Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

O objetivo geral desses experimentos é determinar os efeitos de drogas baseadas em anticorpos nos estados de ativação de macrófagos anti-inflamatórios usando medula óssea de camundongo e macrófagos peritoneais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, tais como, se os medicamentos de anticorpos específicos agem alterando os macrófagos para um estado de ativação anti-inflamatória produtor de IL-10. A principal vantagem desta técnica é que ela mede a resposta de macrófagos primários de camundongos da medula óssea in vitro e da cavidade peritoneal in vivo.

Execute este procedimento em um capuz estéril. Prenda um rato sacrificado em decúbito dorsal em uma placa de espuma com os membros estendidos. Em seguida, limpe as pernas com etanol 70%.

Em seguida, faça um corte raso com cerca de dois milímetros de profundidade para remover a pele e o pelo da superfície de cada pata traseira. Em seguida, disseque os tecidos para acessar as tíbias e fêmures. Para remover as tíbias e fêmures, corte o osso e os músculos logo abaixo da articulação do quadril e acima dos tornozelos.

Em seguida, remova o máximo possível do tecido muscular dos ossos. Em seguida, limpe os ossos com etanol a 70% e deixe evaporar por um minuto. Em seguida, coloque os ossos em um prato de seis poços cheio de meio de carne óssea.

Na placa, apare um milímetro de cada extremidade dos fêmures para que suas cavidades internas fiquem expostas. Certifique-se de que uma agulha de calibre 26 possa acessar as cavidades. Em seguida, separe a tíbia e o fêmur da articulação do joelho.

Em seguida, insira a agulha presa a uma seringa de 10 mililitros em uma cavidade óssea e colete a medula óssea. Puxe a medula óssea de todos os quatro ossos para um tubo cônico de 50 mililitros com cinco mililitros de meio de carne óssea. Canalize o meio e a medula para cima e para baixo várias vezes.

Ou vórtice em baixa velocidade para dispersar suavemente os aglomerados na suspensão. Os fios de medula devem ser quebrados em pequenas manchas de medula com menos de meio milímetro de comprimento. Em seguida, complete o tubo para 50 mililitros com meio de carne óssea e transfira-o para um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados.

Incube a medula óssea por uma hora. Durante a incubação, as células amadurecidas aderirão ao frasco e os progenitores hematopoiéticos desejados permanecerão em suspensão. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros e gire as células em um pellet.

Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de cultura MCSF. Em seguida, ajuste a densidade da célula para 500.000 por mililitro e carregue 30 mililitros em um novo frasco de 75 centímetros quadrados. Continue cultivando as células e, nos dias quatro, sete e 10, verifique se as células estão aderentes e ligeiramente ramificadas usando um microscópio de campo de quebra de contraste de fase invertida.

Ao verificar as células, descarte o meio que contém as células não aderentes. Em seguida, lave as células aderentes com IMDM uma vez e adicione 30 mililitros de meio de cultura MCSF fresco de volta ao frasco. No dia 10, substitua o meio por oito mililitros de tampão de dissociação celular à base de EDTA sem enzimas para coletar as células.

Incube as células brevemente, depois raspe as células suavemente e verifique se elas foram liberadas usando um microscópio. Assim que as células forem liberadas, transfira o tampão com as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, enxágue o frasco três vezes com cinco mililitros de IMDM para coletar mais células.

Puxe todas as coleções, centrifugue-as e ressuspenda o pellet em três mililitros de MCSF. Agora, conte as células e ajuste sua concentração para um milhão por mililitro. Em seguida, coloque 100 microlitros de suspensão de células por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços.

O prato inteiro deve ser preenchível. Cultive as células por cerca de uma hora até que estejam aderentes. Em seguida, estimule-os com diferentes concentrações de LPS ou imunoglobulina intravenosa ou ambos preparados no IMDM.

Execute todas as manipulações em duplicata ou triplicada e certifique-se de manter os controles não tratados. Em seguida, incubar as células por 24 horas e analisar os sobrenadantes. Prepare uma seringa de um mililitro com a quantidade necessária de imunoglobulina intravenosa e LPS e coloque uma agulha de calibre 26.

Para controles, use PBS mais LPS. Segure o rato pela nuca enquanto prende os quartos traseiros e a cauda com uma mão. Mire no quadrante inferior direito do abdômen e insira a agulha em um ângulo de 30 a 40 graus com o chanfro para cima e insira-a cerca de 1,5 centímetros.

Em seguida, injete o bolo alimentar. Depois de uma hora, colha macrófagos peritoneais após a eutanásia do camundongo. Em um capuz estéril, prenda o camundongo sacrificado a uma placa de espuma com os membros espalhados e esterilize o abdômen com etanol a 70%.

Em seguida, faça uma incisão rasa de dois milímetros ao longo da linha média e retire a pele abdominal. Evite perfurar a parede peritoneal. Em seguida, carregue totalmente uma seringa de cinco mililitros com PBS estéril a pH 7,4 e injete o camundongo usando uma agulha de calibre 25 ou 27, na parte superior da cavidade peritoneal, de ambos os lados, em direção à linha média, com o chanfro da agulha para cima.

Depois de puxar a agulha para fora, massageie o peritônio por 10 segundos para desalojar as células. Agora, insira a agulha novamente, de volta na cavidade, e colete cerca de 3,75 mililitros de fluido de lavagem. Transfira o fluido de lavagem para um tubo cônico de 15 mililitros no gelo.

Repita a injeção, massagem e coleta de fluido de lavagem mais três vezes e puxe todas as coleções para o mesmo tubo. Durante a coleta final, pode ser mais fácil retirar o fluido de lavagem do outro lado do mouse. Em seguida, gire as células e ressuspenda-as em 500 microlitros de meio de revestimento.

Em seguida, conte os macrófagos viáveis e ressuspenda-os a um milhão por mililitro. Agora, coloque 100 microlitros de suspensão nos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, incube as células por uma hora.

Os macrófagos peritoneais irão aderir à placa. Em seguida, remova as células não aderentes e enxágue cada poço duas vezes com 200 microlitros de IMDM quente. Após cada lavagem, aguarde 10 segundos e incline lentamente a placa para puxar a solução de enxágue.

Após as lavagens, adicione novamente 100 microlitros de meio de revestimento e coloque a placa na incubadora. Para o ELISA, continue a incubar as células sem estimulação por 24 horas. Em seguida, colete e esclareça o meio condicionado para análise de citocinas.

Os BMDMs podem ser usados para testar respostas a medicamentos baseados em anticorpos quando desafiados com um estímulo inflamatório in vitro. A imunoglobulina intravenosa com LPS aumenta a produção da citocina anti-inflamatória IL-10, sete vezes, em comparação com a estimulação do LPS isoladamente. E diminui a produção de IL-12 / 23p40.

Além disso, a estimulação intravenosa com imunoglobulina isolada ou com LPS aumentou a ativação da MAP quinase ERK1/2, com fosforilação precoce e prolongada. A ativação do P-38 também ocorreu antes. Além disso, os macrófagos peritoneais aumentaram significativamente a produção de IL-10 com estimulação in vitro, quando comparados aos camundongos injetados com PBS.

A produção de citocinas foi avaliada em seguida no fluido de lavagem e em sobrenadantes de macrófagos peritoneais estimulados ex vivo. A IL-10 foi aumentada no fluido de lavagem, células peritoneais e macrófagos peritoneais quando os camundongos são desafiados com imunoglobulina intravenosa e LPS. Em comparação, a produção da subunidade de citocina pró-inflamatória IL-12 / 23p40 foi significativamente reduzida em macrófagos peritoneais cultivados, mas não no fluido de lavagem.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar os efeitos de medicamentos baseados em anticorpos nos estados de ativação de macrófagos in vitro e in vivo usando medula óssea de camundongo e macrófagos peritoneais.