Medição de deformabilidade e heterogeneidade de glóbulos vermelhos no sangue por Ektacytometry

O objetivo geral desta técnica é medir a deformabilidade dos glóbulos vermelhos e a heterogeneidade celular por ectacitometria. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na ectacitometria As principais vantagens dessas técnicas são acessibilidade, conveniência e confiabilidade na medição da deformabilidade e heterogeneidade das populações de hemácias.

As técnicas podem ser úteis para monitorar a resposta à terapia em pacientes com anemia falciforme. Porque a deformabilidade e a heterogeneidade dos glóbulos vermelhos estão correlacionadas com a composição e concentração da hemoglobina. Esses métodos podem ser aplicados a outras doenças caracterizadas pela diminuição da deformabilidade dos glóbulos vermelhos, como diabetes, onde a diminuição da deformabilidade dos glóbulos vermelhos pode contribuir para a doença microvascular.

Comece conectando o tubo osmolar zero à solução de PVP de baixa osmolar e o tubo de 500 osmolares à solução de PVP de alta osmolar. Certifique-se de que o bob esteja completamente abaixado no copo. Inicie o software e prepare a máquina selecionando Verificação de hardware e, em seguida, E/S do instrumento. Deixe o instrumento completar o ciclo de escorva.

Quando o ciclo estiver concluído, retire o bob do copo e seque completamente o bob e o copo com um lenço de limpeza com baixo teor de fiapos. Misture suavemente uma amostra de sangue total recém-colhida, invertendo o frasco várias vezes. Em seguida, pipete 25 microlitros de sangue total em cinco mililitros de solução iso-osmolar de PVP.

Depois de tampar o frasco, misture delicadamente, invertendo novamente várias vezes. Escolha deformabilidade no menu principal do software, crie uma nova análise e adicione os detalhes experimentais. Em seguida, levante a tampa do ectacitômetro e verifique se o bob está totalmente abaixado no copo e se o copo está girando.

Pipete um mililitro de solução de sangue PVP no espaço entre o copo e o prumo. Em seguida, levante ligeiramente o prumo para trazer a amostra para baixo. Aguarde até que todas as bolhas tenham saído da solução e, em seguida, feche a tampa do ectacitômetro.

Ajuste o ganho para 200 movendo a seta ao longo da barra de rolagem no software. Quando a temperatura estiver estável em 37 graus Celsius e a imagem de difração estiver estável, pressione iniciar. Observe os padrões de difração à medida que a aquisição de dados progride para garantir que eles permaneçam circulares, elípticos ou em forma de diamante.

Quando a aquisição de dados estiver concluída, imprima o relatório e limpe. Um padrão de difração obtido de sangue saudável em resposta ao estresse de cisalhamento mostra o padrão elíptico esperado. O índice de alongamento é calculado usando a equação mostrada aqui.

Quando a amostra for aspirada, enxágue o espaço entre o copo e o bob esguichando água deionizada no espaço enquanto o instrumento permanece no ciclo de limpeza. Quando o ciclo de limpeza estiver concluído, retire o bob do copo e seque completamente o bob e o copo com um lenço de limpeza com baixo teor de fiapos. A secagem adequada é crítica, pois a água residual lisará os glóbulos vermelhos, produzindo interferência.

Selecione exportar para salvar o relatório. Por último, clique no botão do menu principal do software para retornar à página principal. Depois de carregar outra amostra no ectacitómetro como antes, certifique-se de que existe uma imagem de difração estável no ecrã.

Ajuste o ganho da câmera movendo uma régua ao longo da tela até produzir uma altura de difração de 3,8 cm. Use uma régua para verificar a altura da imagem na tela do computador. Em seguida, pressione iniciar e observe a aquisição de dados como antes.

Esta imagem mostra um padrão de difração de 3,8 cm obtido do sangue de um paciente com anemia falciforme. Depois de limpar o ectacitômetro conforme mostrado anteriormente, repita o procedimento para obter padrões de difração em alturas de 4,5 cm e 5,4 cm. A distorção do padrão de difração ocorre em amostras de sangue heterogêneas porque os glóbulos vermelhos rígidos não se alinham adequadamente com as células deformáveis, resultando em um padrão de difração em forma de diamante.

Esse padrão de distorção é cada vez mais detectável à medida que o ganho da câmera é ajustado para gerar padrões de difração maiores. Para ectacitometria de gradiente osmótico, comece adicionando 250 microlitros de sangue total a um frasco contendo cinco mililitros de PVP iso-osmolar e misture suavemente. Escolha Osmoscan no menu principal do software.

Em seguida, coloque o frasco para injetáveis contendo a solução de PVP de sangue por baixo da agulha do lado esquerdo da máquina. Abaixe a agulha até que ela toque o fundo do frasco para injetáveis. Certifique-se de que a tubulação esteja conectada corretamente às soluções osmolares baixas e altas para produção de gradiente.

Feche a tampa do ectacitômetro e abra a porta na metade inferior para permitir uma visão do sangue que entra no tubo. Pressione Nova Análise e digite os detalhes experimentais. Depois de ajustar o ganho da câmera para 200, deixe a máquina funcionar até que o sangue entre no copo pelo tubo abaixo do instrumento.

Quando a tela do computador mostrar um padrão de difração estável, inicie a aquisição de dados pressionando o botão Iniciar agora na caixa de diálogo. Permita que o ectacitômetro adquira dados de até aproximadamente 500 miliosmoles por quilograma e, em seguida, pare o instrumento. Imprima o relatório.

Em seguida, remova o frasco de sangue PVP antigo e substitua-o por um frasco limpo contendo água deionizada. Abaixe a agulha para que toque no fundo do frasco e, em seguida, pressione o botão de enxágue na caixa de diálogo para enxaguar o sistema de gradiente. Quando o enxágue estiver concluído, pressione a opção limpar na caixa de diálogo no monitor do computador e selecione exportar para salvar o relatório.

Seque o bob e o copo como antes. Populações sanguíneas homogêneas, como encontradas em voluntários saudáveis, não produzem curvas de deformabilidade diferentes quando os tamanhos de difração são medidos. Em contraste, populações sanguíneas heterogêneas, como sangue de pacientes com anemia falciforme, mostram reduções significativas nas medidas de deformabilidade em função do tamanho do padrão de difração.

No sangue falciforme, quando o grau de distorção do padrão de difração é medido em função do EI max, ele está correlacionado com a hemoglobina S e a variante da hemoglobina adulta, hemoglobina A2. A transfusão corrige a distorção, conforme indicado por sua relação inversa com a porcentagem de hemoglobina adulta normal no sangue. Se o grau de distorção do padrão de difração é medido em função da tensão de cisalhamento necessária para atingir a metade da deformabilidade máxima ou em função do EI max, ele está correlacionado com a hemoglobina fetal. Os principais parâmetros de ektacitometria de gradiente osmótico, como EI max, EI min e O min, fornecem informações adicionais sobre a hidratação celular, as relações superfície/volume e a fragilidade osmótica, respectivamente.

Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser feitas em aproximadamente uma hora, se executadas corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a microscopia, podem ser realizados, para responder a perguntas adicionais relativas à deformabilidade de eritrócitos individuais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a deformabilidade e a heterogeneidade sérica em amostras de sangue.