Name: Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a avaliar a ativação anti-inflamatória de macrófagos de medula óssea e peritoneais de camundongo induzida por drogas baseadas em anticorpos. Este método mede respostas in vitro e in vivo para estudos imunológicos.

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L.K. é o destinatário do prêmio bolsa de estudo de pós-graduação da Universidade da Colúmbia Britânica comunhão 4-ano (4YF). LMS é o destinatário de uma associação canadense de Gastroenterologia / Crohn e colite Canadá / CIHR novo investigador salário prêmio e é um estudioso biomédicas da Fundação de Michael Smith para pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto da canadense serviços de sangue, em colaboração com o canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder # CIHR2016-LS).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Colúmbia Britânica.
1. medula óssea macrófago derivação e ativação com anticorpos
<ol>
	<li>Realize eutanásia usando CO2 asfixia.<ol>
		<li>Rato de lugar na câmara de indução. Eutanásia em rato com anestesia de isoflurano 5%, para 60-90 s, até o imóvel e respirando são profundo e devagar.</li>
		<li>Desligue o isoflurano anestesia e administrar 6-8 L/min de CO2 até rato parou de respirar. Deixe mouse com CO2 pelo menos mais 5 min. verificar que não existe um batimento cardíaco ou respiração. Execute um deslocamento cervical para garantir a morte. Nota: 8-12 semanas os ratos velhos fornecem o mais alto rendimento de macrófagos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pulverizar as pernas do mouse com etanol a 70% e fixá-los com braços e pernas esticadas na posição supina sobre uma placa de espuma. Com tesoura e pinça para segurar a pele, fazer um corte superficial (0,2 cm) para remover a pele e o pelo da superfície de cada uma das patas. Nota: Execute este procedimento e todas as manipulações de cultura de tecidos em uma capa de estéril.</li>
	<li>Apare o músculo para tornar visível a tíbias e fêmures. Remova as tíbias e fêmures, cortando o osso e os músculos logo abaixo da articulação do quadril e acima dos tornozelos. Guarnição tanto músculo fora possível.</li>
	<li>Spray de ossos com etanol a 70% e esperar 1 min para que ele evaporar e, em seguida, coloque-os na chapa bem 6 do médio de descarga de osso (modificado de Iscove médio de Dulbecco (IMDM), 10% de soro fetal bovino (FBS)).</li>
	<li>Apare as pontas dos ossos por um corte 0,1 cm do osso do tornozelo e parte superior do fêmur, para que fique exposta a cavidade óssea. Certifique-se que a medula é visível e uma agulha de 26 calibre pode ser colocada na cavidade óssea.</li>
	<li>Corte os ossos e músculos para separar as tíbias e fêmures das articulações de joelho. Inserir uma agulha de 26 calibre ligada a uma seringa de 10 mL na cavidade. Descarga da medula óssea em um tubo cônico de 50 mL com 5 mL de descarga média do osso. Irrigue duas tíbias e dois fêmures, de um rato, em cada tubo de 50 mL.</li>
	<li>Pipete subindo e descendo várias vezes ou vórtice da medula a uma velocidade lenta para dispersar delicadamente aglomerados. Sequências de caracteres de medula devem ser divididas em partículas pequenas (menos de 0,5 mm) de medula óssea. Encha o tubo cónico de 50 mL com osso flush médio. Pipeta conteúdo do tubo cônico em cultura de tecido2 75cm tratados de balão e incuba a 37 ° C, 5% de CO2 por 1h. Nota: Maduros macrófagos e células mesenquimais se tornarão aderentes no balão e ser descartadas, enquanto os progenitores hematopoiéticos desejados permanecem em suspensão.</li>
	<li>Pipete médio com progenitores hematopoiéticos em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar o tubo a 300 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o em 5 mL de meio de cultura de fator (MCSF) da colônia de macrófagos (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicilina/estreptomicina e 150 μM monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Contar as células usando um hemocytometer18. Adicione meio para Ressuspender as células a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL, 1,5 x 107 células/balão em 30 mL de meio e pipetar para cima e para baixo suavemente. Pipete 30 mL da suspensão para um frasco de cultura de tecidos Tratado2 75 cm nova.</li>
	<li>No dia 4 e 7 cultura inicial na etapa 1.9, verifique se as células aderentes e ligeiramente ramificada usando um microscópio de campo claro de contraste de fase invertida. Descarte o meio contendo as células não-aderentes. Lavar as células com IMDM uma vez e adicione 30 mL de meio de cultura MCSF.</li>
	<li>Quando as células são maduras por dia 10 (&#62; 95% positivo para F4/80 e Mac-1), verifique novamente que as células são aderentes e ligeiramente.</li>
	<li>Células para estímulos da placa, retire o frasco do meio de cultura e adicionar 8 mL de tampão de dissociação de célula livre, baseada em EDTA de enzima (Tabela de materiais). Incube as celulas por 5 min a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Raspe suavemente, as células com uma pequena quantidade de pressão, com uma espátula de célula estéril. Verifique no microscópio que células tem retirado a superfície do balão. Pipete células dissociadas em um tubo cónico de 50 mL. Lavar o balão 3 vezes com 5 mL de IMDM e piscina a solução de lavagem com as células que foram colhidas. Centrifugar as células a 300 x g, à temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Ressuspender as células em 3 mL de meio de cultura MCSF por tubo cónico de 50 mL. Contagem de células viáveis usando um hemocytometer18. Ressuspender as células em uma concentração de 1 x 106 células/mL e placa 100 μL de suspensão de célula (1 x 105 células/poço) por bem de uma cultura de tecido de 96 poços tratada, placa de fundo plano. Nota: Os ossos de um rato irão gerar células suficientes para 100 poços. Se desejado, 1 mL de células pode ser revestido em uma placa de 6 (cultura de tecidos tratados, plano inferior). Um maior número de células (1 x 106 ) pode ser útil para análises de borrão ocidental.</li>
	<li>Uma vez aderentes, estimule duplicados ou triplicados poços cada com 10 ng/mL de LPS em IMDM, 30 mg/mL de IVIg, ou IVIg + LPS. Doses de LPS ou IVIg podem ser titulados para otimizar as respostas. Deixe duplicados ou triplicados poços como unstimulated controles. Incube-los durante 24 h (37 ° C, 5% CO2). Nota: Células re-chapeadas devem aderir aos poços de cultura de tecidos dentro de 1h.</li>
	<li>Coletar sobrenadantes de células de cada poço em tubos de microcentrifuga individuais 1,7 mL e remover qualquer matéria particulada girando a 10.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Remover a célula de sobrenadante e evitar perturbar a pelota. Coloque a célula esclareceu sobrenadante em um tubo estéril microcentrifuga. Nota: Sobrenadantes de células podem ser analisadas por citocinas, IL-10 e subunidade de citocinas, IL-12 / 23p 40, por ensaio imunoenzimático (ELISA) imediatamente ou armazenados no longo prazo-80 ° C. Segui o protocolo de ELISA do kit comercialmente disponível (Tabela de materiais). Outras citocinas pró-inflamatórias podem ser analisadas, tais como IL-6 e TNF, como eles também são reduzidos pelo tratamento co com IVIg + estimulação LPS em comparação com estimulação com LPS sozinhos. Após a estimulação, células aderentes podem ser preparadas por técnicas tais como a mancha ocidental ou quantitativa do polymerase reação em cadeia (Q-PCR) 19,20.</li>
</ol>
2. desafiando os ratos In Vivo com IVIg e colheita de macrófagos peritoneais
<ol>
	<li>Pese cada rato.</li></ol>Calcule o volume de IVIg (concentração de ações de 100 mg/mL) necessária para fornecer uma dose final de 2,5 g/kg de peso corporal para cada rato. Nota: por exemplo, para um rato de 20 g, 500 µ l de IVIg é necessário.
	<li>Desenhar a quantidade necessária de IVIg para uma seringa estéril 1 mL munida de uma estéril 26 medidor de agulha. Para os ratos de controle que não receberá IVIg, administre um volume de dose equivalente de solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS), pH 7,4 em vez de IVIg.</li>
	<li>Nuca o mouse com uma mão agarrando sua pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o dedo indicador e segurando sua cauda e patas com os dedos restantes. Incline seu corpo para o solo.</li>
	<li>Coloque a agulha num ângulo de 30-40° em relação ao abdômen do rato, no quadrante inferior direito, bisel para cima e insira a 1,5 cm da agulha. Injete o IVIg ou PBS intraperitonealmente. Espere 1h.</li>
	<li>Eutanásia em ratos com anestesia de isoflurano 5% seguida por 6-8 L/min de CO2 asfixia (ver passos 1.1.1 - 1.1.2), ou de acordo com as diretrizes éticas da instituição.</li>
	<li>Pin o mouse para uma placa de espuma, com membros espalhados. Pulverize as peças com etanol a 70%. Nota: Execute o procedimento em uma capa de estéril.</li>
	<li>Fazer um corte superficial na pele (0,2 cm) com uma tesoura ao longo da linha mediana do mouse, para evitar cortar a cavidade peritoneal. Puxe a pele abdominal de barriga do mouse usando a pinça, para que o revestimento da parede intacta peritoneal é visível.</li>
	<li>Encha uma seringa de 5 mL com 5 mL de PBS estéril (pH 7,4). Inserir um 25 ou 27 medidor de agulha na parte superior da cavidade do lado direito em direção ao centro do mouse com o bisel da agulha ou a esquerda acima. Nota: Coloque a agulha cuidadosamente no mouse para que você não injectar PBS para os órgãos, mas em vez disso, para o espaço peritoneal.</li>
	<li>Empurra o líquido na cavidade peritoneal. Puxe a agulha para fora da cavidade e massagem do peritônio por 10 s para desalojar todas as células. Insira a agulha na parte superior da cavidade e evitar os órgãos. Recolher e colocar o fluido de lavagem recuperado em um tubo cônico de 15 mL no gelo. Nota: Para cada 5 mL de fluido injetado, aproximadamente 3,75 mL será recuperado.</li>
	<li>Repita a injeção e recuperação (etapas 2,8-2,9) 3 mais vezes (volume total de injeção de 20 mL), para recuperar 15 mL de líquido de lavagem no total. Colete lavagem de cada rato em um tubo cônico de 15ml separado. Nota: Após a última injeção, pode ser mais fácil extrair o líquido dos lados distante esquerdos e direito do mouse, onde líquido acumulado. Os órgãos causará menor interferência com a agulha nessa posição.</li>
	<li>Girar as células para baixo a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 500 µ l de meio de chapeamento (IMDM, 10% FBS e 100 U/mL penicilina/estreptomicina) por rato liberado. Contagem de macrófagos viáveis usando um hemocytometer18. Nota: Os macrófagos será ligeiramente maiores do que as outras células peritoneais. Rendimento típico é de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/rato usando um mouse de C57BL/6 tipo selvagem. Opcional: Se um grande número de células vermelhas do sangue está presente no centrifugado, execute uma etapa de Lise para removê-los, usando a Lise 1 x células vermelhas do sangue, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Ressuspender as células em chapeamento médio em macrófagos de 1 x 10 6/mL e 100 μL por poço em uma placa de cultura de tecido tratada de fundo plano 96 poços da placa. Nota: Pode ser necessário para o pool de células de mais de um mouse para um experimento se usando triplicata poços ou estimulantes tituladas. Por exemplo, se um rato tinha 5 x 105 macrófagos, 500 μL de chapeamento médio seria necessária. Haveria células suficientes para 5 poços, ou 1 experimento em duplicado, com uma dose de LPS.</li>
	<li>Incubar as células para 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se tornar aderente. As células aderentes são os macrófagos peritoneais. Remova sobrenadantes de células e células não-aderentes. Lavar os poços duas vezes com 200 μL IMDM (pré aquecido a 37 ° C), esperar 10 s e lentamente incline o prato. Substitua o meio de chapeamento. Incube as células a 37 ° C, 5% de CO2 por 30 min antes da estimulação.</li>
	<li>Estimular os macrófagos com 10 ng/mL de LPS em IMDM, ou deixar unstimulated, como um controle. Incubar durante 24 h, recolher e clarificar os sobrenadantes de célula (ver passos 1.16-1,17) para análise de citocinas IL-10 por ELISA. Segui o protocolo de ELISA do kit comercialmente disponível (Tabela de materiais). Nota: Após a estimulação, células aderentes podem ser preparadas por técnicas como borrão ocidental ou PCR.</li>

3. desafiando os ratos in Vivo com IVIg + LPS e colheita de macrófagos peritoneais
<ol>
	<li>Pese cada rato. Calcule o volume de IVIg (concentração de ações de 100 mg/mL) necessária para fornecer uma dose final de 2,5 g/kg de peso corporal. Calcule a quantidade de LPS (concentração de 100 μg/mL estoque na IMDM) necessária para fornecer uma dose final de 0,2 μg/g de massa corporal. Nota: por exemplo, para um rato de 20 g, 500 µ l de solução-mãe de IVIg e 40 μL de uma solução de 100 μg/mL de LPS é necessários.</li>
	<li>Desenhe a quantidade necessária de IVIg e LPS em uma seringa de 1ml estéril, equipado com um estéril 26 medidor de agulha. Para os ratos de controle que não receberá IVIg, substitua uma quantidade equivalente de IVIg com pH de PBS estéril 7,4.</li>
	<li>Nuca o mouse com uma mão agarrando sua pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o dedo indicador e segurando sua cauda e patas com os dedos restantes. Incline seu corpo para o solo.</li>
	<li>Lugar a agulha em um ângulo de 30-40° em relação ao abdômen do rato, no quadrante inferior direito, chanfrado e inserir a 1,5 cm. Injete o IVIg + LPS, ou PBS + LPS, intraperitonealmente, como na etapa 2.4.</li>
	<li>Depois de 1h, colheita de macrófagos peritoneais executando etapas 2.5-2.10.</li>
	<li>Girar as células para baixo a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Retire 1 mL de líquido de lavagem recuperados e usar para IL-10 e IL-12/23-p 40 análises por ELISA de acordo com as instruções do fabricante ou congelar a-80 ° C para futuras análises. Nota: Para garantir a exata comparação entre tratamentos para análise de citocinas fluido de lavagem, execute flushs 5ml da cavidade peritoneal 4 vezes para um volume final de 15 mL. Nem todos os fluidos serão recuperados de cada descarga.</li>
	<li>Como na etapa 2.11, resuspenda e contar os macrófagos viáveis. Nota: Os macrófagos será ligeiramente maiores do que as outras células peritoneais.</li></ol>Rendimento típico é de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/rato usando um mouse de C57BL/6 tipo selvagem. Opcional: Se um grande número de células vermelhas do sangue está presente no centrifugado, execute uma etapa de lise de acordo com as instruções do fabricante para removê-los, como na etapa 2.11.
	<li>Como na etapa 2.12, re-suspenda as células no chapeamento médio. Nota: Pode ser necessário para as células do pool de mais de um mouse para um experimento. Por exemplo, se um rato tinha 5 x 105 macrófagos, 500 μL de chapeamento médio seria necessária.</li>
	<li>Como em 2.13, incubar as células para 1 h a 37 ° C 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se tornar aderente.</li>
	<li>Coletar e clarificar meio condicionado, conforme etapas 1.14-1,15, de todas as células peritoneais. Nota: As amostras podem ser usadas imediatamente ou congeladas e armazenadas a-80 ° C para análise de citocinas por ELISA.</li>
	<li>Executar etapa 2.11, mas incubar células para unstimulated 24 h. Coletar e clarificar os sobrenadantes de células, como por etapas 1.16-1.17, para análise de citocinas por ELISA. Nota: As células podem ser preparadas para técnicas como borrão ocidental ou PCR, como em etapas 1.16-1.17 e 2.14.</li>

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Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Estados de ativação de macrófagos desempenham um papel importante em ambos de homeostase e doença do tecido22. Os macrófagos podem ter distintas bem como sobreposição de Estados de ativação, dependendo de pistas em seu microambiente3. Eles têm papéis distintos em todas as fases da resposta inflamatória: defesa contra patógenos, ferida restituição cura e tecido, e também tem um estado de ativação anti-inflamatórios distintos que é importante para desligar a resposta inflamat...

Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas, que desempenham várias funções na resposta imune à infecção ou lesão. Os macrófagos são responsáveis por iniciar uma resposta imune a danos de infecção ou tecido, parando a resposta inflamatória e promover a cura de resposta1. Exemplos dos três Estados-ativação melhor estudados macrófago são: 1) macrófagos tratados com interferon gama (relato) e bacteriano lipopolissacarídeo (LPS), designado M (relato + LPS), que contribuem para a resposta inflamatória; 2) macrófagos estimulados com interleucina 4 (IL-4), M(IL-4), que são associados com a resposta de cura; 3) macrófagos estimulados com complexos imunes (IC) e LPS, M (IC + LPS), que têm a capacidade de desligar a resposta inflamatória2,3. M (IC + LPS) são distinto dos macrófagos de cicatrização de feridas M(IL-4) e não expressam a arginase enzima (Arg-1) ou FIZZ14. O melhor marcador para estes macrófagos anti-inflamatórios é a produção de citocinas5. Os macrófagos têm várias funções na manutenção da saúde, mas também contribuam para doenças inflamatórias e câncer3. Por causa disso, os macrófagos são um chave alvo terapêutico para o tratamento de uma ampla variedade de doenças. É importante investigar os efeitos dos anticorpos sobre seu estado de ativação para desenvolver tratamentos baseados em macrófagos para doença.
O foco deste artigo é sobre o uso de murino medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e macrófagos peritoneais para testar o efeito de drogas de anticorpo em respostas inflamatórias em vitro e em vivo. Recentemente, tem havido vários estudos mostrando os efeitos dos anticorpos na ativação de macrófagos a6,7,8. Macrófagos ativados conjuntamente com complexos imunes, que são anticorpos complexos com um antígeno e LPS, um estímulo inflamatório normalmente, produzem níveis muito elevados de citocinas anti-inflamatórias, IL-10 e níveis muito baixos das citocinas pró-inflamatórias, Interleucina 12 (IL-12)9. Além disso, infliximab, um anticorpo monoclonal contra TNFa, verificou-se a trabalhar, em parte, através da indução de anti-inflamatórios macrófagos através de seu fragmento cristalizável (Fc) região7. Informamos que IVIg + LPS induzem ativação de macrófagos anti-inflamatório que é semelhante a M (IC + LPS), onde os macrófagos co estimulados produzem grandes quantidades de IL-10 e quantidades baixas da subunidade de citocina pró-inflamatória interleucina 12 ou 23 p40 ( Il-12/23p40), interleucina-6 (IL-6) e TNF8. IVIg é um fármaco composto por Anticorpos policlonais, principalmente IgG, que tem sido em pool de sangue de mais de 1.000 doadores10. Ele é usado para tratar uma ampla variedade de doenças imunológicas, tais como Púrpura Trombocitopênica Idiopática e polineuropatia desmielinizante crônica, mas seu mecanismo de ação não é completamente compreendido,11. Os efeitos das drogas do anticorpo com base na ativação de macrófagos podem ser avaliados usando os métodos descritos neste documento.
Os efeitos de produtos biológicos específicos na ativação de macrófagos podem ser testados em BMDMs e macrófagos peritoneais. Usar essas fontes macrófago permite avaliação de células primárias. Testes preliminares de anticorpos em culturas primárias de células requer menos tempo e investimento monetário do que outros modelos de doença demorado e caro. Injetar uma droga em um rato saudável na vivoe isolando as células e analisando-os ex vivo, pode-se determinar se os estudos são garantidos para avaliar se o tratamento com produtos biológicos afeta a ativação de macrófagos em modelos de doenças.
Com alguns estudos que testam o efeito das terapias biológicas na ativação de macrófagos in vitro e em vivo diretamente, nossas técnicas fornecem uma vantagem sobre técnicas alternativas. As técnicas atuais envolvem testes efeitos de drogas biológicas na célula mista populações em vitro, tais como o efeito de infliximab em uma reação linfocitária mista (MLR) ou IVIg em macrófagos humanos em células mononucleares do sangue periférico, onde o efeito Não pode ser atribuída a um tipo de célula específica7,12. Usar BMDMs e macrófagos peritoneais é vantajoso sobre usando linhas de células, como células RAW264.7, que não produzem a citocinas pró-inflamatórias, IL-12, em resposta a LPS8,13. Testar o efeito de uma droga baseada em anticorpos no macrófago respostas ex vivo tem vantagens porque o cytokine respostas podem ser atribuídas diretamente aos macrófagos, ao invés de inferir respostas macrófago medindo os níveis séricos de citocinas14 . BMDMs e macrófagos peritoneais podem ser derivados e isolados de ratos geneticamente modificados para determinar o papel específico de uma proteína na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Por exemplo, nós usamos Il10 deficiente(- / -) BMDMs para demonstrar que IVIg-induzido redução da produção de citocinas pró-inflamatórias é parcialmente dependente da IL-108. Mecanismo de uma droga de ação pode ser investigado usando mancha ocidental, onde o papel de proteínas específicas e sinalização de eventos pode ser determinado. Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) podem ser executada em BMDMs ou macrófagos peritoneais para mostrar os padrões de expressão gênica que resultam da ativação de anticorpos. Modelos de doenças em camundongos podem fornecer informações sobre a potencial eficácia de terapias biológicas anticorpo-baseado em modelos para as doenças inflamatórias intestinais doenças, artrite reumatoide e câncer15,16, 17. no entanto, as técnicas descritas aqui irão fornecer informações sobre o mecanismo de ação destes produtos biológicos, determinando se eles induzem a atividade do macrófago anti-inflamatórios.

<table><tbody><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado » s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fator estimulador de colônias de macrófagos murinos recombinantes (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de dissociação celular</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Lipopolissacarídeo EDTA (LPS) sem enzimas, à base de Hanks,</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>De E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Recebido do BC Children's Hospital, Medicina Transfusional</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (líquido Gammagard)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Recebido do BC Children's Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Recebido do BC Children's Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (estéril), pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>camundongo IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>camundongo IL-12 / 23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Erk1 / 2</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-pp38</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g agulha</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 10 mL</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 15 mL</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 50 mL</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga (1,7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 frasco tratado com cultura de tecidos</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>ponta fina, dissecante&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicada, 4 1/2"</td></tr><tr><td>Microscópio de campo claro</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Escala de contraste de fase invertida</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mettler&nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas fagocíticas, iniciar respostas imunes a agentes patogénicos e contribuir para a restituição de cura e de tecido. Os macrófagos são igualmente importantes em desligar respostas inflamatórias. Mostramos que os macrófagos estimulados com imunoglobulina intravenosa (IVIg) podem produzir grandes quantidades das citocinas anti-inflamatórias, interleucina 10 (IL-10) e baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias em resposta a lipopolissacarídeo bacteriano ( LPS). IVIg é que um anticorpo polivalente, principalmente imunoglobulina Gs (IgGs), pool de plasma de mais de 1.000 doadores de sangue. É usado para complementar os anticorpos em pacientes com deficiências imunológicas ou suprimir a resposta imune em pacientes com doenças auto-imunes ou inflamatórias. Infliximab, um anticorpo de alfa (TNFa) terapêutica anti-tumor necrose fator, também foi mostrado para ativar os macrófagos a produzir IL-10 em resposta a estímulos inflamatórios. IVIg e outros produtos biológicos baseados em anticorpo podem ser testados para determinar seus efeitos na ativação de macrófagos. Este artigo descreve métodos para derivação, estimulação e avaliação de medula murino macrófagos ativados por anticorpos em vitro e macrófagos peritoneais murino, ativados com anticorpos em vivo. Finalmente, vamos mostrar o uso da mancha ocidental para determinar a contribuição da célula específica, sinalização de caminhos para a atividade do macrófago anti-inflamatórios. Esses protocolos podem ser usados com ratos geneticamente modificados, para determinar o efeito de um somáticas específicas na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Essas técnicas também podem ser usadas para avaliar se os produtos biológicos específicos podem agir alterando os macrófagos para um estado de ativação anti-inflamatórias IL-10-produzindo que reduz respostas inflamatórias em vivo. Isso pode fornecer informações sobre o papel da ativação de macrófagos na eficácia de produtos biológicos durante modelos de doenças em camundongos e fornecer informações sobre um novo mecanismo de potencial de ação nas pessoas. Por outro lado, isto pode advertir contra o uso de produtos biológicos de baseados em anticorpos específicos para tratar doenças infecciosas, particularmente se os macrófagos desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra a infecção.

Murino osso medula derivada de macrófagos podem ser cultivados de precursores de células hematopoiéticas em aspirados de medula óssea. Aspirados de medula óssea em pool de fêmures e tíbias de um rato C57BL/6 normalmente rendem 107 medula óssea derivada macrófagos, tornando-os uma fonte conveniente de macrófagos para experimentos. BMDMs podem ser usados para testar respostas de droga do anticorpo baseado quando desafiados com um estímulo inflamatório em vitro. <strong c...

Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

O objetivo geral desses experimentos é determinar os efeitos de drogas baseadas em anticorpos nos estados de ativação de macrófagos anti-inflamatórios usando medula óssea de camundongo e macrófagos peritoneais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, tais como, se os medicamentos de anticorpos específicos agem alterando os macrófagos para um estado de ativação anti-inflamatória produtor de IL-10. A principal vantagem desta técnica é que ela mede a resposta de macrófagos primários de camundongos da medula óssea in vitro e da cavidade peritoneal in vivo.Execute este procedimento em um capuz estéril. Prenda um rato sacrificado em decúbito dorsal em uma placa de espuma com os membros estendidos. Em seguida, limpe as pernas com etanol 70%.Em seguida, faça um corte raso com cerca de dois milímetros de profundidade para remover a pele e o pelo da superfície de cada pata traseira. Em seguida, disseque os tecidos para acessar as tíbias e fêmures. Para remover as tíbias e fêmures, corte o osso e os músculos logo abaixo da articulação do quadril e acima dos tornozelos.Em seguida, remova o máximo possível do tecido muscular dos ossos. Em seguida, limpe os ossos com etanol a 70% e deixe evaporar por um minuto. Em seguida, coloque os ossos em um prato de seis poços cheio de meio de carne óssea.Na placa, apare um milímetro de cada extremidade dos fêmures para que suas cavidades internas fiquem expostas. Certifique-se de que uma agulha de calibre 26 possa acessar as cavidades. Em seguida, separe a tíbia e o fêmur da articulação do joelho.Em seguida, insira a agulha presa a uma seringa de 10 mililitros em uma cavidade óssea e colete a medula óssea. Puxe a medula óssea de todos os quatro ossos para um tubo cônico de 50 mililitros com cinco mililitros de meio de carne óssea. Canalize o meio e a medula para cima e para baixo várias vezes.Ou vórtice em baixa velocidade para dispersar suavemente os aglomerados na suspensão. Os fios de medula devem ser quebrados em pequenas manchas de medula com menos de meio milímetro de comprimento. Em seguida, complete o tubo para 50 mililitros com meio de carne óssea e transfira-o para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados.Incube a medula óssea por uma hora. Durante a incubação, as células amadurecidas aderirão ao frasco e os progenitores hematopoiéticos desejados permanecerão em suspensão. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros e gire as células em um pellet.Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de cultura MCSF. Em seguida, ajuste a densidade da célula para 500.000 por mililitro e carregue 30 mililitros em um novo frasco de 75 centímetros quadrados. Continue cultivando as células e, nos dias quatro, sete e 10, verifique se as células estão aderentes e ligeiramente ramificadas usando um microscópio de campo de quebra de contraste de fase invertida.Ao verificar as células, descarte o meio que contém as células não aderentes. Em seguida, lave as células aderentes com IMDM uma vez e adicione 30 mililitros de meio de cultura MCSF fresco de volta ao frasco. No dia 10, substitua o meio por oito mililitros de tampão de dissociação celular à base de EDTA sem enzimas para coletar as células.Incube as células brevemente, depois raspe as células suavemente e verifique se elas foram liberadas usando um microscópio. Assim que as células forem liberadas, transfira o tampão com as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, enxágue o frasco três vezes com cinco mililitros de IMDM para coletar mais células.Puxe todas as coleções, centrifugue-as e ressuspenda o pellet em três mililitros de MCSF. Agora, conte as células e ajuste sua concentração para um milhão por mililitro. Em seguida, coloque 100 microlitros de suspensão de células por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços.O prato inteiro deve ser preenchível. Cultive as células por cerca de uma hora até que estejam aderentes. Em seguida, estimule-os com diferentes concentrações de LPS ou imunoglobulina intravenosa ou ambos preparados no IMDM.Execute todas as manipulações em duplicata ou triplicada e certifique-se de manter os controles não tratados. Em seguida, incubar as células por 24 horas e analisar os sobrenadantes. Prepare uma seringa de um mililitro com a quantidade necessária de imunoglobulina intravenosa e LPS e coloque uma agulha de calibre 26.Para controles, use PBS mais LPS. Segure o rato pela nuca enquanto prende os quartos traseiros e a cauda com uma mão. Mire no quadrante inferior direito do abdômen e insira a agulha em um ângulo de 30 a 40 graus com o chanfro para cima e insira-a cerca de 1,5 centímetros.Em seguida, injete o bolo alimentar. Depois de uma hora, colha macrófagos peritoneais após a eutanásia do camundongo. Em um capuz estéril, prenda o camundongo sacrificado a uma placa de espuma com os membros espalhados e esterilize o abdômen com etanol a 70%.Em seguida, faça uma incisão rasa de dois milímetros ao longo da linha média e retire a pele abdominal. Evite perfurar a parede peritoneal. Em seguida, carregue totalmente uma seringa de cinco mililitros com PBS estéril a pH 7,4 e injete o camundongo usando uma agulha de calibre 25 ou 27, na parte superior da cavidade peritoneal, de ambos os lados, em direção à linha média, com o chanfro da agulha para cima.Depois de puxar a agulha para fora, massageie o peritônio por 10 segundos para desalojar as células. Agora, insira a agulha novamente, de volta na cavidade, e colete cerca de 3,75 mililitros de fluido de lavagem. Transfira o fluido de lavagem para um tubo cônico de 15 mililitros no gelo.Repita a injeção, massagem e coleta de fluido de lavagem mais três vezes e puxe todas as coleções para o mesmo tubo. Durante a coleta final, pode ser mais fácil retirar o fluido de lavagem do outro lado do mouse. Em seguida, gire as células e ressuspenda-as em 500 microlitros de meio de revestimento.Em seguida, conte os macrófagos viáveis e ressuspenda-os a um milhão por mililitro. Agora, coloque 100 microlitros de suspensão nos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, incube as células por uma hora.Os macrófagos peritoneais irão aderir à placa. Em seguida, remova as células não aderentes e enxágue cada poço duas vezes com 200 microlitros de IMDM quente. Após cada lavagem, aguarde 10 segundos e incline lentamente a placa para puxar a solução de enxágue.Após as lavagens, adicione novamente 100 microlitros de meio de revestimento e coloque a placa na incubadora. Para o ELISA, continue a incubar as células sem estimulação por 24 horas. Em seguida, colete e esclareça o meio condicionado para análise de citocinas.Os BMDMs podem ser usados para testar respostas a medicamentos baseados em anticorpos quando desafiados com um estímulo inflamatório in vitro. A imunoglobulina intravenosa com LPS aumenta a produção da citocina anti-inflamatória IL-10, sete vezes, em comparação com a estimulação do LPS isoladamente. E diminui a produção de IL-12 / 23p40.Além disso, a estimulação intravenosa com imunoglobulina isolada ou com LPS aumentou a ativação da MAP quinase ERK1/2, com fosforilação precoce e prolongada. A ativação do P-38 também ocorreu antes. Além disso, os macrófagos peritoneais aumentaram significativamente a produção de IL-10 com estimulação in vitro, quando comparados aos camundongos injetados com PBS.A produção de citocinas foi avaliada em seguida no fluido de lavagem e em sobrenadantes de macrófagos peritoneais estimulados ex vivo. A IL-10 foi aumentada no fluido de lavagem, células peritoneais e macrófagos peritoneais quando os camundongos são desafiados com imunoglobulina intravenosa e LPS. Em comparação, a produção da subunidade de citocina pró-inflamatória IL-12 / 23p40 foi significativamente reduzida em macrófagos peritoneais cultivados, mas não no fluido de lavagem.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar os efeitos de medicamentos baseados em anticorpos nos estados de ativação de macrófagos in vitro e in vivo usando medula óssea de camundongo e macrófagos peritoneais.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar...

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Neste vídeo, demonstramos a ativação de macrófagos derivados da medula óssea em resposta ao lipopolissacarídeo bacteriano e imunoglobulina intravenosa.

Ativação de macrófagos derivados de medula óssea de camundongo em resposta a anticorpos

Este vídeo demonstra a ativação dos macrófagos peritoneais de um camundongo usando imunoglobulina intravenosa e lipopolissacarídeo bacteriano. A co-estimulação ativa os macrófagos peritoneais em macrófagos anti-inflamatórios que possuem atividade imunorreguladora.

Ativação in vivo de macrófagos peritoneais em resposta a anticorpos em modelo murino

Neste vídeo, demonstramos o efeito de diferentes concentrações de anticorpos anti-c-fms na osteoclastogênese, que é o processo de formação de osteoclastos a partir de progenitores de osteoclastos.

Efeito do anticorpo anti-C-fms na osteoclastogênese em células da medula óssea de camundongos in vitro

Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Este protocolo inclui a dissecação de murino de ossos longos e isolamento de medula óssea, para gerar os macrófagos da medula óssea e produzir osteoclastos usando macrófago da colônia fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante fator nuclear Kappa-B (RANKL) ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a sua detenção por anticorpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Efeito de anticorpo Anti-c-fms Osteoclast formação e proliferação de Osteoclast Precursor In Vitro

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Dendríticas células antígenos captação e migrar para órgãos imunes a antígenos presentes processados ​​às células T. Qdot nanocristais rotulagem fornece um sinal duradouro e estável fluorescente. Este permite o rastreamento de células dendríticas a diferentes órgãos, por microscopia fluorescente.

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Aprenda a avaliar a ativação anti-inflamatória de macrófagos de medula óssea e peritoneais de camundongo induzida por drogas baseadas em anticorpos. Este método mede respostas in vitro e in vivo para estudos imunológicos.

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

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