Name: Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a usar imagem intravital de dois fótons em duas cores para monitorar mudanças vasculares dinâmicas após lesão contusiva da medula espinhal em ratos Sprague-Dawley. Este método permite visualizar em tempo real a resposta vascular aguda.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH NS059622, NS073636, W81XWH-12-1-0562 CDMRP de DOD, mérito revisão prêmio I01 BX002356 do departamento de assuntos de veteranos dos Estados Unidos, Craig H Neilsen Fundação 296749, Indiana da medula espinhal e cérebro lesão Research Foundation ( ISCBIRF) de Indiana Departamento Estadual de saúde (019919) e Mari Hulman George Endowment fundos.

Todos os procedimentos de manipulação cirúrgica e animais foram realizados conforme aprovado sob o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (National Research Council) e as diretrizes da Indiana University School de medicina institucional Cuidado Animal e uso Comitê.
1. Preparação cirúrgica
<ol>
	<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo o estabilizador da coluna vertebral. Limpe a mesa de cirurgia e toda a área circundante com etanol a 70%. Para a preparação do procedimento cirúrgico não-sobrevivência, coloque uma almofada de limpeza cirúrgica na parte superior a 37 ° C almofada de aquecimento.</li>
	<li>Use seis semanas de idade ratos Sprague Dawley (SD) para este estudo. Pesar e anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (87,7 mg/kg) e mistura de xilazina (12,3 mg/kg). Confirme o estágio apropriado de anestesia quando o animal deixa de responder a um estímulo de pitada de dedo do pé. Injectar por via subcutânea 0,01-0,05 mg/kg de buprenorfina e carprofeno a 5mg/kg antes da cirurgia.</li>
	<li>Raspar o rato em 2 áreas: região da coluna cervical nas costas e a região do pescoço do lado materno. Esfregue as áreas de pele com esfoliação cirúrgica de betadine e toalhetes com álcool 70%. Aplica a pomada para evitar o olho seco durante a cirurgia. Coloque o animal na posição supina sobre a almofada de limpeza cirúrgica.</li>
</ol>
2. cateterização da Veia Jugular externa
<ol>
	<li>Localizar a veia jugular externa, encontrando o ponto de pulso perto da clavícula e cortar com uma tesoura pequena Primavera para fazer uma incisão vertical no local, que é o ponto de Cruz de 3 pontos anatômicos: caudal ramus da mandíbula direita, tubérculo maior do úmero e manúbrio (figura 1A). Isole o vaso utilizando a mola tesoura e pinça fina. Amarre a extremidade distal com 1 esterilizados para suturas cirúrgicas linha (Figura 1)20.</li>
	<li>Prepare uma seringa de 1 mL, preenchido com solução salina e conectados com um cateter especializado feito de uma agulha de calibre 21 (figura 1B). Faça uma pequena incisão usando um par de tesouras micro no navio e deslize o cateter dentro do vaso.<ol>
		<li>Fixe a agulha amarrando ambos proximal e distal final (Figura 1). O cateter especializado é feito com uma agulha calibre 21. Moer a ponta plana e solda com um pedaço de 2 mm da ponta cortada da outra agulha 21. Isto pode prevenir o cateter de passar lá fora. 
		Nota: Uma pequena quantidade de sangue que flui para a agulha indica que a agulha entrou com sucesso um vaso sanguíneo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. espinha estabilização e laminectomia de C5-C7
<ol>
	<li>Coloque o animal em posição. Corte a pele ao longo da linha mediana com uma lâmina de bisturi n º 15, na altura da coluna desejada. Disse as camadas de músculo de 5th para 7th vértebras cervicais (C5-C7) bilateralmente para expor as facetas lateral (Figura 2A)21. 
	Nota: Localize a segunda vértebra torácica (T2), encontrando o pico entre as escápulas. Contagem para cima a partir da vértebra T2 para encontrar o C7 vértebra21,22,23,24.</li>
	<li>Estabilize a coluna do rato utilizando um aparelho de estabilização modificado. Faça um corte em ambos os lados do osso vertebral lateral. Mova os braços de aço inoxidável sob as facetas exposto processo transverso e aperte os parafusos para garantir a estabilidade (Figura 2B).</li>
	<li>Remova cuidadosamente as lâminas de C5-C7 (laminectomia, Figura 2).</li>
	<li>Coloque um pedaço pequeno de gelfoam soro fisiológico embebido em cima da dura-máter exposta para mantê-la hidratada (Figura 2D).</li>
</ol>
4. instalação de janela de imagem dois fotões (2P)
<ol>
	<li>Pequenos pedaços de material de gelfoam a na lacuna entre os músculos e ossos vertebrais, também coisas uma linha fina de gelfoam entre ossos vertebrais e medula espinhal, em seguida, use cola adesiva de tecido para selar a área de músculo-osso circundante. Espere 5 min. para secagem completa (Figura 2E). 
	Nota: Esta etapa impede eficazmente o futuro sangrando na janela e leakiness de soluções de imersão.</li>
	<li>Prepare-se 4% de ágar com DDQ2O no microondas. Após o ágar é dissolvido completamente, espere até que ele retorne a uma temperatura touchable. Encher uma seringa estéril de 1 mL com solução de ágar e canalizá-lo para a borda da janela para construir um muro (Figura 2E). A solução se solidifica rapidamente e permanece flexível para permitir que a lente ou objectivo mover-se livremente.</li>
	<li>Quando estiver pronto para a imagem latente, remova o fluido de imersão gelfoam e lugar dentro da janela para 2P (Figura 2F) de imagem. Transfira o animal estabilizado dentro da câmara escura 2-fóton microscópio e a janela de imagem 2P diretamente sob a lente. Baixe a lente cuidadosamente dentro da janela de imagem.</li>
</ol>
5. injeção de primeiro corante fluorescente e imagens da linha de base
<ol>
	<li>Preparar 0,5 mL de rodamina B isotiocianato-dextrano (peso molecular médio de 4 mg/mL ~ 70kDa) em solução salina. Encher uma seringa estéril de 1 mL com a solução e conecte a seringa de cateter instalado anteriormente. 
	Nota: Preparar a solução de tintura fluorescente antes de que recomenda-se usar.</li>
	<li>Injetar o primeiro corante pressionando-se a seringa lentamente (Figura 3B). Primeiro, use a ocular para identificar a área de interesse. Use uma câmera do dispositivo acoplado (CCD) de carga para adquirir uma imagem brilhante-campo dos padrões dos vasos sanguíneos superficiais em menor ampliação como uma imagem de Marco. Alterne para o modo de digitalização laser abrir o 2P imaging software para coletar as duas imagens e linha-verificação de dados.</li>
	<li>Selecione o comprimento de onda da excitação de laser de adequada 2P, poder e fluorescente canal (canal vermelho para primeiro corante) para combinar com o fluorophores usado no tecido imagem e execute na vivo de imagem (Figura 3E). Manter o animal em uma almofada de aquecimento durante todo o processo.</li>
</ol>
6. C7 Contusive lesão usando dispositivo LISA
<ol>
	<li>Execute uma lesão contusão na linha mediana C7 usando um dispositivo de Louisville lesão sistema aparelhos (LISA) de acordo com um protocolo previamente estabelecido25,26.<ol>
		<li>Em breve, coloca o animal no palco LISA após a calibração.</li></ol></li></ol>Depois de selecionar um ajuste do ponto zero e ajustando o tecido deslocamento (0,800 mm neste caso), clique no botão de "Executar o experimento" do software para desencadear a liberação de pêndulo e criar o prejuízo.
		<li>Após a lesão, coloque outro pedaço pequeno de gelfoam soro fisiológico embebido em cima da dura-máter exposta para mantê-la hidratada.</li>
	
	
	<li>Repita a etapa 4.3 e re-executar a imagem latente na vivo na mesma área visível com o corante vermelho injetado anteriormente (Figura 3 &#38; F).</li>
	<li>Transferir a animal de volta para a mesa cirúrgica e manter o animal sedado com anestesia adequada, seguindo o protocolo IACUC-Importantíssima.</li>

7. injeção do segundo corante fluorescente e pós-lesão Imaging
<ol>
	<li>Preparar 0,5 mL de isotiocianato de fluoresceína-dextrano (4 mg/mL, peso molecular médio ~ 70 kDa) em solução salina como 5.1. Encher uma seringa estéril de 1 mL da solução e se conectar com o cateter instalado anteriormente.</li>
	<li>Transferir parte traseira animal estabilizada dentro da câmara escura de microscópio 2P e refazer a imagem da mesma área com o canal vermelho para o primeiro corante e o canal verde para o segundo corante (figuras 3D &#38; G).</li>
	<li>No final da imagem, solte o rato do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e limpar a parede de ágar.</li>
</ol>
8. animal sacrifício
<ol>
	<li>Depois da imagem latente, sacrifica o rato a perfusão de transcardial protocolo27a seguir. Coletar as amostras de medula espinhal e fixar os 4% PFA.</li>
</ol>
9. análise de dados offline: Quantificação de diâmetros de navio
<ol>
	<li>Transferi os arquivos de imagem para uma estação de trabalho para análise off-line.</li>
	<li>Abra ImageJ e selecione "arquivo" e escolher anteriormente salvo dados brutos e abra o arquivo de imagem única associada (Figura 4B).</li>
	<li>Calibre a imagem selecionando "Analisar" seguido por "Definir escala" (Figura 4). O valor colocado na "Distância em pixels" é calculado usando a equação exibida na Figura 4A. A calibração de lente ótica 2-fóton determina o valor padrão na equação. O valor de "opticalZoom" é encontrado em Excel Extensible Markup Languagefile (arquivo XML) associado com o arquivo de imagem única (Figura 4B).</li>
	<li>Desenhar uma linha perpendicular ao eixo longo do navio (Figura 41 &#38; E1) e selecione "Analisar" seguido por "Medida". A medição do diâmetro do vaso é exibida na janela de resultados (Figura 42 &#38; E2). Repeti 3 vezes do outro lado do navio para adquirir o valor médio.</li>
</ol>
10. offline análise de dados: Quantificação de vermelho sangue (RBC) velocidade de célula
<ol>
	<li>Transferi os arquivos de verificação de linha na estação de trabalho para análise.</li>
	<li>Iniciar o software ImageJ e selecione "arquivo" e depois escolher anteriormente salvo dados brutos e abrir todos os arquivos de verificação de linha associado com o nome de extensão ".ome".</li>
	<li>Abra a "Imagem" e selecione "Stacks" seguidos por "imagens a pilha". Converta todos os arquivos OME em um único pilha TIFF arquivo de imagem.</li>
	<li>Iniciar o software Matlab e clique em "Abrir", selecione o arquivo de código "LSPIV_parallel.m". Nota: O código de Matlab para LS-PIV pode ser baixado em https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18</li>
	<li>Selecione as seguintes ordens: "Executar" &#62; "Alterar pasta" &#62; "artéria". Escolha o arquivo TIFF de pilha de imagem gerado em 10.3.</li>
	<li>Digite "Y" e pressione Enter.</li>
	<li>Coloque um cursor à esquerda e à direita da imagem, respectivamente, e o programa começa a processar os dados.</li>
	<li>No final do programa, insira 2 valores para calcular a leitura final: "valor de conversão de pixel_meter" e "valor de conversão de tempo de varredura". Ambos encontram-se no arquivo XML associado com linha-verificação dados. O valor final é expresso como a média e o desvio padrão da velocidade nas unidades de milímetro por segundo (mm/s).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um desafio para estudos vasculares seguindo SCI é a limitação técnica porque as técnicas tradicionais são em grande parte restritas a mudanças de estrutura vascular em amostras após a morte. Este romance na vivo de imagem método descrito acima permite a medição dinâmica do fluxo sanguíneo e parâmetros relacionados (diâmetro de velocidade e navio) usando 2 P-LSM em ratos vivos. Ele também permite o exame repetido nos mesmos conjuntos de vasos em pontos diferentes do tempo seguindo contusive Sci. Técnicas de imagem anterior 2-fotão microscopia foram capazes de capturar estruturas vasculares pós traumas devido ao escapamento de um único marcador. Nosso projeto de dupla-cor permite dinâmica imagem latente vascular para modelos traumáticos. Além disso, a flexibilidade deste método fornece uma oportunidade para gerar um perfil temporal-espacial de aguda alterações vasculares seguindo Sci.
Existem várias etapas críticas nossas in vivo dupla-cor da imagem latente método. Em primeiro lugar, é fundamental para garantir a estabilidade física da medula espinhal, antes da imagem latente de lapso de tempo, particularmente reduzindo artefato de movimento de respiração. Nós projetamos a forma de grampos da coluna vertebral para aumentar a altura da vértebra ligeiramente durante a estabilização. Assim, o movimento da medula espinhal correlacionando ao animal respirar pode ser bastante reduzido (Figura 1-F, 2B). Recomenda-se verificar a estabilidade da medula espinhal, antes do início de cada sessão de imagens. Se a medula espinhal falhar alcançar a estabilidade, o ajustamento deve efectuar-se para o alinhamento e o aperto dos grampos da medula espinhal. Segundo, periférico do tecido (pele, camada muscular e óssea) sangramento na janela de imagem corre o risco de contaminação da vista. Para uma sessão de imagem suave, gelfoam e tecido cola adesiva deve ser aplicada para o tecido circundante para uma prevenção eficaz. Terceiro, os corantes fluorescentes que escolhemos tem um tamanho similar como albumina (66 kDa), que é a proteína do plasma sanguíneo principal de alto peso molecular. Sob condições homeostáticas, os corantes em grande parte foram retidos no interior da embarcação similar como albumina28. Após a lesão, os corantes passaram a estrutura endotelial interrompida e vazaram o parênquima, causando uma aumento significativo da intensidade fluorescente na área periférica da vasculatura (Figura 3F-G). Além disso, há duas razões por que nós escolhemos a cateterização da veia jugular externa. Primeiro, pode fornecer uma rota acessível consistentemente de entrega a qualquer momento do experimento. Em segundo lugar, ele pode ser usado como uma rota para injeção de tratamento no futuro.
Embora o nosso método de dupla-cor na vivo é capaz de fornecer um novo local para estudos de imagiologia vasculares traumáticos, algumas ressalvas em relação esta técnica devem ser abordadas. Atualmente, esta técnica é projetada para avaliar alterações vasculares em 2 pontos de tempo (linha de base e 1 ponto de tempo pós-lesão), mas é possível mudar para vários pontos de tempo se canais e corantes fluorescentes adicionais estão disponíveis. Embora existam vários estudos usando a janela de vidro implantado para a imagem latente intravital crônica, nenhum deles pode fornecer informação de base sobre o mesmo navio após lesão traumática19,29,30, 31,32. Ao contrário destes estudos, nossa janela é uma janela de vidro não. Isto é conveniente para a imagem latente de pré e pós lesão, mas pode ser desafiador para o re-estabelecimento da janela para a observação a longo prazo. Nossa pesquisa futura está trabalhando na melhoria técnica para a imagem latente crônica. O sistema vascular é composto de vários tipos de vaso (artéria, veia e capilares) e cada um é diferente em aspectos de morfologia e função. Diferenciação entre tipos de navio durante a imagem latente poderia ajudar a destrinchar um padrão claro de alterações vasculares. O protocolo acima depende do observador identificar os vasos com base na morfologia e velocidade; no entanto, um corante de artéria específica pode ser facilmente adicionado para dar uma classificação mais definitiva entre tipos de navio33.
Esta técnica não é apenas limitado a avaliações sobre contusive e outros modelos traumáticos, como lesão por esmagamento e lesão de radiação, mas também em estudos sobre a perturbação de BSCB, permeabilidade, bem como vascular muda. Além de SCI, poderia ser usado para estudar as alterações vasculares após outras doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica (ela) e esclerose múltipla (MS). Além disso, pode ser transferível para um modelo de animais transgénico para estudar a interação dinâmica neurovascular. Como uma ferramenta de triagem poderoso, estudos futuros poderiam utilizar a técnica de imagem descrita aqui para avaliar a eficácia do tratamento para a lesão da medula espinhal.
Em conclusão, na vivo o método de dupla-cor é uma ferramenta de abordagem de confiança, em tempo real, na vivo para avaliar alterações vasculares dinâmicas, que é ideal para a caracterização do perfil vascular temporal-espacial e triagem para tratamentos de reduzir danos secundários após Sci.

Lesão traumática da medula espinhal (SCI) é uma lesão comum, levando ao comprometimento da função motora, sensorial e autônoma. De acordo com o nacional medular lesão estatística Center (NSCISC) em 2016, aproximadamente 282.000 pessoas foram afetadas, enquanto 69% deles foram principalmente devido a acidentes de trânsito ou cai1. Esses pacientes geralmente exigem cuidados intensivos; no entanto, nenhum tratamento eficaz está atualmente disponível. Portanto, novas estratégias eficazes no sentido de SCI são urgentemente necessárias.
SCI principalmente é dividido em duas fases: lesão primária e lesão secundária. A lesão primária compreende o insulto físico causando necrose hemorrágica no local do impacto2, seguido por uma série de eventos de lesões secundárias, tais como inflamação, apoptose celular e desmielinização dos axônios remanescentes, que progressivamente levam para a expansão dos déficits funcionais e morfológicas3,4,5,6. Hemorragia é o primeiro sinal visível da lesão, indicando uma imediata interrupção vascular na fase aguda da SCI7,8. Uma estratégia neuroprotetor destinada a reduzir o dano vascular precoce pode melhorar a recuperação dos pacientes, mas isso requer uma melhor compreensão do mecanismo fisiopatológico de início pós-lesão de eventos vasculares.
Apesar de estudos anteriores, usando vários métodos para estudar a vasculatura espinal medula, permanecem limitações significativas. A desvantagem mais compartilhada está estudando somente pós-morte amostras, por exemplo, hidrogênio afastamento9, autoradiografia10, microangiogram8, corrosão vascular moldes11e imuno-histoquímica12 ,13. Embora Flowmetry Doppler Laser fornece monitoramento em tempo real não-invasiva da medula espinhal sangue fluxo14, é incapaz de diferenciar entre sistemas vasculares e detectar alterações morfológicas vasculares. MRI dinâmico de contraste aprimorado (DCE-MRI) também é não-invasivo, mas gera imagens de baixa resolução e requer uma infra-estrutura caro15.
Embora na vivo por imagens usando 2-fóton microscopia de varredura a laser (2P-LSM) foi desenvolvido para estudar a vasodynamics no córtex16,17,18, têm um número limitado de estudos demonstraram alterações vasculares seguindo um Sci. Tang et al demonstraram alterações no fluxo sanguíneo na borda do site em um hemisection modelo19, mas a imagem da lesão após uma lesão contusive é mais difícil por duas razões. Em primeiro lugar, uma janela óptica de vidro tradicional sobre o local da lesão não sustentar o impacto mecânico e permanecem funcional para a imagem latente. Segundo, o escapamento do tracer para o parênquima devido à hemorragia cria dificuldade com imagem latente pós-lesão.
Aqui nós apresentamos um método de imagem dupla-cor romance, que permite que os vasos individuais mesmos em pontos de tempo pré e pós-lesão de imagem. Além disso, fornece um perfil temporal-espacial de vasculares alterações dinâmicas seguindo um contusive Sci. Ele também tem o potencial para geração de imagens em vários pontos de tempo pós-lesão. Este protocolo pode ser aplicado diretamente a animais transgénicos para estudar a interação neurovascular.

<table><tbody><tr><td>Produtos Purdue Betadine Esfoliante Cirúrgico</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>Esterilização da pele</td></tr><tr><td>Cetamina (87,7 mg/kg)/Xilazina (12,3 mg/kg)</td><td>Patterson Veterinary&nbsp;</td><td>07-881-9413, 07-890-5745</td><td>Agente anestésico</td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,03 mg/mL)&nbsp;</td><td>Patterson Veterinary&nbsp;</td><td>07-891-9756</td><td>Agente de alívio da dor</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>Medicamento anti-inflamatório não esteróide</td></tr><tr><td>Esponjas de Gaze Dukal&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>Esterilização da pele</td></tr><tr><td>Decon Etanol 200 Prova</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>Esterilização da pele</td></tr><tr><td>Lágrimas artificiais Pomada para os olhos</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261&nbsp;</td><td>Previne o ressecamento dos olhos&nbsp;</td></tr><tr><td>Aplicadores com Ponta de Algodão</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>1006015</tr><tr><td>isotiocianato de rodamina B&ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>Peso médio de mol 70kDa</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína&ndash; dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td>Peso médio mol 70kDa</td></tr><tr><td>Esterilizador</td><td>de instrumentos Ferramentas de ciências finas</td><td>18000-50</td><td>para ferramenta de cirurgia de esterilização</td></tr><tr><td>Conjunto de estabilizador de coluna</td><td>Fabricado sob medida pelo Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>Entre em contato com Y. Ping Zhang para detalhes. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M Animal Care Products</td><td>1469SB</td><td>Tissue cola adesiva</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>parar de sangrar</td></tr><tr><td>Noyes Tesoura de mola</td><td>FST</td><td>15013-12</td><td></td></tr><tr><td>pinça fina- Dumont # 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomia</td></tr><tr><td>retrator cirúrgico</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10003-12&nbsp;</td><td>Corte de pele</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi #15</td><td>Royal-Tek</td><td>BS2982</td><td>tesoura</td></tr><tr><td>micro angulada</td> para corte de pele <td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Pode ser de qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>3-0 suturas vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J393H</td><td>Pode ser de qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Sutura Trançada Não Absorvível Preta de Seda, 3-0, C-7, Corte Reverso, 18"</td><td>LOOK</td><td>786</td><td>Pode ser de qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200.V0</td><td>Pode ser de qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Agulha de calibre 21</td><td>BD</td><td>305165</td><td>Pode ser de qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Pode ser de qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Microscópio de Varredura a Laser de Dois Fótons</td><td>Microscopia</td><td></td><td></td>de Fluorescência Bruker</tr><tr><td>Dispositivo LISA</td><td>Fabricado sob medida pelo Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>Entre em contato com Y. Ping Zhang para obter detalhes. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Corporation</td><td></td><td>Software de imagem</td></tr><tr><td>PrairieView</td><td>Prairie Technologies/Bruker</td><td></td><td>Software de imagem de dois fótons</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>Estatísticas do Matlab caixa de ferramentas</td><td>A MathWorks, Inc.</td><td>https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle</td><td>Software de análise de imagem</td></tr></tbody></table>

um vivo em método de dupla-cor de imagem dinâmica vascular após lesão da medula espinhal contusive

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Lesão da medula espinhal (SCI) provoca significativa interrupção vascular no local da lesão. Patologia vascular ocorre imediatamente após a SCI e continua durante a fase aguda da lesão. Na verdade, células endoteliais parecem ser os primeiros a morrer depois de uma contusive Sci. Os início eventos vasculares, incluindo o aumento da permeabilidade da barreira sangue-medular (BSCB), induzem edema vasogénico e contribuam para eventos de lesão secundária prejudicial causados por mecanismos de lesão complexa. Visando a ruptura vascular, portanto, poderia ser uma estratégia-chave para reduzir cascatas de lesões secundárias que contribuem para as lesões histológicas e funcionais após Sci. Estudos anteriores foram principalmente realizados em amostras após a morte e não foram capazes de capturar as alterações dinâmicas da rede vascular. Neste estudo, nós desenvolvemos na vivo dupla-cor dois fotões método de imagem para monitorar mudanças de dinâmicas vasculares agudas seguindo contusive Sci. Esta abordagem permite detectar o fluxo sanguíneo, diâmetro dos vasos e outras patologias vasculares em vários locais do rato mesmo pré e pós lesão. Em geral, este método oferece um excelente local para investigar a dinâmica vascular.

O método é capaz de monitorar em vivo spinal vascular mudanças dinâmicas em vasos individuais pré e pós-traumático Sci. Um cateter é instalado pela primeira vez, através da veia jugular externa para fornecer acesso para injeções subsequentes tintura fluorescente (figura 1A-C, Figura 3). Na segunda etapa, um aparato especializado é usado para estabilizar o C5-C7 expostas (Figura 1-F, Figura 2A-B). Esta etapa de estabilização pode eliminar artefatos de respiração e fornecer a imagem estável. Após laminectomia (Figura 2), o próximo passo é a instalação de 2 P imagem janela sobre C5-C7 (Figura 2D-F). Minimizar o tecido periférico sangramento ao redor da janela de imagem da coluna vertebral é fundamental para a imagem latente vascular bem sucedida. O passo seguinte é injetar tintura fluorescente rodamina-dextrano (vermelho) através do cateter acima mencionado para o Marco e o mapa da rede vascular como a linha de base (Figura 3A-B, E). Após lesão contusive da linha mediana C7 com severidade moderada, FITC-dextrano (verde) é apresentado em pontos de tempo pós-lesão desejado (Figura 3A &amp; D). A beleza do método dupla-cor é que aquele ainda pode detectar a estrutura vascular usando o corante segundo quando o primeiro corante tem já vazou no parênquima devido a lesão (Figura 3).
Durante a sessão de imagens, é aconselhável manter o animal em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo após a indução da anestesia.
Usando nosso método de dupla-cor, a velocidade de diâmetro e células vermelhas do sangue (velocidade de RBC) dos vasos individuais pode ser medida e calculada. Para diâmetro, pode usar ImageJ para medir do navio no seu maior diâmetro para 3 repetições após calibração (Figura 4). Para velocidade, medem-se linha-digitalizar imagens usando o programa Matlab (MATLAB R2013a) para calcular o RBC velocidade (Figura 5)18. Com base na morfologia, velocidade do fluxo de sangue e diâmetro dos vasos, os vasos podem ser classificados em 2 categorias: artéria e veia (ver tabela 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig1.jpg"> 
Figura 1 . Estabilização de cateterismo e espinha de veia jugular. (A) um esquema de desenho para localizar a veia jugular externa. (B) o cateter especializado feito de uma agulha de calibre 21. A dica era terra plana e soldada com um pedaço de ponta de 2 milímetro cortado da outra agulha 21. (C) um diagrama esquemático de cateterismo. A extremidade distal é ligada primeiro, seguido por estabilização proximal do cateter, terminando com a agulha de fixação juntamente com o navio (ligadura do vaso, pontas de seta azuis). (D) uma imagem do estabilizador espinha modificada. É exibida uma janela de C5-C7 antes da laminectomia (E) e após laminectomia e contusive SCI (F) . <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig2.jpg"> 
Figura 2 . Diagrama esquemático de instalação janela óptica passo a passo. (A) etapa 1: expor a vértebra por corte de pele e músculo ao longo da linha mediana. (B) etapa 2: estabilização da coluna vertebral. (C) passo 3: laminectomia. (D) passo 4: manter a umidade da medula espinhal, colocando um pedaço de gelfoam embebida em soro fisiológico. (E) passo 5: selar as aberturas com gelfoam estéril e vetbond. Após a secagem, uma camada de parede agar baseia-se na borda da janela. (F) passo 6: quando estiver pronto para a imagem latente, remover o líquido de imersão gelfoam e lugar dentro 2P janela de imagem. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig3.jpg"> 
Figura 3 . O na vivo procedimento de dupla cor método passo a passo. Todo o processo é composto por 5 passos (A). Após a etapa 1 e etapa 2, um par de traçadores dextran com um tamanho aproximado 70 KDa são injetado em sequência para rotular a vasculatura espinal medula antes de (,B e C) e depois contusive SCI (D). (E)-(G) imagens representativas 2P exibir o sistema vascular da medula espinhal no passo 3 a etapa 5. Setas brancas apontam para a primeira onda corante vermelho vazando áreas (F e G), turquesas setas exibir escapamento segunda onda corante verde (G). Barra de escala = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig4.jpg"> 
Figura 4 . Aquisição e quantificação de diâmetros de navio da coluna vertebral. Após preparação, arquivos de imagem são adquiridos sob microscopia de P 2, juntamente com arquivos XML de valores calibrados (B). (A) a equação exibe o cálculo de "pixel por micron", com base nos valores do zoom óptico. Após a calibração no ImageJ (C), diâmetros de navio são medidos em 3 pontos do outro lado do eixo longitudinal antes (D1) e depois (E1) lesão. (D2) e (E2) exibir os valores medidos. (F) quantificação de diâmetros de navio de linha de base e 30 min pós-lesão. Barra de escala = 50 µm. dados são apresentados como média ± DP, * * * p &lt; 0,0001, teste t pareado bicaudal.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig5.jpg"> 
Figura 5 . Aquisição e quantificação da velocidade da embarcação da coluna vertebral. Linha-verificação arquivos de imagem são adquiridos sob microscopia de P 2 para calcular velocidades de nave única. (A) um exemplo de um método para avaliar a velocidade da embarcação de sangue RBC e vaso seleccionado. (B) um exemplo arterial de imagem de linha-digitalização e arquivo de plotagem correspondente para cálculo da velocidade, bem como um exemplo de uma veia (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Artéria</td>
			<td>Veia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morfologia</td>
			<td>Parede do vaso reto, liso, grosso</td>
			<td>Ramos, arestas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Velocidade do fluxo de sangue</td>
			<td>Rápido</td>
			<td>Lenta mas varia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diâmetro</td>
			<td>30-80 µm</td>
			<td>100-250 µm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Critérios para a identificação de tipos de navio

Nós introduzimos um na vivo de imagem método usando dois diferentes corantes fluorescentes para controlar as alterações vasculares na coluna dinâmicas que após uma lesão da medula espinhal contusive em ratos Sprague Dawley adulto.

Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

O objetivo geral deste método de imagem de dois fótons em duas cores in vivo é monitorar as alterações dinâmicas vasculares espinhais agudas que ocorrem após uma lesão contusiva da medula espinhal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre como essas alterações vasculares dinâmicas afetam a progressão patológica e os déficits funcionais que ocorrem após a lesão medular. A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas tradicionais que usam amostras promodernas é que ela fornece evidências da dinâmica vascular aguda da lesão medular em um animal vivo.As implicações dessa técnica se estendem ao tratamento da lesão medular, pois esse método permite examinar possíveis estratégias neuroprotetoras voltadas para o reparo vascular precoce. Tivemos a ideia para esse método de imagem de duas cores quando descobrimos que a injeção sequencial de cores de fluorescência contrastantes nos permite visualizar vasos rompidos após lesão na medula espinhal. Antes de iniciar o procedimento, confirme o nível adequado de sedação por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé de uma rata Sprague Dawley de seis semanas de idade, seguida de injeção subcutânea de analgesia e um agente anti-inflamatório.Raspe o rato na região da coluna cervical e na região do pescoço no lado do peito do animal e limpe a pele exposta com um esfoliante cirúrgico Betadine e lenços umedecidos com álcool 70%. Aplique pomada nos olhos do animal e coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada cirúrgica estéril em cima de uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius sob um microscópio estéril. Encontre o ponto de pulso próximo à clavícula para localizar a veia jugular externa e use uma pequena tesoura de mola estéril para fazer uma incisão vertical na interseção do ramo caudal da mandíbula direita, o tubérculo maior do úmero e o manúbrio.Use a tesoura de mola e a pinça fina para isolar o vaso jugular e use uma linha de sutura cirúrgica estéril para ligar a extremidade distal do vaso. Em seguida, use uma microtesoura para fazer uma pequena incisão na parede do vaso e deslize um cateter especializado feito de uma agulha de calibre 21 presa a uma seringa de um mililitro cheia de solução salina no vaso. Se uma pequena quantidade de sangue entrar na agulha, a inserção foi bem-sucedida.Prenda a agulha em suas extremidades proximal e distal. Para estabilizar a coluna, coloque o animal na posição de bruços e use uma lâmina de bisturi número 15 para cortar a pele ao longo da linha média nos níveis desejados da coluna vertebral. Localize a segunda vértebra torácica pelo espigão entre as escápulas e conte para cima a partir de T2 para encontrar a vértebra C7.Disseque as camadas musculares da quinta à sétima vértebras cervicais bilateralmente para expor as facetas laterais e faça uma fenda em ambos os lados do osso vertebral lateral. Deslize os braços de aço inoxidável de um aparelho estabilizador modificado sob as facetas do processo transversal expostas e aperte os parafusos para estabilizar a coluna. Em seguida, remova cuidadosamente as lâminas C5 a C7 e coloque um pequeno pedaço de espuma de gel embebido em solução salina em cima da dura-máter exposta para mantê-la hidratada.Para criar a janela de imagem de dois fótons, coloque pequenos pedaços de espuma de gel no espaço entre os músculos e os ossos vertebrais e uma linha fina de espuma de gel entre a medula espinhal e os ossos vertebrais. Em seguida, sele a área óssea do músculo circundante com cola adesiva de tecido. A etapa mais crítica na preparação de uma janela de imagem bem-sucedida é garantir que não haja nenhum sangramento menor dentro da janela.Depois de deixar a cola secar por cerca de cinco minutos, encha uma seringa estéril de um mililitro com ágar 4% quente e dispense uma parede de ágar ao longo da borda da janela. O ágar solidificará rapidamente, mantendo-se flexível. Para obter uma imagem de linha de base, primeiro remova a espuma de gel e adicione fluido de imersão dentro da janela.Coloque o animal estabilizado na câmara escura do microscópio de dois fótons com a janela de imagem de dois fótons diretamente sob uma objetiva de baixa ampliação e abaixe a lente cuidadosamente na janela. Encha uma seringa estéril de um mililitro com 0,5 mililitros de solução de isotiocianato de rodamina B dextrana recém-preparada e conecte a seringa ao cateter. Pressione o êmbolo muito lentamente para fornecer o corante usando a ocular para identificar a área de interesse e use uma câmera de dispositivo de carga acoplada para adquirir uma imagem de campo brilhante dos padrões dos vasos sanguíneos da superfície.Em seguida, abra o software de imagem de dois fótons para ligar a energia e selecione o comprimento de onda de excitação do laser apropriado. Em seguida, selecione a potência adequada do laser de dois fótons, o nível de HV e o canal fluorescente que correspondem ao experimento de fluoróforo injetado e visualize o tecido através da janela de imagem para coletar imagens e dados de varredura de linha. Para introduzir a lesão de contusão na linha média C7, coloque o rato em um dispositivo Louisville Injury System Apparatus e selecione uma configuração de 0 ponto.Em seguida, ajuste o deslocamento do tecido e clique em executar experimento para acionar o impacto ou a liberação que cria a lesão. Em seguida, coloque um pequeno pedaço de espuma de gel embebido em solução salina em cima da dura-máter exposta para mantê-la hidratada e abra novas imagens através da janela de imagem usando os mesmos parâmetros de imagem. Transfira o animal de volta para a câmara escura e injete 0,5 mililitros de isotiocianato de fluoresceína dextrano recém-preparado no cateter.Em seguida, retorne o animal à câmara escura do microscópio e obtenha imagens em ambos os canais de fluoróforo. A injeção de corante fluorescente de rodamina dextrana permite a captura de uma imagem de referência para mapeamento da rede vascular na linha de base. Após a geração de uma lesão contusiva da linha média C7 moderadamente grave, a introdução de FITC-dextrano facilita a detecção da estrutura vascular após o vazamento induzido por lesão do primeiro corante no parênquima circundante.A imagem do vaso antes e depois da lesão também permite quantificar as alterações no diâmetro do vaso e na resposta à lesão, bem como as alterações na velocidade dos glóbulos vermelhos pré e pós-lesão através dos vasos a serem calculadas. Tomados em conjunto, esses dados podem ser usados para classificar os vasos fotografados como veias ou artérias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar artefatos respiratórios perceptíveis e tentar limitar qualquer sangramento menor dentro da janela da imagem.Este procedimento também pode ser realizado em animais transgênicos para responder a perguntas adicionais sobre as interações neurovasculares que ocorrem após a lesão medular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a microscopia de dois fótons para monitorar alterações dinâmicas vasculares agudas após uma lesão contusiva da medula espinhal em um animal vivo.

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