Sequenciamento de nova geração direcionado e fluxo de análises de bioinformática para avaliar determinantes genéticos de doenças constitucionais

O objetivo geral do sequenciamento direcionado de próxima geração é elucidar os determinantes genéticos de várias doenças constitucionais, concentrando-se em regiões genômicas de interesse particular. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave sobre a ideologia genética de uma doença, particularmente quando existem associações genéticas previamente conhecidas. Esta técnica é altamente eficiente.

Ele produz milhões de leituras em um curto período de tempo, nós as obtemos a um custo relativamente baixo, há uma carga computacional relativamente baixa, especialmente quando comparamos com outras abordagens de sequenciamento de próxima geração. As implicações da técnica se estendem ao diagnóstico de doenças neurodegenerativas, que são fenotípica e geneticamente heterogêneas, mas têm muitos loci genéticos associados conhecidos. Embora esse método seja particularmente direcionado para doenças neurodegenerativas, ele também pode ser aplicado a várias outras doenças constitucionais com regiões genômicas de interesse previamente identificadas.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o processamento bioinformático necessário para a análise final de variantes raras pode ser computacionalmente intensivo e criar muitas fontes de erro. Neste procedimento, amostras de sangue humano são coletadas em três tubos EDTA K2 de quatro mililitros para fornecer um volume total de cerca de 12 mililitros. Centrifugue as amostras de sangue a 750 vezes a gravidade por 20 minutos.

Isso irá fracionar cada amostra em uma fase superior do plasma, uma fase intermediária fina de leucócitos e uma fase inferior de eritrócitos. Pipetar o plasma da parte superior da amostra de sangue utilizando uma pipeta de transferência descartável. Dispense em várias alíquotas de 500 microlitros e armazene a 80 graus Celsius negativos para análise bioquímica futura.

Extraia o DNA da amostra de sangue com um kit de extração de sangue de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído é então usado para preparar uma biblioteca de sequenciamento para sequenciamento de próxima geração. Quando a execução do sequenciamento for concluída, em um computador, localize os arquivos no ambiente de computação baseado em nuvem selecionando Runs no painel de navegação.

Selecione a execução de sequenciamento apropriada para navegar até a página de resumo da execução. Selecione Baixar para obter dados da nuvem. Na caixa de diálogo exibida, selecione os arquivos FASTQ como o tipo de arquivo a ser baixado e clique em Baixar.

Na página Resumo da Execução do ambiente de computação baseado em nuvem, navegue até Gráficos para analisar a qualidade da execução de sequenciamento com os vários números produzidos pelo ambiente de computação. Na página Executar gráficos, localize a figura rotulada Dados por ciclo, em Gráfico, selecione Intensidade e, em Canal, selecione Todos os canais para produzir o gráfico de intensidade do sinal. No painel Executar Navegação, selecione a guia Indexação de CQ para localizar o histograma Controle de Qualidade de Indexação, que está no lado direito da página.

Na página Resumo da execução do ambiente de computação baseado em nuvem, clique em Métricas no painel de navegação Executar para navegar até as métricas de qualidade. Em Densidade kelvin por milímetro quadrado, certifique-se de que a densidade do cluster da execução de sequenciamento esteja dentro da faixa recomendada pelo kit de enriquecimento que está sendo usado. Neste caso, 1.200 a 1.400 kelvin por milímetro quadrado.

Em Porcentagem Total maior ou igual a Q30, certifique-se de que o valor seja maior ou igual a 85%, refletindo a qualidade das leituras de sequenciamento. Em Alinhado, certifique-se de que o valor seja semelhante à porcentagem de controle positivo que foi incluída na execução do sequenciamento. Por exemplo, se o controle positivo de 1% fosse usado, a porcentagem alinhada esperada seria de aproximadamente 1 a 5% e variações dentro de alguns pontos decimais são aceitáveis.

Comece esse processo importando leituras de sequenciamento FASTQ para o software de processamento de dados. Na área de navegação, clique com o botão direito do mouse e selecione Nova pasta. Nomeie a pasta de forma que haja clareza quanto à execução de sequenciamento que foi executada.

Na barra de ferramentas na parte superior, selecione Importar e, na lista suspensa, escolha a plataforma com a qual o sequenciamento foi executado. Para os fins do ONDRISeq, o Ilumina é escolhido. Na caixa de diálogo, navegue até os arquivos FASTQ da execução de sequenciamento que está sendo processada e selecione-os.

Nas opções Gerais da caixa de diálogo, clique na caixa ao lado de Leituras emparelhadas se o sequenciamento usou produtos químicos de extremidade emparelhados. Na caixa de diálogo Informações de leitura emparelhada, selecione Extremidade emparelhada se o arquivo FASTQ de leitura direta aparecer antes da leitura reversa na lista de arquivos. Defina a distância mínima de leitura emparelhada como um e a distância máxima como 1000.

Nas opções do Ilumina da caixa de diálogo, selecione Remover leituras com falha. Na lista suspensa Índice de qualidade, selecione o pipeline NGS que foi utilizado para sequenciamento. Selecione Avançar na parte inferior da caixa de diálogo.

Selecione Salvar e criar subpastas por unidade de lote. Selecione Avançar na parte inferior da caixa de diálogo. Escolha a pasta que foi criada anteriormente.

É aqui que os arquivos FASTQ serão importados. Selecione Concluir na parte inferior da caixa de diálogo e aguarde até que os arquivos FASTQ sejam importados. Clique na guia Processos para ver o status da importação do arquivo.

Em seguida, projete um fluxo de trabalho dentro do software para executar o resequenciamento e a chamada de variantes de acordo com as instruções do fabricante. Projetar o fluxo de trabalho de resequenciamento e chamada de variante é o aspecto mais difícil desse procedimento. Nossa equipe pesquisou as melhores práticas e usou tentativa e erro para criar o fluxo de trabalho mais robusto para atender às nossas necessidades.

Para executar os arquivos de leitura de sequenciamento FASTQ importados por meio do fluxo de trabalho de bioinformática personalizado, comece identificando o fluxo de trabalho na caixa de ferramentas do software e clicando duas vezes nele. Na caixa de diálogo exibida, localize as pastas de arquivos FASTQ que foram importados na área de navegação. Realce todas as pastas selecionando-as na área de navegação e clique na caixa ao lado de Lote.

Use a seta voltada para a direita para mover os arquivos para os elementos selecionados. Clique em Avançar na parte inferior da caixa de diálogo. Na caixa de diálogo, revise a visão geral do lote para garantir que os arquivos FASTQ corretos foram selecionados e clique em Avançar.

Revise as etapas do fluxo de trabalho na caixa de diálogo para garantir que os arquivos corretos e os locais de exportação tenham sido selecionados ao projetar o fluxo de trabalho. Essas etapas incluem o mapeamento de leituras para a sequência de referência, a remoção de leituras mapeadas duplicadas, a criação de estatísticas para regiões de destino, a exportação de arquivos BAM, a exportação de texto delimitado por tabulação, o filtro com base na sobreposição e a exportação de arquivos VCF. Na etapa final da caixa de diálogo, Tratamento de resultados, selecione a opção Salvar na pasta de entrada.

Clique em Concluir na parte inferior da caixa de diálogo. A etapa final é realizar a anotação de variantes no arquivo VCF de cada amostra, conforme descrito no protocolo de texto. As metodologias demonstradas neste vídeo foram aplicadas a 528 amostras de DNA de participantes de indivíduos que foram inscritos no ONDRI.

As amostras foram executadas no painel ONDRISeq em 22 execuções de 24 amostras por execução. No geral, os dados de sequenciamento foram determinados como de alta qualidade, com uma cobertura média da amostra de 78 vezes. Uma média de 95,6% das leituras foram combinadas com a sequência de referência, e todas as execuções do ONDRISeq tiveram mais de 90% das leituras mapeadas.

Das leituras mapeadas, 92,0% e um Phred Score maior ou igual a Q30. Para demonstrar a utilidade desse fluxo de trabalho NGS direcionado, é apresentado o exemplo de um paciente com doença de Parkinson do sexo masculino de 68 anos, mostrando um N reduzido acima da produção. A variância anotada é selecionada para identificar aqueles que têm maior probabilidade de ser de importância clínica, conforme indicado pelas caixas vermelhas.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de atender adequadamente as etapas à plataforma de sequenciamento, ao kit de enriquecimento que foi utilizado e às necessidades da pesquisa. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores no campo da genética obtivessem dados específicos de região de alta qualidade, mantendo-se mais barata do que seus equivalentes de exoma completo e genoma completo.