Célula inteira correntes induzidas pela aplicação de Puff de GABA no cérebro fatias

O objetivo geral desta técnica de sopro é conduzir a administração farmacológica no registro de patch-clamp de células inteiras. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da eletrofisiologia, como a administração farmacológica. A principal vantagem dessa técnica é que a concentração do medicamento ao redor do local de registro aumenta rapidamente, evitando assim a dessensibilização dos receptores de membrana.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a preparação do corte agudo do córtex pré-frontal e a posição da micropipeta de sopro são relativamente difíceis. Para iniciar este procedimento, esmague a solução de corte congelada para obter uma lama. Mantenha a solução lamacenta no gelo e borbulhe-a com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, coloque a cabeça dissecada em um copo cheio de solução de corte gelada e retire-a após alguns segundos. Corte o crânio ao longo da linha média na direção caudal-rostral com uma tesoura fina e remova as porções laterais do crânio. Em seguida, remova o cérebro com uma espátula fina e coloque-o na solução de corte gelada.

Depois, coloque o cérebro na tampa de uma placa de Petri de nove centímetros cheia de gelo. Enxágue o cérebro com uma solução de corte gelada. Em seguida, corte o cerebelo e o bulbo olfatório com uma lâmina de barbear.

Em seguida, aplique cola de cianoacrilato no suporte de amostra Vibratome. Coloque cuidadosamente o bloco cerebral na gota de cola, com o lado rostral para cima, e mergulhe-o imediatamente na solução de corte gelada. Ajuste o porta-lâminas em um ângulo de 15 graus em relação ao plano horizontal.

Corte os tecidos cerebrais em fatias coronais de 350 mícrons. Em seguida, transfira as lâminas para a câmara de recuperação cheia de ACSF e incube-as por uma hora com borbulhamento constante de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Em nosso experimento, a preparação do corte agudo do córtex pré-frontal também é crítica no procedimento.

Uma fatia de cérebro saudável significa neurônios ativos que podem ser bem corrigidos. Neste procedimento, faça micropipetas de borossilicato de vidro para uso como eletrodos de gravação ou micropipetas de sopro. Para o registro de eletrodos, as resistências da ponta estão na faixa de quatro a seis megaohm, enquanto as micropipetas de sopro têm diâmetros de ponta na faixa de dois a cinco micrômetros.

Adicione bloqueador de canal de sódio ao ACSF para bloquear o canal de sódio rápido e, portanto, os potenciais de ação, e manter uma taxa de fluxo constante desta solução de dois a três mililitros por minuto na câmara de gravação. Borbulhe o ACSF com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono constantemente para garantir a viabilidade das fatias. Transfira uma fatia de cérebro para a câmara de gravação, usando uma pipeta Pasteur com sua ponta fina cortada para caber no tamanho da fatia.

Em seguida, coloque uma âncora de fatia de platina acima da fatia para segurá-la na plataforma. Depois disso, encha as micropipetas de registro com solução interna e encha as micropipetas de sopro com GABA a 10 micromolares, 50 micromolares e 100 micromolares, ou ACSF como controle do veículo. Para evitar o bloqueio com detritos, aplique uma leve pressão positiva usando uma seringa de um mililitro antes de imergir o eletrodo de registro no ACSF.

Sob um microscópio, posicione o eletrodo de gravação e a micropipeta de sopro de forma que as pontas apareçam no centro do monitor. Em seguida, identifique um neurônio alvo. Ajuste o foco do microscópio enquanto abaixa gradualmente a micropipeta de sopro e coloque-a acima do neurônio de gravação em um ângulo de 45 graus.

Mantenha a distância entre a ponta da micropipeta de sopro e o neurônio alvo na faixa de 20 a 40 micrômetros. Aproxime-se lenta e cuidadosamente do neurônio com o eletrodo de registro e, em seguida, libere a pressão positiva. Aplique uma sucção fraca e breve através da tubulação conectada ao suporte do eletrodo para criar uma vedação de gigaohm.

Mantenha a tensão em zero milivolts. Após a formação da vedação gigaohm, compense a capacitância rápida e lenta manualmente ou automaticamente. Em seguida, aplique uma sucção breve e forte através da tubulação para entrar no modo de célula inteira.

Posteriormente, registre as correntes IPSC evocadas no modo de pinça de tensão. Forneça inalações de GABA únicas ou emparelhadas através da micropipeta de sopro controlada por um gerador de passo de tensão Master-8. Altere a duração do sopro para obter os melhores resultados das correntes evocadas de IPSC e meça as correntes evocadas de IPSC no modelo de depressão induzida por LPS.

Aqui são mostradas as IPSCs de amostra induzidas por GABA micromolar de 10, 50 e 100. E aqui estão as curvas de resposta da duração do sopro. As correntes repetitivas evocadas pelo GABA em 50 baforadas micromolares em intervalos entre sopros de um, dois ou três segundos são mostradas aqui.

Uma dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obter fatias cerebrais saudáveis. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da administração farmacológica explorarem o efeito do medicamento na eletrofisiologia.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir a administração farmacológica no registro de patch-clamp de células inteiras. Não se esqueça de que trabalhar com TTX pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.