Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

O objetivo geral deste experimento é identificar e quantificar com precisão mais de 10.000 proteínas de lisado de células ou tecidos em diferentes tratamentos medicamentosos, cursos de tempo ou condições biológicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina ou biologia, como quais proteínas estão mudando em resposta a um medicamento ou outro estímulo biológico. A principal vantagem desta técnica é que ela tem a capacidade de quantificar com precisão mais de 70% do proteoma expresso em 10 condições experimentais diferentes.

A implicação dessa tecnologia pode ser estendida ao diagnóstico de doenças humanas por meio da descoberta potencial de biomarcadores. A demonstração visual desse método é crítica, pois a lise celular ideal e a estimativa de fluidos desempenham um papel fundamental nos procedimentos de digestão, rotulagem e separação a jusante. Para iniciar este protocolo, obtenha células cultivadas de interesse.

Lave as células duas vezes usando 10 mililitros de PBS para cada lavagem. Raspe e colete as células lavadas em um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de PBS. Centrifugue a 600 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e armazene a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para lisar as células. Colete e pese os tecidos desejados rapidamente após a dissecção. Depois disso, armazene-os imediatamente em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos.

Prepare o tampão de lise no dia do experimento, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione tampão de lise à amostra congelada de modo que a proporção tampão/amostra seja de 10 para um e a concentração final de proteína esteja entre cinco e 10 miligramas por mililitro. Em seguida, adicione contas de vidro e use um liquidificador para lisar as amostras a quatro graus Celsius e velocidade oito misturando por 30 segundos e depois descansando por cinco segundos, repetindo isso cinco vezes ou até que as amostras estejam homogeneizadas.

Meça a concentração de proteína usando um ensaio de quantificação de proteína padrão ou um gel de poliacrilamida SDS corado com Coomassie com BSA como padrão. Depois disso, adicione 100% de acetonitrila de modo que a concentração final seja de 10% e a protease Lys-C esteja em uma proporção de enzima para substrato de um para 100. Incube em temperatura ambiente por duas horas para permitir que ocorra a digestão das proteínas.

Em seguida, adicione TDT de modo que a concentração final seja de um milimolar. Incube em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, adicione HEPES 50 milimolares até que a concentração de uréia nas amostras seja diluída para dois molares.

Adicione tripsina a cada amostra em uma proporção de tripsina para proteína de um para 50. Incubar à temperatura ambiente durante, pelo menos, três horas. Em seguida, adicione TDT até que sua concentração seja novamente um milimolar e incube em temperatura ambiente por duas horas.

Adicionar iodoacetamida de modo a que a sua concentração final seja de 10 milimolares. Incube no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, extinguir qualquer iodoacetamida não reagida adicionando DTT de modo que sua concentração final seja de 30 milimolares.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Verifique a eficiência da digestão da tripsina conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione TFA a cada amostra de modo que a concentração final seja de 1%Usando uma faixa de pH, meça o pH de cada amostra para verificar se está entre dois e três.

Adicione TFA adicional em termos de gota, se necessário, para atingir um pH inaceitável. Centrifugar as amostras a 20 000 vezes g e à temperatura ambiente durante 10 minutos. Recolher o sobrenadante e colocar as amostras em colunas de centrifugação preparadas.

Centrifugue a 100 vezes g durante três minutos ou até que a amostra tenha passado completamente através da coluna para ligar as amostras. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de 0,1% de TFA a cada coluna. Centrifugar a 500 vezes g durante 30 segundos.

Depois disso, adicione 125 microlitros de uma solução contendo 60% de acetonitrila e 0,1 TFA a cada coluna. Centrifugue a 100 vezes g por três minutos para eluir os peptídeos da coluna. Reconstitua cada amostra de peptídeo dessalinizado em 50 microlitros de HEPES 50 milimolares.

Usando uma faixa de pH, verifique se o pH de cada amostra está entre sete e oito. Em seguida, dissolva os reagentes TMT em acetonitrila anidra, adicione-os às amostras e incube em temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, use ponteiras de pipeta de 10 microlitros embebidas com meio de cromatografia para dessalinizar um micrograma de cada amostra e analise a eficiência da rotulagem conforme descrito no protocolo de texto.

Examine de seis a 10 peptídeos separados para garantir que peptídeos não marcados não sejam detectados nas amostras rotuladas. Em seguida, misture aproximadamente dois microlitros de cada amostra. Use pontas de pipeta de 10 microlitros embebidas em meios de cromatografia para dessalinizar esta mistura.

Analise as amostras por LC-MS/MS conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, solubilize a amostra de peptídeo marcado com TMT dessalinizada em 65 microlitros de tampão A. Use uma faixa de pH para verificar se o pH é de aproximadamente 8,0. Se a amostra ainda estiver ácida, use hidróxido de amônio para ajustar o pH conforme necessário.

Em seguida, fracione a amostra conforme descrito no protocolo de texto. Defina o coletor de frações para coletar frações a cada dois minutos, incluindo o tempo de carregamento. Defina a taxa de fluxo para 0,4 mililitros por minuto.

Colete um total de 80 frações. Em seguida, use um concentrador a vácuo para secar completamente todas as outras amostras. Usando LC-MS/MS, analise todas as 80 frações para obter uma cobertura de proteoma ultraprofunda.

Primeiro, embale a resina C18 de 1,9 micrômetro em colunas vazias de 75 micrômetros de diâmetro interno, atingindo um volume de leito de aproximadamente 1,3 microlitros. Enrole a coluna duas a três vezes dentro de um aquecedor de portfólio de borboletas para garantir que todo o comprimento seja aquecido. Prenda a coluna com fita adesiva no interior do aquecedor, certificando-se de não prender o sensor de temperatura do aquecedor.

Em seguida, aqueça a coluna a 65 graus Celsius. Execute 100 nanogramas de peptídeos cerebrais de ratos através do sistema LC-MS / MS para avaliar a qualidade do sistema. Repita essa avaliação mais uma vez.

Depois disso, carregue aproximadamente 0,2 microgramas de peptídeos reconstituídos na coluna enquanto flui 5% de buffer A. Eluir os peptídeos da coluna e analisar com o espectrômetro de massa conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, é descrito um método de alto rendimento para a quantificação de proteínas com uma estratégia de marcação isobárica de 10 plex. A eficiência da rotulagem TMT é examinada usando LC-MS/MS para analisar amostras marcadas com TMT e amostras não rotuladas correspondentes.

Como pode ser visto, o pico de peptídeo não marcado é encontrado apenas na amostra não marcada, enquanto o pico de peptídeo marcado com TMT é encontrado apenas na amostra marcada. Em seguida, o efeito da janela de isolamento MS2 na interferência é avaliado. Todas as varreduras MS2 são designadas como varredura limpa ou ruidosa.

Enquanto as varreduras limpas exibem íons y1 apenas de lisina, as varreduras ruidosas os exibem em lisina e arginina. A remoção de interferência representativa usando peptídeos de E.coli marcados individualmente com três reagentes TMT diferentes é mostrada aqui. As intensidades relativas somadas revelam que a correção baseada em íons y1 é mais precisa para quantificação baseada em TMT.

Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em quatro a cinco semanas, se feito corretamente. Ao tentar este procedimento, é muito importante certificar-se de que todas as etapas de controle de qualidade sejam concluídas completamente para garantir que o conjunto de dados final seja o mais preciso possível. Adaptar esse procedimento para se concentrar em modificações pós-traducionais pode responder a outras perguntas, como como a ubiquitinação, fosforilação ou acetilação está mudando em resposta à progressão da doença ou ao tratamento medicamentoso.

Após seu desenvolvimento, a tecnologia abriu caminho para pesquisadores na área de produtos explorarem as mudanças proteicas em células e tecidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como identificar e quantificar com precisão mais de 10.000 proteínas de uma célula ou tecido de mamífero. Não se esqueça de que trabalhar com UPLC de alta pressão e poucas colunas de sílica pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de óculos de segurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a abordar o problema conhecido de compressão de proporção que ocorre na marcação isobárica. Percebemos que o fracionamento extensivo é uma ótima maneira de não apenas aliviar esse problema, mas também aumenta a identificação de proteínas e peptídeos que podem aumentar ainda mais e se adaptar a uma análise de proteoma.