Name: Célula inteira correntes induzidas pela aplicação de Puff de GABA no cérebro fatias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a técnica de puff para administração farmacológica em gravações de patch-clamp de célula inteira. Este método permite aumento rápido da concentração de drogas, prevenindo dessensibilização de receptores em estudos eletrofisiológicos.

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Os autores gostaria de agradecer as seguintes organizações: Nacional Natural Science Foundation da China (31171018, 31171355), a ciência e a tecnologia de divisão de Guangdong (2013KJCX0054), a Fundação ciência Natural da província de Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) e a ciência de Guangzhou e tecnologia Bureau (201607010320).

Alojamento dos animais e animais de todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com os procedimentos aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas com animais em South China Normal University, de acordo com as orientações para o cuidado Animal estabelecidos pelo Instituto Nacional de Saúde.
 1. preparação de soluções <ol><li>preparar 500 mL de padrão artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) que contém os componentes descritos no nosso trabalho publicado 7 conforme listado na tabela 1.
	<ol><li>Limpo vidro uso copos com água desionizada para preparar uma solução ACSF fresca. Limpar a espátula com água desionizada e seque antes de usar para adicionar NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glicose e adicione o CaCl 2 após ter alternassem a solução com 95% O 2 / 5% CO 2 mistura de ~ 20 min (como detalhado na tabela 1) a 500 mL de água desionizada. Mexa até dissolver totalmente.</li>
		<li>Assegure a ACSF está completamente limpo sem nenhuma precipitação. Em seguida, ajuste o pH para 7,2-7,4. Bolha com uma mistura gasosa composta de 95% O 2 e 5% CO 2 ~ 20 min.</li>
	</ol></li> <li>Preparar 250 mL de solução de corte fatia contendo os produtos químicos 7 descritas na tabela 2.
	<ol><li>Adicionar KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glicose e adicionar o CaCl 2 último conforme indicado em 1.1.1, para 250 mL de água desionizada e dissolver conforme descrito em 1.1.1 e 1.1.2.</li>
		<li>Depois borbulhando com 95% O 2 / 5% de CO 2, coloque a solução em um congelador por 15-20 min para que a solução de corte torna-se gelada e parcialmente congelado. 
		Nota: Usamos esta solução de corte ao fazer fatias de 2-1 mês-velhos ratos; a fórmula pode ser diferente para os ratos mais de 2 meses.</li>
		<li>Solução de preparar LPS pela dissolução em solução salina isotônica livre de endotoxinas estéril (0,9% NaCl). LPS é administrado intraperitonealmente (0,5 mg/kg) e começar a gravar 2h depois.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparação de fatia de córtex pré-frontal <ol><li>tirar a solução de corte do freezer e homogeneizar para obter uma lama. Coloque a solução no gelo e bolha constantemente com 95% O 2 / 5% de CO 2.</li>
	<li>Usando tesouras grandes e afiadas, rapidamente decapitar um rato como descrito 9 e imediatamente colocar a cabeça para um copo cheio de gelado (0-4 ° C) solução de corte.</li>
	<li>Cortar a parte superior do crânio ao longo da linha mediana em uma direção caudal-para-nasal com uma tesoura bem e retire as partes laterais do crânio. Retire o cérebro com uma espátula fina e gota em solução de corte gelada. 
	Nota: Passos 2.2-2.3 devem ser feitos rapidamente (idealmente &#60; 1 min).</li>
	<li>Coloque o cérebro na tampa de um prato de Petri de 9cm cheio de gelo. Lave o cérebro com solução de corte bem gelada. Cortar o cerebelo e o bulbo olfatório com uma lâmina de barbear.</li>
	<li>Cola de cianoacrilato de aplicar ao modelo titular de um vibratome. Cuidadosamente coloque o bloco de cérebro na gota de cola, rostral para cima e imediatamente mergulhe na solução de corte gelada.</li>
	<li>Ajustar o suporte da lâmina do vibratome a um ângulo de 15° em relação ao plano horizontal e preparar 350-µm fatias coronais do cérebro (frequência de vibração da lâmina = 85 Hz, velocidade = 0,1 mm/s).</li>
	<li>Usando uma pipeta, transferência as fatias para a câmara de recuperação cheia de ACSF, incubar durante 1 h (RT) com a constante subida de 95% O 2 / 5% de CO 2.</li>
</ol> 3. Gravação de Patch de células inteiras Micropipetas de <ol><li>fazer vidro borosilicato para usar como gravação eletrodos ou puff, micropipetas de acordo com as orientações específicas no Manual de operação do extrator. Para gravação de eletrodos, as resistências de ponta são na faixa de 4-6 M &#8486;, enquanto o sopro micropipetas têm diâmetros de ponta na faixa de 2 a 5 µm.</li>
	<li>Adicionar bloqueador dos canais de Na + (TTX, 1 µM), canal de at + bloco rápido e, portanto, potenciais de ação, a ACSF e manter uma taxa de fluxo constante desta solução de 2-3 mL/min na câmara de gravação, por bomba peristáltica na câmara e aspiração fora disso. Bolha a ACSF com 95% O 2 / 5% de CO 2 constantemente para garantir a viabilidade das fatias.</li>
	<li>Transferir uma fatia do cérebro para a câmara de gravação usando uma pipeta de Pasteur modificada cuja ponta fina foi cortada para caber o tamanho da fatia. Cobrir a fatia com uma âncora de platina fatia com fios de nylon paralelas espaçados &#8805; 2mm separados para segurar a fatia na plataforma.</li>
	<li>Preencher a micropipeta de gravação com solução interna 7 (tabela 3) e preencher as Micropipetas de sopro com GABA a 10 µM, 50 µM e 100 µM (dissolvido em ACSF) ou ACSF como controle de veículo.</li>
	<li>Para evitar bloqueio com detritos, aplique uma leve pressão positiva, utilizando uma seringa de 1 mL antes imergindo o eletrodo gravação na ACSF. Usando um micromanipulador sob um microscópio (lente da objetiva x 4), posicione a micropipeta de eletrodo e puff de gravação para que as dicas aparecem no centro da imagem de vídeo no monitor ( Figura 1 A).</li>
	<li>Ajustar o foco do microscópio (40 x da lente objetiva) reduzindo gradualmente a micropipeta de sopro e colocá-lo acima do neurônio de gravação em um ângulo de 45°. Manter a distância entre a ponta da micropipeta sopro e o neurônio gravado entre 20-40 µm ( Figura 1 B). Aproximar-se lentamente e com cuidado o neurônio com o eletrodo de gravação e em seguida, solte a pressão positiva. Aplique uma sucção fraca e breve através do tubo conectado ao suporte de eletrodo para criar um selo de giga-ohm.</li>
	<li>Manter a tensão em 0 mV. Após a formação do selo giga ohms, compensar rápido e lento capacitância manualmente ou automaticamente. Em seguida, aplicar uma breve e forte sucção através da tubulação mencionada acima para entrar no modo de células inteiras.</li>
	Modo de <li>eIPSC de registro em tensão-braçadeira. Aplique uma pressão baixa de gás (nitrogênio, 4-6 libras por polegada quadrada) a micropipeta de sopro usando um Picospritzer controlado por um gerador de passo mestre 8 tensão para entregar a única ou a par GABA sopros ( Figura 2).</li>
	<li>Alterar a duração do sopro para obter os melhores resultados de eIPSC ( Figura 3) e medir a eIPSC no modelo de depressão induzida por LPS ( Figura 4).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aplicação de sopro é amplamente utilizada para avaliar a função de receptor pós-sináptico3,4,7, mas requer um controle preciso em cada experimento. Descrevemos aqui um procedimento envolvendo células inteiras remendo de aperto, que demonstra o que Puff GABA induzida IPSCs (i.e., eIPSCs) em fatias de cérebro cortical pré-frontal. A resistência do eletrodo gravação é cerca de 5 MΩ, enquanto o diâmetro da ponta de Micropipetas de s...

A técnica da remendo-braçadeira, uma ferramenta principal para investigar sinais elétricos nos neurônios, foi desenvolvida na década de 1970,1,2. Uma grande vantagem desta técnica é que ele fornece conhecimento sobre tratamentos específicos como (por exemplo, farmacológico) podem alterar funções neuronais ou canais em tempo real3. Avaliação farmacológica da função neuronal durante a gravação em uma fatia do cérebro células inteiras requer a aplicação de drogas, tais como agonistas ou antagonistas dos receptores específicos, para os neurônios sendo gravada. Este método permite a identificação de alterações neuronais que ocorrem após a aplicação de uma droga específica, conduzindo assim a uma melhor compreensão das propriedades dos neurônios4fisiológicas e patológicas. Embora a administração farmacológica pode ser realizada através de qualquer perfusão5 ou sopro6, o último é a técnica superior. Em particular: (i) soprar o aplicativo rapidamente aumenta de droga concentração ao redor do neurônio gravado para um nível tal que a dessensibilização dos receptores de membrana é impedida; (ii) o volume de droga inchado é extremamente baixo, para que haja pouco efeito sobre a solução de banho, o que reduz, portanto, quaisquer efeitos indesejáveis das substâncias químicas administradas em fatias do cérebro; (iii) o protocolo de sopro pode ser definido e salvo, tornando a experiência muito precisamente reprodutíveis; (iv) sopro aplicativo representa o uso econômico dos agonistas/antagonistas, particularmente onde tais reagentes são caros ou difíceis de obter.
Aqui, nos concentraremos na gravação de células inteiras de correntes induzidas por sopro GABA em fatias de cérebro perfeitamente preparados, uma preparação que tem a vantagem de circuitos cerebrais relativamente bem preservada. Como conduzimos induzida por sopro inibitório correntes7 serão descritos neste artigo. Usando o césio (Cs+)-com base em soluções internas e segurando os neurônios em 0 mV, apresentaremos GABA-sopro evocado correntes pós-sináptico inibitórias (eIPSCs) com detalhes técnicos apropriados. Usando um modelo do rato da depressão induzida pela injeção de lipopolissacarídeo (LPS)8, mostramos que o eIPSC amplitude evocada por um sopro de GABA é significativamente reduzida em fatias de ratos LPS-injetados em comparação aos controles do veículo. Nossa intenção é que este artigo deve mostrar como a técnica de sopro é amplamente aplicável a estudos que visam avaliar o efeito de drogas, compostos ou produtos químicos na actividade neuronal em fatias de cérebro.

<table><tbody><tr><td>Micropipetas de vidro borosilicato</td><td>Shutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td>1,50 mm de diâmetro externo; 0,86 mm de diâmetro interno</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Puller Shutter Instruments</td><td>MODELO P-97&nbsp;</td><td>Extrator de micropipeta flamejante/sobrancelha</td></tr><tr><td>Micromanipuladores</td><td>Shutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador controlado por computador&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td>Sistema de aquisição digital <td>Multiclamp 700B</td><td></td>da <td>Molecular Devices</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Câmera de</td> Imagem <td>Molecular Devices Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon&nbsp;</td><td>2115001</td><td>Equipamento de inspeção</td></tr><tr><td>Microscopia&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mestre 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 estimulador de pulso</td><td></td></tr><tr><td>vibratome fatiador</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de barbear</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Monitor de vídeo</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Cola</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Cola de cianoacrilato Bomba</td></tr><tr><td>peristáltica</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de vídeo</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

célula inteira correntes induzidas pela aplicação de puff de gaba no cérebro fatias

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Administração farmacológica é comumente usada quando conduzindo a célula inteira remendo-braçadeira gravação em fatias de cérebro. Um dos melhores métodos de aplicação da droga durante a gravação eletrofisiológica é a técnica de sopro, que pode ser usada para estudar o efeito dos reagentes farmacológicos na actividade neuronal em fatias de cérebro. A maior vantagem do aplicativo de sopro é que a concentração do fármaco em torno do local de gravação aumenta rapidamente, evitando assim a dessensibilização de receptores de membrana. Envolve a utilização bem sucedida da aplicação de sopro cuidadosa atenção aos seguintes elementos: a concentração da droga, os parâmetros da micropipeta de sopro, a distância entre a ponta de uma micropipeta de sopro e o neurônio gravada e a duração e pressão dirigindo o puff (libras por polegada quadrada, psi). Este artigo descreve um procedimento passo a passo para a gravação de células inteiras correntes induzidas pelo ácido gama - aminobutírico (GABA) para um neurônio de uma fatia de cortical pré-frontal de sopro. Notavelmente, o mesmo procedimento pode ser aplicado com pequenas modificações para outras áreas do cérebro como o hipocampo e o corpo estriado e diferentes preparações, tais como culturas de células.

A técnica de sopro permite aos pesquisadores estudar o efeito das drogas sobre os receptores específicos na superfície de um determinado neurônio. Neste artigo, enfocamos as correntes mediadas por receptores GABA. A Figura 1 mostra as micropipetas puff e gravação. Para eliminar qualquer efeito sobre os neurônios gravados da pressão física gerada pelo puff, ACSF e sopros de sacarose(Figura 2)são usados como contro...

Descrevemos a técnica de sopro, pelo qual reagentes farmacológicos podem ser administrados durante a gravação de células inteiras remendo-braçadeira e destacam vários aspectos dos recursos que são cruciais para seu sucesso.

Célula inteira correntes induzidas pela aplicação de Puff de GABA no cérebro fatias

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

O objetivo geral desta técnica de sopro é conduzir a administração farmacológica no registro de patch-clamp de células inteiras. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da eletrofisiologia, como a administração farmacológica. A principal vantagem dessa técnica é que a concentração do medicamento ao redor do local de registro aumenta rapidamente, evitando assim a dessensibilização dos receptores de membrana.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a preparação do corte agudo do córtex pré-frontal e a posição da micropipeta de sopro são relativamente difíceis. Para iniciar este procedimento, esmague a solução de corte congelada para obter uma lama. Mantenha a solução lamacenta no gelo e borbulhe-a com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, coloque a cabeça dissecada em um copo cheio de solução de corte gelada e retire-a após alguns segundos. Corte o crânio ao longo da linha média na direção caudal-rostral com uma tesoura fina e remova as porções laterais do crânio. Em seguida, remova o cérebro com uma espátula fina e coloque-o na solução de corte gelada.Depois, coloque o cérebro na tampa de uma placa de Petri de nove centímetros cheia de gelo. Enxágue o cérebro com uma solução de corte gelada. Em seguida, corte o cerebelo e o bulbo olfatório com uma lâmina de barbear.Em seguida, aplique cola de cianoacrilato no suporte de amostra Vibratome. Coloque cuidadosamente o bloco cerebral na gota de cola, com o lado rostral para cima, e mergulhe-o imediatamente na solução de corte gelada. Ajuste o porta-lâminas em um ângulo de 15 graus em relação ao plano horizontal.Corte os tecidos cerebrais em fatias coronais de 350 mícrons. Em seguida, transfira as lâminas para a câmara de recuperação cheia de ACSF e incube-as por uma hora com borbulhamento constante de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Em nosso experimento, a preparação do corte agudo do córtex pré-frontal também é crítica no procedimento.Uma fatia de cérebro saudável significa neurônios ativos que podem ser bem corrigidos. Neste procedimento, faça micropipetas de borossilicato de vidro para uso como eletrodos de gravação ou micropipetas de sopro. Para o registro de eletrodos, as resistências da ponta estão na faixa de quatro a seis megaohm, enquanto as micropipetas de sopro têm diâmetros de ponta na faixa de dois a cinco micrômetros.Adicione bloqueador de canal de sódio ao ACSF para bloquear o canal de sódio rápido e, portanto, os potenciais de ação, e manter uma taxa de fluxo constante desta solução de dois a três mililitros por minuto na câmara de gravação. Borbulhe o ACSF com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono constantemente para garantir a viabilidade das fatias. Transfira uma fatia de cérebro para a câmara de gravação, usando uma pipeta Pasteur com sua ponta fina cortada para caber no tamanho da fatia.Em seguida, coloque uma âncora de fatia de platina acima da fatia para segurá-la na plataforma. Depois disso, encha as micropipetas de registro com solução interna e encha as micropipetas de sopro com GABA a 10 micromolares, 50 micromolares e 100 micromolares, ou ACSF como controle do veículo. Para evitar o bloqueio com detritos, aplique uma leve pressão positiva usando uma seringa de um mililitro antes de imergir o eletrodo de registro no ACSF.Sob um microscópio, posicione o eletrodo de gravação e a micropipeta de sopro de forma que as pontas apareçam no centro do monitor. Em seguida, identifique um neurônio alvo. Ajuste o foco do microscópio enquanto abaixa gradualmente a micropipeta de sopro e coloque-a acima do neurônio de gravação em um ângulo de 45 graus.Mantenha a distância entre a ponta da micropipeta de sopro e o neurônio alvo na faixa de 20 a 40 micrômetros. Aproxime-se lenta e cuidadosamente do neurônio com o eletrodo de registro e, em seguida, libere a pressão positiva. Aplique uma sucção fraca e breve através da tubulação conectada ao suporte do eletrodo para criar uma vedação de gigaohm.Mantenha a tensão em zero milivolts. Após a formação da vedação gigaohm, compense a capacitância rápida e lenta manualmente ou automaticamente. Em seguida, aplique uma sucção breve e forte através da tubulação para entrar no modo de célula inteira.Posteriormente, registre as correntes IPSC evocadas no modo de pinça de tensão. Forneça inalações de GABA únicas ou emparelhadas através da micropipeta de sopro controlada por um gerador de passo de tensão Master-8. Altere a duração do sopro para obter os melhores resultados das correntes evocadas de IPSC e meça as correntes evocadas de IPSC no modelo de depressão induzida por LPS.Aqui são mostradas as IPSCs de amostra induzidas por GABA micromolar de 10, 50 e 100. E aqui estão as curvas de resposta da duração do sopro. As correntes repetitivas evocadas pelo GABA em 50 baforadas micromolares em intervalos entre sopros de um, dois ou três segundos são mostradas aqui.Uma dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obter fatias cerebrais saudáveis. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da administração farmacológica explorarem o efeito do medicamento na eletrofisiologia.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir a administração farmacológica no registro de patch-clamp de células inteiras. Não se esqueça de que trabalhar com TTX pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Usamos a técnica patch-clamp para medir GABA-activated single-channel correntes (GABAA canais, receptores GABAA) e as correntes sinápticas e tônico que eles geram em neurônios. Ativação dos canais diminui a excitabilidade neuronal na saúde e na...

GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato

Este vídeo demonstra o registro de correntes de células inteiras induzidas pelo ácido gama-aminobutírico, ou GABA, em uma fatia de cérebro cortical pré-frontal de camundongo. A entrega controlada de GABA abre canais de cloreto em um neurônio pós-sináptico, gerando correntes pós-sinápticas inibitórias, ou IPSCs. Essas IPSCs aumentam com concentrações mais altas de GABA, refletindo a atividade inibitória do GABA na transmissão sináptica.

Registrando correntes de células inteiras com GABA Puffing em uma fatia de cérebro de camundongo

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

Oscilações são propriedades fundamentais da rede e são modulados pela doença e drogas. Estudar oscilações cérebro-slice permite a caracterização das redes isoladas em condições controladas. Protocolos são fornecidos para a preparação de fatias cerebrais agudos para evocar CA1 oscilações γ.

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Aqui, apresentamos os protocolos para descobrir compostos ativos nos receptores GABAA , partir de ligação para a fisiologia e farmacologia.

Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

O protocolo apresentado descreve o transporte e a preparação de tecido hipocampal humano ressecado com o objetivo final de usar fatias cerebrais vitais como uma ferramenta de avaliação pré-clínico para potenciais substâncias antiepilépticas.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

As fatias cerebrais ex vivo podem ser usadas para estudar os efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas a diferentes entradas. A optogenética é empregada para ativar independentemente os afferents thalamocortical e corticocortical ao neocórtex não primário, e as respostas sinápticas e de rede são moduladas com isoflurano.

Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis

Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Aprenda a técnica de puff para administração farmacológica em gravações de patch-clamp de célula inteira. Este método permite aumento rápido da concentração de drogas, prevenindo dessensibilização de receptores em estudos eletrofisiológicos.

Célula inteira correntes induzidas pela aplicação de Puff de GABA no cérebro fatias

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