Métodos de purificação de biomoléculas baseados em cromatografia

"Cromatografia" refere-se a uma ampla gama de métodos usados para isolar um componente de uma mistura complexa, uma etapa essencial antes que as propriedades e atividades de uma biomolécula possam ser determinadas. Cada técnica cromatográfica tem um mecanismo diferente de separação, dependendo da matriz da amostra e do composto alvo. Este vídeo se concentrará nos princípios e na operação de dois métodos comuns à bioquímica: cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade.

A cromatografia de exclusão por tamanho ou SEC é baseada no tamanho dos compostos na amostra. Uma fase móvel contendo a amostra é adicionada a uma coluna com um material poroso: a fase estacionária. As moléculas na amostra se enquadram em 1 de 3 categorias.

Moléculas grandes demais para entrar nos poros percorrem a menor distância através da coluna. Qualquer espécie com peso molecular acima desse "limite de exclusão" sairá da coluna ao mesmo tempo. Moléculas pequenas o suficiente para entrar livremente nos poros serão retidas por mais tempo e sairão da coluna juntas. O peso molecular que permite a entrada completa dos poros é o "limite de permeação".

Apenas as moléculas entre esses limites serão separadas umas das outras, pois passam quantidades variadas de tempo se difundindo para dentro e para fora dos poros. Moléculas menores são retidas por mais tempo na coluna porque passam mais tempo na fase estacionária, enquanto moléculas maiores dentro desses limites saem mais cedo.

Os pesos moleculares em 1 a 2 ordens de magnitude estão dentro desses limites. As colunas são escolhidas com isso em mente, ou várias colunas podem ser usadas em série se houver uma ampla gama de compostos desejados.

Agora que você viu a teoria da SEC, vamos ver como ela é realizada.

Para iniciar o procedimento SEC, a coluna deve ser equilibrada com água deionizada e tampão cromatógrafo. Uma vez preparado, o tampão contendo a amostra é injetado na coluna. O buffer é então empurrado a uma baixa taxa de fluxo. Um detector monitora o que sai da coluna para determinar a presença do analito desejado. Moléculas grandes com pesos moleculares acima do limite de exclusão saem da coluna ao mesmo tempo. Pequenas frações da coluna são coletadas em tubos. Cada fração é testada quanto à qualidade da molécula-alvo por eletroforese em gel ou outras técnicas analíticas.

Agora vamos dar uma olhada na cromatografia de afinidade ou AC, uma das maneiras mais eficientes de purificar proteínas. Muitas biomoléculas se ligam seletivamente a certos ligantes - uma propriedade que a AC utiliza aderindo um ligante específico do alvo à fase estacionária.

Quando a mistura flui através da coluna, as moléculas-alvo se ligam ao ligante e o restante flui. Depois que a mistura passou pela coluna, a molécula alvo pode ser coletada por meio de um dos dois métodos de eluição com base na especificidade.

Pode-se dizer que a eluição bioespecífica tem um "papel normal" ou "reverso". Na eluição bioespecífica de função normal, é adicionado um agente que compete com o ligante aderido para se ligar à biomolécula alvo.

Na eluição bioespecífica de função reversa, um agente compete com o alvo para se ligar ao ligante aderido. O segundo tipo de eluição, eluição não específica, reduz a ligação alvo-ligante alterando o pH, a força iônica ou a polaridade da solução. Se uma proteína não se liga a um ligante que pode ser imobilizado, a proteína pode ser expressa contendo uma "tag": sequências curtas de peptídeos projetadas para se ligar ao ligante.

Uma variedade é a cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados, "IMAC" para abreviar, onde um ligante metálico aderido, como níquel ou cobalto, se liga a resíduos de histidina na proteína modificada. Por meio de técnicas de biologia molecular, as proteínas-alvo são geradas com resíduos repetidos de histidina, chamados de etiqueta de poli-histidina, que se liga ao metal por meio da cadeia lateral do imidazol na histidina. Uma vez ligada, a proteína pode ser coletada com imidazol livre por meio de eluição específica de função reversa e posteriormente usada em uma ampla variedade de aplicações a jusante. Agora que você viu a teoria da cromatografia de afinidade, vamos dar uma olhada em um procedimento IMAC no laboratório.

No IMAC, a fase estacionária pode ser adicionada diretamente à mistura de fase móvel e amostra, permitindo a ligação da proteína marcada com his. Essa pasta é então despejada na coluna, onde os compostos não ligados pingam nos resíduos, enquanto a pasta permanece. O recipiente de chorume é enxaguado para coletar resina residual e amostra, que é adicionada à coluna.

A resina é agitada para garantir que os componentes não ligados fluam livremente. O tampão de lavagem adicionado ajuda a lavá-los. Uma vez que todos os componentes não ligados tenham sido removidos, os resíduos são substituídos por um recipiente para coletar a proteína alvo.

O tampão contendo imidazol é adicionado, agitado e deixado em repouso para desvincular a molécula alvo. O imidazol se liga ao metal, substituindo e liberando a proteína marcada. A proteína liberada é coletada e a etapa do imidazol é repetida para garantir a coleta total. Para purificar ainda mais a amostra, o SEC pode ser executado na amostra antes da análise.

Agora que vimos a teoria e o procedimento dessas duas técnicas, vejamos algumas das maneiras pelas quais elas são aplicadas no campo bioquímico.

Uma razão comum para purificar proteínas é estudar seu papel na doença. A fibrose cística é causada por defeitos na proteína reguladora da condutância transmembrana da fibrose cística, ou CFTR. Após o cultivo da proteína com uma marca his em levedura, tanto a cromatografia de afinidade quanto a cromatografia de exclusão de tamanho permitem o isolamento da proteína, seguido pelo estudo de sua função.

Em alguns casos, a presença de uma marca de poli-histidina pode alterar a estrutura de uma proteína, afetando assim sua função. Outra marca comum é a proteína de ligação à maltose ou MBP, que se liga à amilose ligada em uma coluna. A maltose é então usada para liberar o complexo. O MBP pode então ser clivado e removido com SEC para produzir a proteína pura desejada.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre cromatografia de exclusão de tamanho e afinidade. Cobriu a teoria das técnicas, examinou os procedimentos gerais e cobriu alguns dos usos das técnicas.

Obrigado por assistir!