Name: Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda a quantificar mais de 10.000 proteínas usando marcação isobárica, cromatografia líquida e espectrometria de massa de alta resolução. Este método computacional avança a descoberta de biomarcadores em proteômica.

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Os autores graças a todos os outros membros de laboratório e instalações para discussão útil. Este trabalho foi parcialmente financiado pela NI H concede R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 e ALSAC. A análise de MS foi realizada em Hospital Proteomics instalação St Jude Children, parcialmente financiado por subsídio NIH Cancer Center Support P30CA021765. Os autores agradecer Nisha Badders ajuda com edição do manuscrito.

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descreveremos um protocolo de alta produtividade para a quantificação de proteínas com uma 10-plex isobárica rotulagem estratégia que tem sido implementado com sucesso em várias publicações12,13,14,32 . Neste protocolo, podemos analisar até 10 amostras de diferentes proteínas biológicas no 1 experimento. Nós rotineiramente pode identificar e dosar bem sobre 10.000 proteínas com alta confiança. ...

Avanços na tecnologia de sequenciamento de última geração têm levado a uma nova paisagem para o estudo de sistemas biológicos e doenças humanas. Isto tem permitido um grande número de medições do genoma, transcriptoma, proteoma, metabolome e outros sistemas moleculares para se tornar tangível. Espectrometria de massa (MS) é um dos métodos mais sensíveis em química analítica, e sua aplicação em proteômica expandiu-se rapidamente após o sequenciamento do genoma humano. No campo da proteômica, nos últimos anos produziram grandes avanços técnicos em análises quantitativas baseadas em MS, incluindo a rotulagem isobárica e multiplexação capacidade combinada com extensa cromatografia líquida, além de instrumentação avança, permitindo para medições mais precisas, mais rápidas, com menos material de amostra necessário. Proteómica quantitativa tornaram-se uma abordagem convencional para perfil de dezenas de milhares de proteínas e modificações posttranslational em amostras biológicas altamente complexo1,2,3,4 , 5 , 6.
Métodos de rotulagem isobárico multiplexados como tag isobárica para quantificação relativa e absoluta (ou seja, iTRAQ) e marca de massa em tandem (TMT) MS grandemente melhoraram a taxa de transferência de amostra e aumentou o número de amostras que podem ser analisados em um único experiência de7,1,6,8. Juntamente com outros métodos de quantificação com base em MS, como rótulo livre quantificação e isótopo estável, etiquetando com aminoácidos em cultura de células (ou seja, SILAC), o potencial destas técnicas na proteômica campo é considerável9 ,10,11. Por exemplo, o método TMT permite 10 amostras da proteína a ser analisados em conjunto em 1 experimento usando reagentes 10-plex. Essas tags TMT estruturalmente idênticos têm a mesma massa total, mas isótopos pesados são diferencialmente distribuídos nos átomos de carbono ou nitrogênio, resultando em um íon único repórter durante a fragmentação de MS/MS de cada marca, permitindo a quantificação relativa entre as 10 amostras. A estratégia TMT é rotineiramente aplicada para estudar processos celulares12,13,14, vias biológicas e progressão da doença.
Substanciais melhorias técnicas reforçar sistemas de cromatografia líquida (LC) – MS/MS, tanto em termos de separações de LC e parâmetros de MS, para maximizar a identificação da proteína sem sacrificar a precisão de quantificação. Primeira dimensão separação de peptídeos por uma técnica de separação com alta ortogonalidade para a segunda dimensão é fundamental neste tipo de método de proteomics espingarda para alcançar resultados máximos20. Cromatografia líquida de alta-pH fase reversa (SBST) fornece um melhor desempenho do que o de cromatografia de permuta catiónica forte convencional20. Quando alta-pH SBST é combinado com uma segunda dimensão da baixo-pH SBST, tanto a gama dinâmica analítica e a cobertura de proteína são melhoradas, resultando na capacidade de identificar a maior parte das proteínas expressas ao executar todo-proteome análises15 ,16,17,18. Outros avanços técnicos incluem pequenas partículas C18 (1,9 µm) e prolongado tempo de coluna (~ 1m)19. Além disso, outras melhorias notáveis incluem novas versões de espectrómetros de massa, com taxas de varredura rápida, melhorou a sensibilidade e resolução20e encanamentos de Bioinformática sofisticados para MS dados mineração21.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que incorpora as mais recentes metodologias com modificações para melhorar a sensibilidade e taxa de transferência, enquanto se concentra nos mecanismos de controle de qualidade durante todo o experimento. O protocolo inclui extração de proteínas e digestão, TMT 10-plex rotulagem pH básico e fracionamento de pH ácido SBST, deteção de MS de alta resolução e processamento de dados do MS (Figura 1). Além disso, implementamos várias medidas de controle de qualidade para solução de problemas e avaliando a variação experimental. Este protocolo detalhado destina-se a ajudar pesquisadores novo ao campo rotineiramente identificar e dosar com precisão milhares de proteínas de um lisado ou tecido.

<table><tbody><tr><td>1220 sistema Agilent</td><td></td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% Hidroxilamina</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Liquidificador de Bala</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de Portfólio de Borboletas</td><td>Phoenix S& T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 dicas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de frações</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro</td><td>Next Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida (IAA)</td> <td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 resina, 1.9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Colunas</td><td>Novo Objetivo</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex Reagente de etiqueta isobárica</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td> <td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge Coluna C18 coluna</td><td>Águas</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Águas</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por software

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Foram feitos muitos avanços excepcionais em espectrometria de massa (MS)-baseado proteomics, com progresso técnico particular em cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e capacidade de multiplexação rotulagem isobárica. Aqui, apresentamos um protocolo de perfil profundo-proteômica que combina 10-plex marca massa em tandem (TMT) rotulagem com uma extensa plataforma de LC/LC-MS/MS e interferência computacional pós-MS correção para dosar com precisão proteomes toda. Este protocolo inclui as seguintes etapas principais: extração de proteínas e digestão, TMT rotulagem 2-dimensional (2D) LC, espectrometria de massa de alta resolução e processamento de dados computacional. Etapas de controle de qualidade estão incluídas para solução de problemas e avaliando a variação experimental. Mais de 10.000 proteínas em amostras de mamíferos podem ser quantificadas com confiança com este protocolo. Este protocolo também pode ser aplicado para a quantificação de modificações borne-translational com pequenas alterações. Este método multiplexado, robusto fornece uma ferramenta poderosa para análise proteômica em uma variedade de amostras complexas, incluindo a cultura de células, tecidos animais e espécimes clínicos humanos.

Usamos uma mistura de peptídeo de espécies descritas anteriormente para analisar sistematicamente o efeito da compressão ratio em 3 etapas principais do protocolo, incluindo pre-MS fracionamento, MS configurações e correção post-MS23. O fracionamento de pre-MS foi avaliado e otimizado usando uma combinação de pH básico SBST e pH ácido SBST. Para análise de post-MS, foram considerados apenas peptídeos espécie-específicos. Usamos este modelo de interferência para exa...

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

O objetivo geral deste experimento é identificar e quantificar com precisão mais de 10.000 proteínas de lisado de células ou tecidos em diferentes tratamentos medicamentosos, cursos de tempo ou condições biológicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina ou biologia, como quais proteínas estão mudando em resposta a um medicamento ou outro estímulo biológico. A principal vantagem desta técnica é que ela tem a capacidade de quantificar com precisão mais de 70% do proteoma expresso em 10 condições experimentais diferentes.A implicação dessa tecnologia pode ser estendida ao diagnóstico de doenças humanas por meio da descoberta potencial de biomarcadores. A demonstração visual desse método é crítica, pois a lise celular ideal e a estimativa de fluidos desempenham um papel fundamental nos procedimentos de digestão, rotulagem e separação a jusante. Para iniciar este protocolo, obtenha células cultivadas de interesse.Lave as células duas vezes usando 10 mililitros de PBS para cada lavagem. Raspe e colete as células lavadas em um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de PBS. Centrifugue a 600 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Remova o sobrenadante e armazene a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para lisar as células. Colete e pese os tecidos desejados rapidamente após a dissecção. Depois disso, armazene-os imediatamente em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos.Prepare o tampão de lise no dia do experimento, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione tampão de lise à amostra congelada de modo que a proporção tampão/amostra seja de 10 para um e a concentração final de proteína esteja entre cinco e 10 miligramas por mililitro. Em seguida, adicione contas de vidro e use um liquidificador para lisar as amostras a quatro graus Celsius e velocidade oito misturando por 30 segundos e depois descansando por cinco segundos, repetindo isso cinco vezes ou até que as amostras estejam homogeneizadas.Meça a concentração de proteína usando um ensaio de quantificação de proteína padrão ou um gel de poliacrilamida SDS corado com Coomassie com BSA como padrão. Depois disso, adicione 100% de acetonitrila de modo que a concentração final seja de 10% e a protease Lys-C esteja em uma proporção de enzima para substrato de um para 100. Incube em temperatura ambiente por duas horas para permitir que ocorra a digestão das proteínas.Em seguida, adicione TDT de modo que a concentração final seja de um milimolar. Incube em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, adicione HEPES 50 milimolares até que a concentração de uréia nas amostras seja diluída para dois molares.Adicione tripsina a cada amostra em uma proporção de tripsina para proteína de um para 50. Incubar à temperatura ambiente durante, pelo menos, três horas. Em seguida, adicione TDT até que sua concentração seja novamente um milimolar e incube em temperatura ambiente por duas horas.Adicionar iodoacetamida de modo a que a sua concentração final seja de 10 milimolares. Incube no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, extinguir qualquer iodoacetamida não reagida adicionando DTT de modo que sua concentração final seja de 30 milimolares.Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Verifique a eficiência da digestão da tripsina conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione TFA a cada amostra de modo que a concentração final seja de 1%Usando uma faixa de pH, meça o pH de cada amostra para verificar se está entre dois e três.Adicione TFA adicional em termos de gota, se necessário, para atingir um pH inaceitável. Centrifugar as amostras a 20 000 vezes g e à temperatura ambiente durante 10 minutos. Recolher o sobrenadante e colocar as amostras em colunas de centrifugação preparadas.Centrifugue a 100 vezes g durante três minutos ou até que a amostra tenha passado completamente através da coluna para ligar as amostras. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de 0,1% de TFA a cada coluna. Centrifugar a 500 vezes g durante 30 segundos.Depois disso, adicione 125 microlitros de uma solução contendo 60% de acetonitrila e 0,1 TFA a cada coluna. Centrifugue a 100 vezes g por três minutos para eluir os peptídeos da coluna. Reconstitua cada amostra de peptídeo dessalinizado em 50 microlitros de HEPES 50 milimolares.Usando uma faixa de pH, verifique se o pH de cada amostra está entre sete e oito. Em seguida, dissolva os reagentes TMT em acetonitrila anidra, adicione-os às amostras e incube em temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, use ponteiras de pipeta de 10 microlitros embebidas com meio de cromatografia para dessalinizar um micrograma de cada amostra e analise a eficiência da rotulagem conforme descrito no protocolo de texto.Examine de seis a 10 peptídeos separados para garantir que peptídeos não marcados não sejam detectados nas amostras rotuladas. Em seguida, misture aproximadamente dois microlitros de cada amostra. Use pontas de pipeta de 10 microlitros embebidas em meios de cromatografia para dessalinizar esta mistura.Analise as amostras por LC-MS/MS conforme descrito no protocolo de texto. Para começar, solubilize a amostra de peptídeo marcado com TMT dessalinizada em 65 microlitros de tampão A. Use uma faixa de pH para verificar se o pH é de aproximadamente 8,0. Se a amostra ainda estiver ácida, use hidróxido de amônio para ajustar o pH conforme necessário.Em seguida, fracione a amostra conforme descrito no protocolo de texto. Defina o coletor de frações para coletar frações a cada dois minutos, incluindo o tempo de carregamento. Defina a taxa de fluxo para 0,4 mililitros por minuto.Colete um total de 80 frações. Em seguida, use um concentrador a vácuo para secar completamente todas as outras amostras. Usando LC-MS/MS, analise todas as 80 frações para obter uma cobertura de proteoma ultraprofunda.Primeiro, embale a resina C18 de 1,9 micrômetro em colunas vazias de 75 micrômetros de diâmetro interno, atingindo um volume de leito de aproximadamente 1,3 microlitros. Enrole a coluna duas a três vezes dentro de um aquecedor de portfólio de borboletas para garantir que todo o comprimento seja aquecido. Prenda a coluna com fita adesiva no interior do aquecedor, certificando-se de não prender o sensor de temperatura do aquecedor.Em seguida, aqueça a coluna a 65 graus Celsius. Execute 100 nanogramas de peptídeos cerebrais de ratos através do sistema LC-MS / MS para avaliar a qualidade do sistema. Repita essa avaliação mais uma vez.Depois disso, carregue aproximadamente 0,2 microgramas de peptídeos reconstituídos na coluna enquanto flui 5% de buffer A. Eluir os peptídeos da coluna e analisar com o espectrômetro de massa conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, é descrito um método de alto rendimento para a quantificação de proteínas com uma estratégia de marcação isobárica de 10 plex. A eficiência da rotulagem TMT é examinada usando LC-MS/MS para analisar amostras marcadas com TMT e amostras não rotuladas correspondentes.Como pode ser visto, o pico de peptídeo não marcado é encontrado apenas na amostra não marcada, enquanto o pico de peptídeo marcado com TMT é encontrado apenas na amostra marcada. Em seguida, o efeito da janela de isolamento MS2 na interferência é avaliado. Todas as varreduras MS2 são designadas como varredura limpa ou ruidosa.Enquanto as varreduras limpas exibem íons y1 apenas de lisina, as varreduras ruidosas os exibem em lisina e arginina. A remoção de interferência representativa usando peptídeos de E.coli marcados individualmente com três reagentes TMT diferentes é mostrada aqui. As intensidades relativas somadas revelam que a correção baseada em íons y1 é mais precisa para quantificação baseada em TMT.Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em quatro a cinco semanas, se feito corretamente. Ao tentar este procedimento, é muito importante certificar-se de que todas as etapas de controle de qualidade sejam concluídas completamente para garantir que o conjunto de dados final seja o mais preciso possível. Adaptar esse procedimento para se concentrar em modificações pós-traducionais pode responder a outras perguntas, como como a ubiquitinação, fosforilação ou acetilação está mudando em resposta à progressão da doença ou ao tratamento medicamentoso.Após seu desenvolvimento, a tecnologia abriu caminho para pesquisadores na área de produtos explorarem as mudanças proteicas em células e tecidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como identificar e quantificar com precisão mais de 10.000 proteínas de uma célula ou tecido de mamífero. Não se esqueça de que trabalhar com UPLC de alta pressão e poucas colunas de sílica pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de óculos de segurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a abordar o problema conhecido de compressão de proporção que ocorre na marcação isobárica. Percebemos que o fracionamento extensivo é uma ótima maneira de não apenas aliviar esse problema, mas também aumenta a identificação de proteínas e peptídeos que podem aumentar ainda mais e se adaptar a uma análise de proteoma.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, descrevemos um método robusto para o fraccionamento das membranas plasmáticas de plantas solúveis em membranas resistentes a detergente e do detergente baseado numa mistura de não marcado e in vivo totalmente 15 n marcadas culturas de células de Arabidopsis thaliana. O procedimento é aplicado para estudos de proteômica comparativas para compreender os processos de sinalização.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Análises aprofundadas de proteomas de células cancerígenas facilitam a identificação de novos alvos de drogas e biomarcadores diagnósticos. Descrevemos um fluxo de trabalho experimental para análise quantitativa de (fosfo-)proteomas em subpopulações de células cancerígenas derivadas de tumores líquidos e sólidos. Isso é conseguido combinando estratégias de enriquecimento celular com espectrometria de massa quantitativa baseada em Super-SILAC.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Descrito é um fluxo de trabalho proteômico para identificar parceiros de interação proteica de uma fração subcelular nuclear usando enriquecimento de imunoafinidade de uma determinada proteína de interesse e espectrometria de massa sem rótulo. O fluxo de trabalho inclui fracionação subcelular, imunoprecipitação, preparação de amostras auxiliadas por filtro, limpeza off-line, espectrometria de massa e um pipeline de bioinformática a jusante.

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

Apresentamos um protocolo de rotulagem de etiquetagem tandem (TMT) otimizado que inclui informações detalhadas para cada uma das seguintes etapas: extração de proteínas, quantificação, precipitação, digestão, rotulagem, submissão a uma instalação de proteômica e análises de dados.

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

A rotulagem isotópica precursora combinada e a marcação isobárica (cPILOT) é uma estratégia de multiplexação de amostra aprimorada que é capaz de aumentar o número de amostras que podem ser analisadas simultaneamente com tags isobáricas disponíveis. A incorporação de uma plataforma robótica aumentou consideravelmente o rendimento experimental, a reprodutibilidade e a precisão quantitativa.

Multiplexação automatizada da amostra usando rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica (cPILOT)

O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.

Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido

A oxidação do tiol proteico tem implicações significativas em condições fisiológicas e fisiopatológicas normais. Descrevemos os detalhes de um método proteômico redox quantitativo, que utiliza captura assistida por resina, marcação isobárica e espectrometria de massa, permitindo a identificação e quantificação específicas do local de resíduos de cisteína oxidada reversivelmente de proteínas.

Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

Aprenda a quantificar mais de 10.000 proteínas usando marcação isobárica, cromatografia líquida e espectrometria de massa de alta resolução. Este método computacional avança a descoberta de biomarcadores em proteômica.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software (Vídeo) | JoVE Journal

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

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