Name: Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprenda a derivar células estaminais embrionárias humanas por imunocirurgia, isolando a massa celular interna de embriões de qualidade. Este método detalhado facilita pesquisas em biologia do desenvolvimento e medicina regenerativa.

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AEC é um companheiro da Coffin Memorial Fund Jane Childs de Pesquisa Médica e Pesquisa Merck Laboratórios. Agradecemos a D. Egli e C. Cowan para o conselho experimental e discussão.

<html> Embriões humanos congelados usado para embrionárias humanas derivação de células-tronco (embrionárias humanas) foram doados para pesquisa após o consentimento informado adequado ao abrigo de protocolos de pesquisa que foram analisadas e aprovadas tanto pelo Comitê sobre o uso de seres humanos e as células-tronco embrionárias comitê de supervisão de pesquisa na Universidade de Harvard . Protocolo escrito abaixo é com base em parâmetros publicados relatado por Cowan et al. 2004, com ligeiras modificações. Cultura de embriões Descongelar embriões humanos usando Kit Quinn Thaw Advantage e cultura em gotas de médio global suplementado com 15% até Plasmanate de desenvolvimento para o estágio de blastocisto expandido. Immunosurgery baseado isolamento da massa celular interna Preparação: <ol><li> Prepare pratos para a remoção da zona pelúcida e immunosurgery (veja abaixo) através da criação de gotas de cada solução em placas de 10cm. Sobreposição com óleo mineral para evitar a evaporação. Prepare uma única linha por embrião destinado a derivação. <ul><li> Tyrodes EmbryoMax ácidas, use como é. </li><li> CTeh media derivação: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum substituição, Plasmanate 10%, 2,5% de células-ES testados soro fetal bovino (FBS), 2mM Glutamax-I, 1% não-aminoácidos essenciais, 50 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoetanol, 5ng/ml bFGF. </li><li> Coelho anti-humano de anticorpos de glóbulos vermelhos primários, reconstituídos de acordo com sugestão do fabricante, diluído em 1:10, com media de derivação CTeh. </li><li> Cobaia soro complemento, reconstituídos de acordo com sugestão do fabricante, diluído em 1:10 com a mídia derivação CTeh. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="01-574_Figure" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> Equilibrar todas as placas a 37 ° C em cultura de tecidos incubadora antes de usar. </li><li> Pull-50μl 100μl pipetas capilares (VWR) para uso em embriões de transferência. Corte termina com diamantes e usar caneta com tubulação pipeta boca equipado com um filtro de 0,2 Hm. </li></ol> Procedimento Immunosurgery: Notas: <ul><li> Neste procedimento, as células do trofectoderma são destruídos por uma breve exposição a anticorpos direcionados contra as células humanas em conjunto com a atividade do complemento. Portanto, o protocolo funciona melhor com alta qualidade de embriões com um trofectoderma intacta, como apenas a integridade estrutural do blastocisto impede que o ICM de também estar suscetível à reação imunológica. </li><li> Todos os procedimentos realizados usando um escopo dissecção equipado com palco aquecida. </li></ul> Passos: <ol><li> Enxágüe a boca pipeta a ser usada para transferência de embriões com FBS para evitar embriões de degola. </li><li> Transferência de blastocisto, do prato de cultura para TEh queda realização de AT prato. </li><li> Comece procedimento, transferindo-tronco embrionárias humanas a partir de blastocisto queda através de uma série de AT cai. Na terceira queda, para assistir dissolução da zona pelúcida (segundos normalmente 30/05). Tenha cuidado para não tratá-over integridade ou embrião pode ser comprometida. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure-02" width="551" height="273" /> </li><li> Blastocisto transferência através de uma série de meios de derivação de células-tronco embrionárias humanas cai para enxaguar AT. Pipeta pré-carga com a mídia é recomendado para neutralizar imediatamente AT reação. Blastocistos podem ser realizadas aqui até que todos tenham sido AT-processado. </li><li> Transferência de blastocisto através de uma série de gotas anticorpo primário, deixando em queda de terceiro para 30 minutos de incubação a 37 ° C em uma incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Blastocisto transferência através de uma série de meios de derivação de células-tronco embrionárias humanas cai para enxaguar primária. </li><li> Transferência de blastocisto através de uma série de gotas complementar, deixando na terceira queda para assistir pela lise das células trofectoderma. Observe blastocisto para os primeiros 30 segundos no palco para &quot;bolhas&quot; de células trofectoderma como eles lise. Se lise é observada dentro deste prazo, mantenha prato no palco microscópio para monitorar a reação até a conclusão. Se não borbulhar é observada durante os primeiros 30 segundos, volte à incubadora, verificando a cada 5 minutos até que a maioria dos trofectoderma tem lisadas. Isso pode demorar 5-15 minutos. Monitorar de perto a reação para minimizar o tempo de reação e danos potenciais para a massa celular interna. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure-03" width="571" height="273" /> </li><li> Blastocisto transferência através de uma série de meios de derivação de células-tronco embrionárias humanas cai para lavar atividade complementar. </li><li> Usando pipeta de vidro com um diâmetro que é ligeiramente menor do que o blastocisto (a partir de puxou 10μl VWR tubos capilares), desenhe o blastocisto cima e para baixo para tirar fora a maior parte do trofectoderma lisadas. g &quot;alt =&quot; 574_Figure-0 &quot;width =&quot; 577 &quot;height =&quot; 270 &quot;/&gt; </li><li> Placa ICM para isolar células alimentadoras de fibroblastos de rato mitoticamente inativado embrião (MEFs). MEFs deve ser preparada no dia anterior derivação e mudou para CTeh dia derivação de mídia. 4 pratos bem NUNC funcionam bem para as etapas iniciais de derivação. </li><li> Não perturbe placa para o primeiro período de 1-2 dias. A partir daí, verificar diariamente por conseqüência de colônias de células-tronco embrionárias (geralmente aparente dentro de 1-2 semanas). Mídia deve ser mudado em volumes metade a cada início outro dia no dia 3. </li></ol> ES conseqüência celular e passaging Quando a conseqüência CTeh atingiu cerca de 0,5 milímetros ou mais, ele está pronto para a expansão de colheita mecânica. <ol><li> Mecanicamente dispersar a metade do crescimento e transferência para novas placas contendo alimentadores fresco. Aglomerados de células-tronco embrionárias deve ser de aproximadamente 30-50 células cada. Deixe outra metade conseqüência como um back-up para a primeira passagem (p1). A conseqüência (p0) podem ser separados em várias vezes à medida que continua a se expandir. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> Colônias secundárias podem ser igualmente dispersos e expandido através de pratos de maior cultura até passagens 3-5, altura em que as novas linhagens de células pode ser adaptado para passaging enzimática com tripsina. O conteúdo do soro do meio de cultura também deve ser gradualmente reduzida para 1% e 0% durante essas passagens iniciais para minimizar a diferenciação de células ES. </li><li> Todas as linhagens estáveis ​​de células-tronco embrionárias devem ser bancados pelo congelamento até uma porção de passagens cedo para futuras expansões. </li><li> Além disso, cada linha celular deve ser caracterizada pela análise de cariótipo e validado por estudos pluripotência e diferenciação in vitro e in vivo. </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

O protocolo apresentado aqui fornece aos pesquisadores uma concisa, fácil de seguir esboço de como derivar linhagens de células-tronco embrionárias pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

<table><tbody><tr><td>Kit de Reaquecimento Quinn&amp;rsquo;s Advantage</td><td>Sage</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Meio Global</td><td>Life Global</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>Tiróide Ácido EmbryoMax</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de Soro KO</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal testado em células-tronco embrionárias, Definido</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos básico recombinante humano</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primário de coelho anti-eritrócito humano</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>Soro de complemento de porquinho-da-índia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas capilares em tamanhos de 10 microL, 50 microL, 100 microL</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de boca com tubo</td><td>VWR international</td><td></td><td>fornecido com pipetas capilares da VWR</td></tr><tr><td>Filtro de seringa Acrodisc de 0,2 microm</td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,5%</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico Nikon SMZ1500 equipado com estágio aquecedor Nikon Tokai Hit ThermoPlate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionários de camundongo (E12,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derivação de células estaminais embrionárias humanas por immunosurgery

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

A capacidade de células estaminais embrionárias humanas para a auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células do corpo sugere que eles são uma grande promessa para aplicações médicas e como ferramenta de pesquisa para abordar questões fundamentais no desenvolvimento e na doença. Aqui, fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para a derivação de células estaminais embrionárias humanas a partir de embriões pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

A capacidade de autorrenovação e de diferenciação das células-tronco embrionárias humanas em todos os tipos celulares do corpo sugere que elas representam uma grande promessa tanto para...

Olá, meu nome é Alice Chen. Sou pós-doutoranda no laboratório de melting e hoje vou demonstrar como derivamos células-tronco embrionárias de embriões humanos. Recebemos embriões em diversos estágios de desenvolvimento e os cultivamos in vitro até que atinjam o estágio adequado de blastocisto expandido.Estes são exemplos de como o embrião se desenvolve desde o primeiro estágio, o estágio de uma única célula, até a fase inicial da blástula e, em seguida, à blástula expandida, da qual derivamos as células-tronco embrionárias humanas. Os embriões de alta qualidade escolhidos para derivação são então transferidos através de três gotas de solução ACE, onde devem ser deixados e observados quanto à dissolução da zona pelúcida. O processo de imunocirurgia é um processo não específico no qual o anticorpo anti-humano de coelho se ligará à camada externa das células.Neste caso, é a tríplice derme. Após a aplicação do complemento de soro de porquinho-da-índia, todas essas células com anticorpo ligado serão lisadas. Para começar, queremos preparar três placas.A primeira placa é para os tiros de ACE, que utilizamos para remover o zita. As segunda e terceira placas são para cirurgia imunológica. Primeiramente, iniciarei gerando a placa na qual colocaremos as gotas de tiros ácidos e a derivação de células-tronco embrionárias humanas.Gotas de meio. Prepare três gotas de ácido tiros no lado esquerdo da placa e, no lado direito da placa, prepare três gotas de meio de cultura de ES humanas. A segunda placa consiste no anticorpo primário, que é um anticorpo antieritrócito humano de coelho.Novamente, o lado esquerdo da placa será dedicado ao anticorpo primário, com três gotas por embrião, e o lado direito da placa será dedicado ao cultivo de ES humanas. As gotas de meio, novamente, três gotas por embrião para a placa de complemento. Novamente, colocaremos três gotas de complemento no lado esquerdo da placa e, em seguida, três gotas de meio de cultivo de células-tronco embrionárias humanas no lado direito da placa.Novamente, cada linha é dedicada a um embrião. Todas as três placas são cobertas com óleo mineral para prevenir evaporação e colocadas no incubador para equilibração. Este é um microscópio de dissecação localizado em uma cabine de fluxo laminar, semelhante à usada em cultura de tecidos, e é neste local que realizamos a maior parte da manipulação de embriões humanos.A primeira coisa que você deve preparar antes de começar a trabalhar com seus embriões são pipetas bucais. Esta é a tubulação padrão para pipeta bucal, exceto que inserimos um filtro de 0,2 mícron entre a sua boca e o local onde a pipeta seria colocada. Isso serve apenas para garantir a esterilidade.Deixe-me demonstrar como puxar pipetas de boca. Gosto de puxar uma variedade de tamanhos. Você pode obter todos esses na VWR e gosto de puxar diâmetros de 10 microlitros, 50 microlitros e 100 microlitros.Agora estou usando um pino de diamante para cortar o tubo de montagem. Para este primeiro passo, você deseja um diâmetro relativamente grande porque está manipulando o embrião inteiro. Os embriões de alta qualidade escolhidos para derivação são então transferidos por meio de três gotas.Ofci percorre simplesmente transitando da primeira gota para a segunda gota até a terceira gota, onde você a deixará e observará a dissolução da zap palita. Esse processo geralmente leva menos de 30 segundos, e é possível realmente ver a zap palita se dissolvendo. Quando a zap palita tiver se dissolvido completamente.Os embriões são então transferidos através das três gotas de lavagem do meio de cultura humano Es, passando pela primeira, segunda e terceira gotas de lavagem. Em seguida, o embrião é transferido para o anticorpo primário, novamente em gotas, passando da primeira para a segunda e depois para a terceira gota, onde permanecerá por meia hora de incubação no incubador de cultura de tecidos. A lise da trifecta dérmica torna-se aparente quando você observa bolhas nas células na parte externa do embrião. Este é o início da lise das células dérmicas da trifecta.Quando a lise estiver aparente em toda a borda externa do embrião, então o embrião está pronto para ser lavado através das três gotas de meio de cultura humanus. Após a imunocirurgia, os embriões são triturados mecanicamente usando uma pipeta bucal de menor tamanho. Essa pipeta bucal deve ter um diâmetro menor do que a primeira pipeta, para que você possa tornar o processo de trituração mais eficiente ao remover a trifecta lisada.Células dérmicas. No final da ativação mecânica, resta um agrupamento de células no centro. Há a massa celular interna, que está intacta.Ao redor disso, há muitas células dérmicas trifecta lisadas, bem como algumas células dérmicas trifecta intactas. Esse isolado da massa celular interna é então colocado em um poço que foi preparado com uma camada de células alimentadoras de embrião de camundongo. A placa com a camada de células alimentadoras foi preparada na noite anterior, e esta manhã troquei o meio de cultivo de meio para fibroblastos de embrião de camundongo para meio de derivação de células-tronco humanas.O isolado da massa celular interna é então transferido das gotas de lavagem após o complemento para este poço contendo as células da camada de alimentação. Este recipiente é então devolvido ao incubador e mantido intocado por alguns dias para permitir a adesão do isolado da massa celular interna. Este é um exemplo de como o crescimento externo se desenvolve.Quando a expansão torna-se grande o suficiente, podemos iniciar o primeiro repique dividindo essa expansão ao meio. Agora, já se passaram 14 dias desde a derivação original, e este é um exemplo de uma expansão de uma de nossas derivações.Este é um exemplo de um desses crescimentos, no qual hoje vou retirar metade do crescimento. O crescimento será dividido ao meio e depois cortado em pedaços quadrados, e cada um desses pedaços será transferido para um novo poço contendo células alimentadoras. É recomendável deixar metade do crescimento intocado, para que você tenha uma fonte contínua de células à qual possa recorrer para amplificar suas células e fazer cópias de segurança de qualquer passagem que realizar.Para as primeiras duas ou três subculturas, é recomendável realizar a subcultura de forma mecânica desta maneira e, eventualmente, adaptar as células à dissociação enzimática para um acondicionamento mais eficiente. Nosso laboratório obtém consistentemente linhagens de células-tronco embrionárias humanas para uso e compreensão do desenvolvimento e da diferenciação.Essas linhagens também são distribuídas mundialmente para pesquisadores de células-tronco. Acredito que existem quatro fatores principais que afetam o sucesso do isolamento. O primeiro está relacionado à qualidade do embrião, a qual também depende do fundo genético, da forma como os embriões foram congelados e descongelados, e também da qualidade do cultivo in vitro até a fase de isolamento no estágio de blastocisto.O segundo fator provavelmente é a integridade da qualidade da massa celular interna após o isolamento, o que pode depender da técnica utilizada para isolar a massa celular interna e também pode depender da experiência e habilidade. O terceiro fator é a capacidade de adesão da massa celular interna isolada às camadas de alimentação, e o quarto fator é o crescimento dessa massa celular interna isolada. Eu não acho que tecnicamente seja um processo difícil.É só uma questão de prática. Na verdade, cada etapa é bastante simples, então, desde que você consiga seguir o protocolo, com um pouco de prática, acho que qualquer pessoa pode fazer isso. O que descobrimos no laboratório é que cada linhagem é um pouco diferente por razões que não compreendemos totalmente.Por exemplo, se você fosse testar o potencial de diferenciação de 10 linhagens, talvez duas ou três dessas linhagens tenham maior probabilidade de se desenvolverem no tipo de célula de seu interesse. Suspeito que essas diferenças estejam relacionadas ao estágio em que as células se encontravam, ao estágio do embrião a partir do qual as linhagens de células-tronco embrionárias foram derivadas, bem como ao manuseio manual dessas células. Acredito que a propriedade delas mude às vezes a heterogeneidade das linhagens celulares e que seu potencial seja algo que todo pesquisador de células-tronco precisa ter em mente.Novamente, não sei o que causa isso, mas, certamente como exemplo para a minha pesquisa, nosso objetivo final é produzir células beta produtoras de insulina do pâncreas. O primeiro passo para gerar esse tipo de linhagem celular é produzir endoderma a partir de células-tronco embrionárias, e, em uma comparação entre 10 a 20 linhagens, descobrimos que uma ou duas dessas linhagens conseguem gerar endoderma de forma eficiente, enquanto metade delas talvez consiga gerar endoderma com menor eficiência, e algumas delas não conseguem gerar endoderma de maneira satisfatória. Assim, por meio desse processo inicial de triagem, selecionamos células que possuem maior tendência a formar o tipo celular de interesse e prosseguimos com a diferenciação restante utilizando essas linhagens celulares.A primeira derivação de células-tronco embrionárias humanas foi relatada por Thompson et al. em 1998, e em 2004, nosso laboratório relatou a derivação de 17 novas linhagens de células-tronco embrionárias humanas. Ao modificar esses protocolos publicados, e essas modificações tinham como objetivo apenas tornar o processo de derivação mais eficiente, realizamos alterações na composição do meio, na forma como as células são repassadas e na maneira como são congeladas e descongeladas.Desde então, em cada derivação, buscamos novas formas de aprimorar o protocolo e a taxa de derivação. Por exemplo, nosso laboratório está explorando maneiras alternativas de isolar a massa celular interna, não utilizando reagentes xênicos como o anticorpo de coelho ou o complemento sérico de porquinho-da-índia, mas sim dissecando mecanicamente a massa celular interna. Espera-se que esses métodos levem a um modo pelo menos comparável, senão melhor, de isolar a massa celular interna.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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