrados de som sulci subgengival e bolsos remover doentes, é importante estar ciente de viés inerente associado com métodos de amostragem clínicos diferentes. Portanto, não é aconselhável comparar esses dados.
Uma limitação do método aqui apresentado é amostragem sem o uso subsequente de propidium monoazídico. Adicionar este agente diretamente após a amostragem permite a análise específica de apenas as células vivas no biofilme analisados. O método de amostragem descrito aqui reflete o número de células vivas e mortas. Para a pesquisa da periodontite severa, pontos de papel provavelmente precisará ser substituído por curetas, como formação de biofilme em bolsos é forte. Ponto de papel amostragem pode não refletir a todo o espectro microbiano nestes casos, como a sua superfície pode ser saturado muito rapidamente.
Importância no que diz respeito a métodos existentes:
O manuscrito proposto é o primeiro de seu tipo para padronizar subgengival amostragem no sulco saudável com pontos de papel. Outros relatórios referiram-se ao uso de curetas metal35,36 ou papel pontos 37,38,39, mas não descrever os processos que ocorrem antes da amostragem, tais como o controle de placa bacteriana, limpeza do dente, dente isolamento e secagem, bem como os processos que resultam de especificações inadequadas nas linhas de técnica e tempo de amostragem.
Em dois artigos anteriores, mostramos que o uso de pontos de papel é um método reprodutível para recolha de amostras de biofilme subgengival em crianças22,40. Devido ao seu design, curetas são demasiado grandes para o sulco raso com espaço limitado e muito afiada para o epitélio juncional concurso. É crucial acessar o sulco subgengival sem traumatizar o epitélio. Desta forma, evita-se preconceito decorrentes da hemorragia. Assim, o uso dos pontos de papel fino e macio é preferencial para esta área. Pontos de papel são funcionais para monitorar as alterações na composição do biofilme durante o tratamento ortodôntico21,41. Eles são magros e flexível o suficiente para caber entre os elementos dos aparelhos ortodônticos fixos. Esta é uma grande vantagem para outros métodos de amostragem como curetas. Atraumatic amostragem é simplificada e amostragem de pequenas quantidades de DNA é possível.
Aplicações futuras:
Neste vídeo demonstramos o método na dentição permanente, precoce e não-doentes. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura. Com algumas adaptações é possível remover doentes sites como dentes ou implantes e outros nichos devido a materiais dentários da amostra, seguindo o mesmo protocolo. Pesquisa de cárie pode beneficiar deste protocolo padronizado, em particulares estudos sobre cárie de raiz. A palestra mais importante de nossa vídeo de amostragem é a padronização dos protocolos para tornar os dados comparáveis, não importa o que e como as amostras são medidas.Futuras demonstrações de vídeo poderiam melhorar o campo de colheita de amostras clínicas em geral.
Biofilme oral obtido como mostrado no vídeo é usado em clínicas e para investigações científicas. Esta abordagem na vivo representa uma boa adição a em vitro técnicas moleculares como a hibridação do in situ de fluorescência e microscopia15de exploração do laser confocal. NGS métodos, como mostrado aqui, o pyrosequencing aplicada para o biofilme coletado, permitem a análise da microbiota completa. Calcular a abundância relativa de certas espécies bacterianas pode ser usado para tratamentos de suporte ou para comparar diferentes pacientes ou tratamentos diferentes. Juntamente com um sequenciamento padronizado protocolo e sequência de análise de fluxo de trabalho que temos anteriormente descrevem40, este método de amostragem permite a análise de sequência até ao nível de gênero. Mais "meta"-estudos, tais como metatranscriptomic ou metabolómica estudos são possíveis baseiam no protocolo de amostragem apresentado neste vídeo.
Passos críticos:
Evitar a contaminação é uma etapa crítica: instrumentos esterilizados têm de ser aplicadas em um ambiente não-estéril na vivo . A transferência da boca para o banco tem de ser realizada rapidamente e firmemente por um examinador experiente para manter o tempo de cadeira para os participantes do estudo tão curtos quanto possível. O passo mais crítico no protocolo é a inserção atraumática do ponto para o sulco subgengival de papel. Ruptura do epitélio juncional e sangramento absolutamente tem que ser evitado. Mais tem que ser tomado para não contaminar pontos de papel e armazenamento frascos com exógeno DNA ou RNA. O armazenamento em seguida também é uma etapa crítica. Precisam de amostras a serem congelados directamente, na melhor das hipóteses, −80 ° C. Isso evita mudanças na amostragem de post composição bacteriana, que iria falsificar resultados de sequenciamento.

Biofilme oral humana é composto por uma ampla comunidade que consiste principalmente de comensais e microorganismos benéficos1,2,3. Espécies encontradas aqui colonizam todos os nichos que a cavidade oral oferece4,5,6. Composição do biofilme nestes nichos varia tão amplamente como os habitats. Saliva, por exemplo, exibe diferentes perfis bacterianas do que amostras de placa. Nas amostras de placa de adultos saudáveis, a abundância relativa de Actinobacteria é mais 20%, enquanto menos de 7% é encontrado na saliva. Bacteroidetes e Firmicutes em contraste aparecem em números muito superiores em saliva7. Assim, é importante a amostra em locais diferentes na boca a fim de obter toda a imagem. Além disso, vários fatores como diferenças étnicas e geográficas, idade, sexo e muitos outros fatores dificultam a identificar as regras gerais de biofilme desenvolvimento e doença início8,9. Por muitos anos, a investigação de periopathogenic e cariogênica biofilme tem sido uma preocupação central8,10,11,12,13.
Nos últimos anos, a pesquisa em indivíduos saudáveis ganhou importância não só para uma compreensão mais ampla da doença, mas também para a implementação de medidas preventivas14. Novas tecnologias e análises moleculares mais elucidar a formação de biofilme oral e função15,16e permitem a criação de perfil completo da diversidade microbiana17,18. Isso é esperado para também levar a uma nova compreensão das mudanças microbianas durante a terapia ortodôntica19. Um impacto sobre o desenvolvimento de biomateriais ortodônticos é previsível. A perspectiva avançada irá lançar nova luz sobre complicações da terapia ortodôntica associada com biofilme, tais como a desmineralização do esmalte e doenças periodontais12,20,21. Para permitir comparações de dados em todo o mundo, é crucial padronizar todas as etapas de geração de dados. Pequenas alterações em procedimentos laboratoriais podem fortemente influenciar os resultados. Além disso, o uso de diferentes plataformas computacionais em processamento de dados pode levar a conjuntos de dados não comparáveis. Por último, a escolha de testes estatísticos e correções tem uma influência sobre os resultados. No entanto, o viés de amostragem já pode ocorrer muito antes de qualquer trabalho de laboratório ou bio-computação começa. Métodos de amostragem não-padronizados originar um estudo inerentemente tendencioso. Tendo em conta a baixa para níveis moderados de padronização nos estudos relevantes, pouca evidência existe na relação entre Ortodontia e microbiomes19. Portanto, o desenvolvimento de métodos padronizados facilitariam qualificado de comparação de dados no campo.
Este artigo apresenta o biofilme oral padronizada procedimentos de amostragem. O protocolo destina-se a contribuir para gerar globalmente comparáveis coleções de dados da sequência microbiana. É apresentado um protocolo passo a passo para amostragem de biofilme oral em crianças saudáveis. Como o método de escolha, pontos de papel são atraumatically inserido no som sulco subgengival. Para facilitar as comparações de habitat, mucosa da bochecha é amostrado de acordo com o mesmo protocolo. Este artigo demonstra adicionalmente amostragem paralela e em pool. Além disso, a colheita de amostras de saliva é mostrada. Um simples código de cores transporte e sistema de armazenamento também é apresentado, facilitando o gerenciamento de amostra para processamento adicional. A escolha das operações a jusante sobre bioinformática, análises de metagenomic e meio de armazenamento depende da clínicas questões levantadas pelos diferentes campos de pesquisa oral. Neste manuscrito, amostragem de DNA para NGS foi escolhida como um exemplo de uma possível aplicação para pesquisa ortodôntica.

<table><tbody><tr><td>Pontas de papel Cônicas .02, esterilizada</td><td>VDW Dental</td><td>550 029 015</td><td>http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2</td></tr><tr><td>GC Manteiga de Cacau, Tubo de 10 g</td><td>GC EUROPE N.V.</td><td>000387</td><td>http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22</td></tr><tr><td>Rondells azul</td><td>DIRECTA AB</td><td>Rondell Tablets</td><td>http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767</td></tr><tr><td>Great Lakes Nola Dry Field System</td><td>Great Lakes Ortho</td><td>300-401</td><td>http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626</td></tr><tr><td>escova de dentes</td><td>Oral-B</td><td></td><td>http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro</td></tr><tr><td>micro-Ident plus11</td><td>Hain Lifescience GmbH</td><td>23312</td><td>http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html</td></tr><tr><td>ParoCheck</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>460020</td><td>https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/</td></tr> <tr><td>Carpegen Perio Diagnostik</td><td>Carpegen GmbH</td><td></td><td>http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html</td></tr><tr><td>tubos Reaktionsgef&auml; &szlig; e 1,5 ml</td><td>de Lactan</td><td>CH77.1&nbsp; a CH81.1</td><td>www.lactan</td></tr><tr><td>cotonetes</td><td>Henry Schein</td><td>9003182</td><td>www.henryschein.at</td></tr></tbody></table>

biofilme oral amostragem para análise de microbiome em crianças saudáveis

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Biofilme oral e sua análise molecular proporcionam uma base para investigar várias pesquisa odontológica e questões clínicas. Conhecimento da composição do biofilme leva a uma melhor compreensão dos mecanismos cariogênica e periopathogenic. Microbianas mudanças que ocorrem na cavidade oral durante a infância são de interesse por diversas razões. A evolução da criança microbiota oral e mudanças na sua composição precisa ser analisado ainda mais para compreender e possivelmente prevenir o aparecimento da doença. Ao mesmo tempo, é necessário conhecimento avançado de composição natural do biofilme oral. Primeiras fases da dentição permanente cáries com gengivas saudáveis fornecem um habitat subgengival amplamente afetado que pode servir como uma base em situ para estudar características de saúde bucal e doença. Análise de biofilme oral de crianças durante as diferentes fases da vida, portanto, é um tema importante no campo. Métodos de análise molecular moderna podem fornecer informações abrangentes sobre a diversidade bacteriana de tais biofilmes. Para permitir a comparação de dados da microbiota, é importante a padronização de cada etapa do procedimento para geração de dados moleculares. Este procedimento abrange clínico de amostragem, a próxima geração de sequenciamento (NGS), bioinformatic do processamento de dados, a interpretação taxonômica. Um dos fatores mais críticos aqui é amostragem de biofilme. Amostragem em crianças é ainda mais desafiador em particular devido ao espaço limitado em áreas subgengivais. Focalizamos, portanto, o uso de pontos de papel para amostragem subgengival. Este artigo fornece um protocolo detalhado para amostragem de biofilme oral do sulco subgengival, mucosa e saliva em crianças.

Na presente publicação, amostragem de DNA para NGS é demonstrada como um exemplo de uma possível aplicação para pesquisa ortodôntica. ADN bacteriano é extraído diretamente de amostras de papel de ponto. Este DNA pode ser usado em estudos da composição microbiana para clínicas ou perguntas de investigação (como resumidos na Figura 10).
Métodos de análise molecular moderna como o método NGS 454-pyrosequencing dar uma visão geral da microbiota completa de uma amostra. O DNA de milhares de bactérias é identificado simultaneamente em diferentes níveis filogenéticos sobre o 16s diferenças de sequência de RNA ribossomal. Plataformas de Bioinformatic precisam ser gerado como um meio de estruturação em clusters, a informação obtida de grandes conjuntos de dados. Análise estatística pode então ser aplicada a microbiota datasets.
A global relativa abundância de determinadas espécies bacterianas pode ser analisada como podem turnos na microbiota devido a mudanças nas condições de habitat. Gráficos de barras (Figura 11) e heatmaps (Figura 12) exibir a composição bacteriana subgengival no nível de filo ou no nível de ordem. Vários indivíduos e tratamentos podem ser comparados por estatística descritiva e inferencial. Figura 13 apresenta uma comparação histograma dos dois modos de ponto papel subgengival de amostragem em diferentes níveis taxonômicos. A tabela 1 mostra a mudança na composição do biofilme durante um estudo em vitro comparando dois pontos de tempo (T1 e T3). Mudanças estatisticamente significativas foram calculadas com o teste de Wilcoxon rank-assinado e correção de Bonferroni seguir a partir dos dados de 454-pyrosequencing.
Finalmente, análise de coordenadas principais (PCoA) permite comparação 3D direta no nível de unidade taxonômica operacional (OTU) conforme identificado em amostras diferentes. As parcelas de PCoA na Figura 14 exibem diferenças intra e inter individual da microbiome subgengival em uma série de casos de cinco filhos. Figura 15 mostra os resultados de um estudo de caso-controle ortodôntico: rosa para pontos vermelhos são os casos, a luz à obscuridade pontos azuis são os controles, todos incluídos na amostra repetidamente durante um período de quatro meses. Um cluster clara dos casos após a intervenção ortodôntica (pontos vermelhos) representa uma mudança na microbiome. Pontos azuis, representando o grupo de controle, são distribuídos uniformemente.
<img alt="Processo de separação por cromatografia em camada fina; pinças que manuseiam a placa de TLC; análise de compostos orgânicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1 : Preparar pontos de papel de comprimento padronizado. Pontos de papel calibrado estéril são cortados na primeira marca de anel para padronizar o seu comprimento. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Placa de Petri sob capela de fluxo laminar esterilizada para análise microbiológica e controle de contaminação." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2 : Pontos de papel livre de DNA e esterilize. Pontos de papel padronizados são esterilizados e UV irradiados em uma bancada limpa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Demonstração da técnica do fio dental, close-up nos dentes e gengivas, método da higiene oral." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3 : Inserção de papel subgengival ponto. Pontos de papel calibrado estéril são inseridos tangencialmente ao sulco subgengival até a marca do anel de 4 mm por 20 s.
<img alt="Configuração de amostragem do tubo de microcentrífuga; Técnica de laboratório mostrando manuseio preciso com pinças." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4 : Corte no papel ponto no tubo. Diretamente após a amostragem, pontos de papel são cortados na terceira marca de anel (4 mm) em uma estéril e livre de DNA 1,5 mL frasco. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Técnica de colocação de braquetes ortodônticos; A ferramenta odontológica ajusta o fio, visão intraoral, procedimento odontológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5 : Amostragem em pool e paralela. Dois pontos de papel são inseridos simultaneamente ao sulco subgengival de um dente (A) ou vários pontos de papel para os sulcos subgengivais de vários dentes (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Técnica de acupuntura oral mostrada em configuração clínica; vista de perto das agulhas de acupuntura em uso." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6 : Amostragem mucosal. Pontos de papel calibrado estéril são colocados em mucosa da prega vestibular. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Medição de medicamentos orais com um copo de dosagem, ilustrando a administração precisa da dosagem líquida." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7 : Coleta de saliva. Unstimulated saliva é cuspir em um béquer estéril. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de métodos de amostragem de dentes; coleta de frascos simples, agrupados e paralelos para análise." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8 : Plano de amostragem. As amostras podem ser coletadas como single (lado esquerdo, um dente de cada), pool (várias de todos os matizes em um frasco), ou amostras de paralelo (listras azuis, dois pontos de papel em um dente). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Organização de ponteiras de pipeta coloridas para experimentos de laboratório, categorizadas para fácil acesso e uso." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig9.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> 
Figura 9 : Color-coded armazenamento. Um código de cor referente para folhas e frascos facilita a mais, amostra de manipulação.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig9large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Amostragem clínica para extração de DNA e diagrama de sequenciamento; inclui métodos como 454-pirosequenciamento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig10.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 10"> 
Figura 10 : Análise do biofilme subgengival. Apresentação esquemática da amostragem de biofilme clínico (A), extração de DNA (B) e diferentes tecnologias NGS (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise da composição bacteriana, gráfico de barras da distribuição dos táxons entre as amostras; inclui Firmicutes, Proteobacteria." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig11.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 11"> 
Figura 11 : Gráfico de barras. Mostrando a abundância relativa de bactérias no nível de filo analisados usando 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig11large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de mapa de calor de diversidade de microbioma; análise de táxons bacterianos por intensidade de cor." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig12.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 12"> 
Figura 12 : Heatmap. Mostrando abundâncias relativas das ordens bacterianas analisadas usando 454-pyrosequencing. Vermelho escuro representa uma alta abundância relativa (&gt; 10%). Azul escuro representa uma muito baixa para não abundância relativa da respectiva ordem bacteriana. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig12large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise da diversidade microbiana; distribuição de filo, classe, família, gênero; gráficos de barras comparativos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig13.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 13"> 
Figura 13 : Histograma. Comparação de dois modos de papel ponto de amostragem (modos A e B) em diferentes níveis taxonômicos. Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig13large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráficos de Análise de Componentes Principais (PCA), PCA P1 vs P2 vs P3, visualização de dados, análise de variação." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig14.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 14"> 
Figura 14 : 2D enredo PCoA. Uma série de casos (n = 5) mostrando diferenças individuais intra e inter individuais, como resultado de dois métodos de amostragem subgengival (1 cor é 1 tema). Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig14large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de dispersão 3D da Análise de Componentes Principais (PCA), destacando a distribuição de dados em PC1, PC2, PC3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig15.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 15"> 
Figura 15 : Instantâneo de uma animação 3D de enredo PCoA. Microbiome subgengival apresentando desloca-se em um estudo de caso-controle ortodôntico (n = 16; cada grupo, 3 pontos no tempo; casos: rosa vermelha, controles: luz para azul escuro). Dados gerados com 454-pyrosequencing.Dados inéditos do grupo de trabalho Santigli. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig15large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Táxon: Bacteriae</td>
			<td colspan="3">Ponto do tempo 1 [%]</td>
			<td colspan="3">Ponto do tempo 3 [%]</td>
			<td colspan="2">Teste de Wilcoxon rank-assinado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Filo/género</td>
			<td>dia 25</td>
			<td>Median</td>
			<td>75º</td>
			<td>dia 25</td>
			<td>Median</td>
			<td>75º</td>
			<td>p-valor</td>
			<td>p-valor ajustado #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros</td>
			<td>0.70</td>
			<td>1,07</td>
			<td>1.28</td>
			<td>1.32</td>
			<td>1.63</td>
			<td>1.93</td>
			<td>.000</td>
			<td>.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinomyces</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,30</td>
			<td>0,97</td>
			<td>.001</td>
			<td>.021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dentocariosa</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.32</td>
			<td>.001</td>
			<td>.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bacteroidetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prevotella</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.22</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1,02</td>
			<td>2,44</td>
			<td>.000</td>
			<td>.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Firmicutes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros (bacilos)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,10</td>
			<td>.706</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Staphylococcus</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.17</td>
			<td>.548</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Gemellaceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,77</td>
			<td>1.24</td>
			<td>.005</td>
			<td>.091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Lactobacillales)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.12</td>
			<td>1.50</td>
			<td>.004</td>
			<td>.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Granulicatella</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0.64</td>
			<td>1,59</td>
			<td>2.28</td>
			<td>.000</td>
			<td>.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lactobacilo</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.18</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>.700</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros (Streptococcaceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,10</td>
			<td>0,19</td>
			<td>.768</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Streptococcaceae)</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,10</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0,69</td>
			<td>.005</td>
			<td>.083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Streptococcus</td>
			<td>53,42</td>
			<td>61.96</td>
			<td>88.38</td>
			<td>48,44</td>
			<td>60.83</td>
			<td>73.97</td>
			<td>.055</td>
			<td>.930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros (Lachnospiraceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.11</td>
			<td>.003</td>
			<td>.058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dialister</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>.240</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Veillonella</td>
			<td>3.43</td>
			<td>27.15</td>
			<td>42.78</td>
			<td>6,69</td>
			<td>13,38</td>
			<td>27.05</td>
			<td>.157</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Proteobactérias</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Haemophilus</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,03</td>
			<td>0.31</td>
			<td>0,84</td>
			<td>2.38</td>
			<td>.000</td>
			<td>.008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">teste de Wilcoxon assinou-rank # valor p ajustado de acordo com correção de Bonferroni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">Um p &lt; 0.0026 foi considerado significativo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Análise estatística. Diferenças na microbiome oral de crianças saudáveis em dois pontos no tempo. Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Klug et al . 23

Mudanças na microbiome oral ao longo da infância são motivo de crescente interesse. Comparação de diferentes microbiome estudos revela uma falta de protocolos padronizados de amostragem. Espaço limitado faz amostragem do som sulco subgengival de crianças desafiadoras. Papel do ponto de amostragem é apresentada aqui em detalhe como o método de escolha para esta área.

Biofilme oral amostragem para análise de Microbiome em crianças saudáveis

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar um método padronizado para amostragem de biofilme oral para análise de microbioma em crianças saudáveis. Isso é feito primeiro preparando e esterilizando instrumentos e materiais. Em seguida, a criança é preparada para amostragem de biofilme.Em seguida, a amostragem de biofilme é realizada em três locais, o sulco subgengival, a mucosa da prega vestibular e a saliva. Finalmente, as amostras são armazenadas sistematicamente. Em última análise, as análises do microbioma oral serão realizadas para responder a questões clínicas e científicas.Olá, sou Elizabeth e sou ortodontista. Minha pesquisa se concentra nas alterações do microbioma oral que acompanham o tratamento ortodôntico. A amostragem de biofilme oral pode ser complicada.O espaço no sulco subgengival é limitado, especialmente em crianças. Comparando nossos dados de microbioma com pesquisas mundiais, encontramos uma falta de protocolos de amostragem padronizados. Com este vídeo, damos o primeiro passo para preencher essa lacuna.Pontas de papel calibradas e estéreis que geralmente são usadas na terapia endodôntica são cortadas na primeira marca do anel para padronizar seu comprimento. Após o corte, as pontas de papel devem ser irradiadas por UV para evitar a contaminação por DNA e RNA. Os tubos para armazenamento serão autoclavados e irradiados com UV também.Antes da amostragem do biofilme, os dentes precisam ser limpos completamente, começando com a aplicação de manteiga de cacau. Em seguida, os dentes são manchados com a revelação da placa. Após a coloração, a boca é enxaguada com água.Os dentes são escovados adequadamente com uma escova de dentes elétrica e água. Nenhum creme dental é aplicado, pois isso alteraria o biofilme oral. Um afastador de bochecha e língua é usado para manter a boca aberta e seca.A colocação do afastador requer mãos habilidosas e firmes, de modo a minimizar o desconforto da criança e manter o procedimento o mais curto possível. Pinças dentárias estéreis são usadas e o local de amostragem permanece inalterado durante todo o procedimento. Os dentes são limpos e secos com cotonetes estéreis para evitar a absorção de líquido supragengival durante a amostragem de pontos de papel.Diferentes métodos podem ser usados para amostragem de biofilme na cavidade oral. Devido ao espaço limitado no sulco subgengival das crianças, a amostragem pontual em papel é o método de escolha. As pontas do papel são inseridas tangencialmente até um comprimento definido de quatro milímetros por 20 segundos.Cuidados especiais devem ser tomados para não traumatizar o epitélio juncional. As pontas de papel são então cortadas na terceira marca em um comprimento padronizado de quatro milímetros. A ponta de papel também pode ser inserida simultaneamente no mesmo local ou as amostras podem ser agrupadas de vários locais.O aparelho de campo seco é removido para amostragem de mucosa e saliva. As pontas de papel podem ser aplicadas da mesma forma para amostrar o biofilme da mucosa na prega vestibular. O biofilme salivar pode ser coletado cuspindo saliva não estimulada.Dependendo do desenho do estudo, os pontos de papel serão armazenados como amostras únicas, agrupadas ou paralelas. Um sistema de armazenamento codificado por cores facilitará ainda mais o gerenciamento de amostras. Finalmente, as amostras são armazenadas para análises de microbioma a menos 80 graus Celsius.Vários kits comerciais foram desenvolvidos para a identificação rápida e precisa de bactérias periodontopatogênicas. Os pontos de papel são enviados para laboratórios especializados. A extração, preparação e análise de DNA são realizadas em três horas.O DNA também pode ser usado em pesquisas para estudos de microbioma. O sequenciamento de próxima geração, por exemplo, resulta em conjuntos de dados completos de microbioma. A abundância relativa geral de certas espécies bacterianas pode ser analisada, assim como as mudanças na microbiota devido às mudanças nas condições.Este gráfico de barras e mapa de calor exibem a abundância relativa na microbiota subgengival no filo e no nível da ordem. Diferenças na composição microbiana ao longo do tempo, comparações entre ou dentro de indivíduos ou diferentes métodos de amostragem são apresentados em histogramas. Esta figura mostra os resultados de uma comparação de dois métodos de amostragem, Modo A e Modo B, em diferentes níveis taxonômicos.A análise estatística dos valores criados com o sequenciamento de próxima geração pode ser apresentada em tabelas. Diferentes pontos de tempo, conforme mostrado nesta tabela, podem ser analisados em diferentes níveis taxonômicos. Os valores de p são calculados para provar achados significativos.Finalmente, o microbioma oral no nível da OTU pode ser visualizado com análises de coordenadas principais. Esta figura mostra diferenças intra e interindividuais em cinco sujeitos. Um agrupamento de certos grupos pode mostrar mudanças na composição do microbioma.Esta animação 3D mostra os resultados de um estudo de caso-controle. Pontos vermelhos são os casos. Os pontos azuis são os controles.Um agrupamento claro dos casos após a intervenção ortodôntica em T3, os grandes pontos vermelhos, visualizam uma mudança no microbioma. Os pontos azuis que mostram o grupo de controle são distribuídos uniformemente. Este método pode fornecer informações sobre a amostragem clínica de biofilme no sulco subgengival de crianças saudáveis.Escolhemos os pontos de papel como os mais adequados para este compartimento vulnerável. Neste vídeo, aplicamos o método apenas à condição permanente. Também pode ser aplicado a condições mistas ou maduras.Com alguns dos pacientes, você também pode amostrar locais com doenças periodontais de acordo com o mesmo protocolo. Olá, meu nome é Barbara e sou microbiologista molecular. Quando analiso biofilme no laboratório, preciso contar com uma biblioteca de amostras clínicas imparciais.Cada etapa no campo interdisciplinar da pesquisa microbiana oral deve ser totalmente padronizada. E há mais um fato importante. Você só pode ter sucesso em uma equipe.Portanto, sempre trate bem seus colegas.

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