4.12: Ensaios de Co-Imunoprecipitação e Pull-Down

Os ensaios de co-imunoprecipitação (CoIP) e pull-down são métodos intimamente relacionados para identificar interações proteína-proteína estáveis. Esses métodos estão relacionados à imunoprecipitação, um método para separar uma proteína alvo ligada a um anticorpo de proteínas não ligadas. No CoIP, uma proteína ligada a anticorpos está ligada a outra proteína que não se liga ao anticorpo, isso é seguido por um processo de separação que preserva o complexo proteína-proteína. A diferença nos ensaios puxados para baixo é que as proteínas de isca marcadas por afinidade substituem anticorpos, e a cromatografia de afinidade é usada para isolar complexos proteína-proteína.

Este vídeo explica coip, ensaios pull-down, e sua implementação em laboratório. Um protocolo passo-a-passo para cada técnica é coberto, incluindo os reagentes, aparelhos e instrumentos usados para purificar e analisar proteínas ligadas. Além disso, a seção de aplicações deste vídeo descreve um procedimento para estudar como as proteínas do micovírus inibem a nucleoproteína da gripe, uma investigação sobre o papel dos íons de cálcio na calmodulina através de um ensaio de puxar para baixo, e um ensaio de puxar para baixo modificado para caracterizar interações proteicas transitórias.

As interações proteína-proteína desempenham um papel significativo em uma ampla variedade de funções biológicas. A maioria das interações proteína-proteína e seus efeitos biológicos ainda não foram identificados. A co-imunoprecipitação, ou CoIP, e os ensaios pull-down são dois métodos intimamente relacionados para a identificação de interações proteína-proteína estáveis. Este vídeo abordará os princípios dos dois ensaios, seus procedimentos laboratoriais gerais e aplicações dessas técnicas.

CoIP e ensaios pull-down são variantes de imunoprecipitação, um método para isolar seletivamente uma espécie de proteína de uma solução complexa. Em um experimento de imunoprecipitação, um anticorpo específico para uma proteína-alvo pode formar um complexo imune com esse alvo na amostra. O complexo é então capturado em um suporte sólido, normalmente a proteína A ligada a um grânulo de sepharose. Quaisquer proteínas não capturadas são removidas por etapas de centrifugação. A proteína é então liberada do anticorpo e do suporte sólido por ebulição no tampão redutor de carregamento de amostras SDS-PAGE.

A co-imunoprecipitação é conduzida da mesma maneira, exceto que complexos proteicos intactos são capturados no suporte sólido. O anticorpo se liga à proteína alvo, que, por sua vez, está ligada a outra proteína que não é alvo do anticorpo. Como na imunoprecipitação, o complexo proteico é liberado do anticorpo e do suporte sólido por ebulição na redução do tampão de carregamento de amostras SDS-PAGE.

Os ensaios pull-down são semelhantes à co-imunoprecipitação, diferindo apenas no uso de uma proteína "isca", em oposição a um anticorpo. Por meio de técnicas de biologia molecular, essa proteína de isca é projetada com uma etiqueta de afinidade, como uma série de resíduos de histidina. Essas tags de afinidade são descritas em "Separações de biomoléculas baseadas em cromatografia". A proteína é então capturada em um ligante de afinidade imobilizado específico para a marca. A proteína capturada é então incubada com uma amostra que contém proteínas que formam complexos com a "isca". O complexo proteico é liberado do suporte de afinidade por lavagem com uma solução contendo um analito competitivo específico para a etiqueta na proteína "isca". Os ensaios pull-down são úteis para confirmar as interações proteicas previstas pela co-imunoprecipitação e para descobrir interações proteicas desconhecidas.

Agora que os princípios de co-imunoprecipitação e ensaios pull-down foram discutidos, vejamos seus procedimentos laboratoriais.

Primeiro, vamos discutir a co-imunoprecipitação. A uma série de tubos de microcentrífugas, adiciona-se o seguinte: tampão PBS e uma solução a 50% de proteína A-sepharose, um complexo resina-proteína que se liga ao anticorpo. Os tubos de microcentrífugas são girados para garantir a distribuição adequada e, em seguida, a resina é lavada com tampão PBS adicional. O lisado celular, contendo a proteína desejada, e 2 μg de anticorpo são adicionados aos tubos de microcentrífugas, e a mistura é girada por 1 h a 4 μC. Os grânulos são peletizados por centrifugação, o sobrenadante é descartado e os grânulos são lavados novamente três vezes com tampão para remover a proteína não ligada. Os grânulos contendo o complexo anticorpo-proteína estão na redução do tampão de carregamento de amostras SDS-PAGE, para remoção do complexo do anticorpo e para análise por SDS-PAGE e immunoblotting.

Agora vamos discutir o procedimento para ensaios pull-down: A proteína "isca" é expressa em um plasmídeo com a etiqueta de afinidade apropriada. Depois de atingir o crescimento da fase logarítmica, as células são lisadas e centrifugadas. Grânulos suspensos de estreptavidina-sepharose, que capturam a proteína "isca" marcada com biotina, são pipetados em um tubo de microcentrífuga. As contas são então centrifugadas e o sobrenadante cuidadosamente removido por aspiração. Os grânulos são então lavados com tampão, centrifugados e o sobrenadante removido.

As células que contêm a suposta proteína "presa", que tem afinidade com a proteína "isca", são colhidas por centrifugação. O sobrenadante é então adicionado ao tubo de microcentrífuga contendo a resina e incubado a 4 ? C por 3 h em uma coqueteleira. A resina é então centrifugada, o sobrenadante removido e a resina lavada para remover a proteína não ligada. O tampão de eluição é adicionado à resina e a mistura é incubada à temperatura ambiente por 30 min em um agitador. A resina é então centrifugada e o sobrenadante contendo o complexo desejado é analisado por immunoblotting.

Agora que revisamos os procedimentos, vejamos algumas das aplicações úteis da co-imunoprecipitação e dos ensaios pull-down.

A co-imunoprecipitação pode ser útil para uma melhor compreensão do mecanismo de ação das enzimas. As proteínas de resistência ao mixovírus ou Mx inibem uma ampla gama de vírus, incluindo a influenza A, para a qual o mecanismo é pouco compreendido. A co-imunoprecipitação foi usada para estudar a interação entre a proteína Mx1 de camundongo e a nucleoproteína influenza.

Os ensaios pull-down provaram ser úteis no estudo dos efeitos dos segundos mensageiros, que são proteínas que comunicam um sinal do ambiente celular. Eles são um componente de uma via de sinalização onde várias proteínas interagem em resposta a pistas ambientais. Os íons de cálcio atuam como mensageiros secundários ligando-se à calmodulina, que, por sua vez, se liga a uma ampla variedade de proteínas, mediando muitos tipos de respostas biológicas. Sem o cálcio, a proteína não pode se ligar à calmodulina. Um ensaio pull-down foi realizado para testar a capacidade das proteínas de se ligarem à calmodulina na presença ou ausência de íons de cálcio.

Os ensaios de co-imunoprecipitação e pull-down são geralmente usados para analisar interações proteicas estáveis ou fortes, mas não transitórias. Um desenvolvimento recente em ensaios pull-down, o HaloTag, simplificou o estudo de interações transitórias de proteínas; HaloTag é uma etiqueta de fusão de proteínas geneticamente codificada, fundida à proteína de interesse, capaz de reagir quimicamente com um suporte sólido de haloalcano. Se a análise funcional for desejada, o complexo proteico, menos a marca, em sua totalidade pode ser isolado por incubação com protease do vírus do tabaco.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre co-imunoprecipitação e ensaios pull-down. Este vídeo descreveu os princípios dos dois métodos, os procedimentos laboratoriais gerais e algumas de suas aplicações.

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