Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

O objetivo geral deste protocolo é alcançar uma interrupção rápida e eficiente do gene por meio de CRISPR/Cas9 e células progenitoras hematopoiéticas primárias usando uma abordagem de ribonucleoproteína. Este método pode responder a questões-chave nos campos da hematopoiese normal e maligna, como quais são as consequências moleculares e fenotípicas da perda do gene X. A principal vantagem desta técnica é que ela é extremamente fácil, rápida e econômica. O tempo estimado necessário desde a concepção do experimento até a execução é inferior a uma semana.

Embora esse método tenha sido otimizado para células progenitoras hematopoiéticas, ele pode ser aplicado a outros tipos de células, como células T primárias, linhagens de células hematopoiéticas humanas e de camundongos e amostras primárias de leucemia. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos como outras abordagens de entrega CRISPR / Cas9, incluindo plasmídeos e vírus, eram tóxicas para nossas células ou tinham tempos de resposta lentos. Para projetar RNAs de guia único de interesse, primeiro navegue até o site do CRISPRscan.

Com base na célula de interesse, pressione o botão Mouse ou Human e digite o gene de interesse na caixa de pesquisa UCSC e clique em ir. Em seguida, amplie o exon que você deseja segmentar. Verifique se alguma sequência-alvo de RNA de guia único está listada nas previsões de CRISPRscan no cabeçalho Genes.

Em seguida, clique em um RNA de guia único alvo rotulado como um retângulo verde e copie a sequência completa exibida na sequência Oligo. Em seguida, cole a sequência em um documento de texto. Em seguida, adicione os nucleotídeos ATAGC às três extremidades primas da sequência.

Faça o pedido para a sequência completa. Agora, para sintetizar o molde de DNA para o RNA de guia único, dissolva e dilua os primers de RNA de guia único direto e reverso universal. Em seguida, adicione todos os reagentes em um tubo de PCR para realizar a PCR sobreposta.

Depois de constituir a reação de PCR, coloque o tubo em um termociclador e execute o programa. Quando o programa terminar, purifique o produto de PCR usando colunas de purificação de DNA. Diluir o DNA em 11,5 microlitros de tampão de eluição.

Em seguida, use o tampão de eluição como branco no espectrofotômetro. Meça a concentração do DNA da amostra no espectrofotômetro. Primeiro, misture o DNA eluído, fosfatos de desoxinucleotídeos, tampão de reação e mistura de enzimas T7 RNA polimerase nos tubos de tiras de PCR.

Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, aplique o agente de limpeza RNase para remover o RNase das luvas em uso. Em seguida, ajuste o volume de cada amostra de RNA para 50 microlitros com água livre de nuclease.

Purifique o RNA seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, eluir o RNA em 50 microlitros de água livre de nuclease. Primeiro, use a água livre de nuclease para anular o espectrofotômetro e, em seguida, meça a concentração do RNA eluído.

Use a exclusão de azul de tripano para contar o número de células. Para cada replicação, colete 200.000 células viáveis por réplica e, em seguida, adicione solução salina tamponada com fosfato para lavar as células. Em seguida, gire o tubo a 300 vezes g por sete minutos.

Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante. Durante o curso da centrifugação, incube 1,5 microgramas de Cas9 com um micrograma de RNA guia único total em tubo de PCR por 20 a 30 minutos. Isso é para preparar os complexos Cas9-sgRNA RNP para cada replicação.

Depois de calcular o volume do tampão de ressuspensão T necessário, dissolva o pellet celular obtido no tampão de ressuspensão T.Em seguida, adicione 10 microlitros da suspensão de células dissolvidas no tubo de PCR com os complexos Cas9-sgRNA RNP. Em seguida, ligue a unidade de eletroporação. Deslize a cubeta no suporte da cubeta.

Em seguida, adicione três mililitros de buffer E.Defina as condições no dispositivo de eletroporação. Para realizar a eletroporação, primeiro segure a pipeta de eletroporação, depois estenda a garra e segure o disco dentro da ponta da pipeta e, em seguida, pressione firmemente a pipeta para baixo para prender a ponta. Em seguida, misture a amostra pipetando-a para cima e para baixo 10 vezes.

Retire 10 microlitros da amostra e certifique-se de que não haja bolhas de ar. Em seguida, insira a ponta diretamente no tampão eletrolítico na cubeta de eletroporação. Em seguida, clique em Iniciar na tela.

Deixe a mensagem completa aparecer na tela. Em seguida, remova a pipeta da cubeta. Em seguida, dispense o conteúdo da cubeta no poço preenchido com o novo meio de cultura HSPC.

Para estudar a eficácia da eletroporação Cas9-sgRNA RNP, os HSPCs isolados dos camundongos são eletroporados com RNase de guia único direcionada a GFP ou tdTomato. Esses HSPCs expressaram de forma onipresente GFP ou tdTomato. A análise por citometria de fluxo mostra aproximadamente 75 e 74% de perda de expressão de GFP ou tdTomato nos HSPCs no nível da proteína.

Em seguida, o ensaio baseado em endonuclease T7 um é realizado com DNA amplificado por PCR do locus GFP das células eletroporadas. Isso é para quantificar a eficiência de interrupção do gene da GFP. O software ImageJ é usado para calcular a razão entre as intensidades das bandas clivadas e não clivadas para calcular a porcentagem de clivagem.

A eficiência de três diferentes RNAs de guia único direcionados ao CD45 humano é testada na linha celular HL-60 AML. A citometria de fluxo mostra o RNA1 de guia único como o mais eficiente com 98% de eficiência de nocaute quando comparado ao controle. Em seguida, o nocaute para CD45 também é realizado em HSPCs CD34 positivos para sangue de cordão umbilical humano primário usando RNA1 de guia único.

A análise por citometria de fluxo mostra quase 80% de células com perda de CD45 sem alteração na expressão de CD34 em comparação com apenas Cas9. A fim de estudar o enxerto de HSCCs nocaute para CD45 humano, células da medula óssea e do baço são colhidas de camundongos NSG transfectados retroorbitalmente CD34 positivos para análise, mostrando células editadas como HLA-ABC positivas e CD45 negativas. Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em três dias, se realizado corrigido.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as superfícies e reagentes livres de RNase, verificar a interrupção gênica eficiente com várias técnicas e usar os controles experimentais adequados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar, sintetizar e transfectar ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA em células progenitoras hematopoiéticas para obter uma interrupção rápida e eficiente do gene.