Name: Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a reorganizar loops de cromatina usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9) para modular a expressão gênica de forma reversível. Este método permite controlar a arquitetura cromossômica e estudar a dinâmica transcricional em diversos tipos celulares.

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Agradecemos H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, Calo E. e o laboratório de Wang inteiro para suporte técnico e leitura crítica do manuscrito. S.L.M foi apoiado neste trabalho através da NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) e o Instituto Nacional de câncer (1F99CA222541-01). K.C.W. é suportado por um prémio de carreira para médicos cientistas da Burroughs Wellcome fundo e é um Donald E. e Delia B. Baxter Foundation Scholar de faculdade.

1. gRNA Design
<ol><li>Selecione uma ferramenta de projeto padrão gRNA para projetar o guia RNAs10. Use pares complementares do previamente desenvolvido CLOuD9 construções9 (ou seja, pelo menos 1 S. aureus (CSA) e 1 S. pyogenes (CSP) construir) para cada experimento.<ol>
<li>Dentro da ferramenta de design on-line selecionado, use a sequência de Protospacer adjacentes Motif (PAM) "NGG" com um comprimento de guia de 20 bp para o PAM e o CSP sequência "NNGRRT" com um comprimento de guia de 21 para CSA.</li>
		<li>Guias com base na especificidade de escolher marcar e guias em ambas as vertentes, para maximizar as chances de obter um guia de trabalho de design.</li>
		<li>Ordem 2 oligonucleotides por guia de um fabricante de oligo: para avançar oligo, adicione "caccg" à extremidade 5' da sequência de guia e para o reverso oligo, adicionar "aaac" à extremidade 5' e "c" à extremidade 3' antes de encomendar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicialmente, o projeto gRNAs de 3 a 5 para cada região de interesse, espalhados por uma região de bp 250-1000. Avalie a gRNA visando eficiência como segue:<ol>
<li>GRNAs clone identificado em um plasmídeo Cas9 ativo (consulte a etapa 3) e transfect transitoriamente em 293T células (ver passo 4)11.</li>
		<li>Desenvolvem-se células para 2-3 d em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (estreptococos de caneta), em seguida, colher e extrato de DNA genômico12.</li>
		<li>Amplifica regiões específicas por reação em cadeia da polimerase (PCR). Executar produtos em um gel de agarose 1,5% e purificar bandas apropriadas.</li>
		<li>Realizar um ensaio de endonuclease T7, conforme descrito no Guschin, et al. protocolo13,14. Nota: Guias eficientes são aqueles determinados a cortam o ADN no local de destino.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultura de pilha
<ol><li>Manter as células em um saudável e ativamente dividindo o estado.<ol>
<li>Para K562s, cultura em meios de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 10% FBS e 1% caneta de estreptococos.<ol>
<li>Crescer K562s num balão de pescoço inclinada 25 cm2 para manutenção e ajustar a densidade da célula a 400.000 células / mL de cada dia.</li>
			<li>Depois de K562s ter sido transfectadas com CLOuD9 constrói, adicionar 2 puromicina µ g/mL e 100 µ g/mL hptII a media de manutenção.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para 293Ts, cultura em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 10% FBS e 1% caneta de estreptococos.<ol>
<li>Crescer 293Ts em placas de 10 cm2 e separaram-se quando confluentes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. plasmídeo preparação e gRNA inserção15
Nota: Plasmídeo mapas estão disponíveis no apêndice e primers utilizados nas experiências de exemplo estão disponíveis em complementar a tabela 1.
<ol><li>Mistura de 5 µ g da particulas de Lentivirus shRNA CRISPR com 3 µ l de BsmBI, 3 µ l de fosfatase alcalina, 6 µ l de tampão de 10x e 0,6 µ l de recentemente preparada 100 mM DTT. Trazer o volume total de 60 µ l com DDQ2O e incubar a 37 ° C por 30 min digerir e dephosphorylate o plasmídeo.</li>
	<li>Gel de purificar o plasmídeo digerido e eluir em ddH2O.</li>
	<li>Misturar 1 µ l de cada um dos guias emparelhados em 100 µM com 1 µ l de Buffer de ligadura de T4, 6,5 µ l de DDQ2O e 0,5 µ l de 10x T4 PNK, para atingir 10 µ l volume total. Incubar a 37 ° C por 30 min, depois de 95 ° C por 5 min, em seguida, rampa até 25 ° C a 5 ° C/min. Nota: Isto irá recoze o par de guias.</li>
	<li>Diluir a 1: 200 guias recozido (da etapa 3.3) em ddH2O.</li>
	<li>Misturar 1 µ l do plasmídeo digerido de passo 3.2 com 0,5 µ l dos guias ligados diluídos da etapa 3.4, 2,5 µ l de 2 x Buffer, 1 µ l de DDQ2O e 0,5 µ l de Ligase, tornar-se uma reação total 5,5 µ l. Isto incube à temperatura ambiente por 10 min para ligate as guias para o plasmídeo BsmBI digerido.</li>
	<li>Transformar o plasmídeo recém ligado da etapa 3.5 Stbl3 bactérias e amplificar usando qualquer método de preparação do plasmídeo.</li>
</ol>4. lentivirus produção
<ol><li>Contagem 750.000 293T células por poço para um seis-poço da placa usando um hemocytometer e semente-los em DMEM com 10% FBS e 1% caneta de estreptococos. Use um poço para cada construção.</li>
	<li>24 h após a semeadura, alterar a mídia para fresco sem antibióticos DMEM com 10% FBS.</li>
	<li>Em um tubo, dilua 11 µ l de reagente de transfeccao baseada em lipídios com 150 µ l do meio de OptiMEM, por reação11.</li>
	<li>Em um tubo separado, dilua 2 µ g do plasmídeo de vetor de Lentivirus CLOuD9 da etapa 3.6, 0,35 µ g de pMDLg/pRRE, 1 µ g de pRSV-Rev e 0,65 µ g de pMD2.G com 150 µ l do meio de OptiMEM, por reação11.</li>
	<li>Para cada reação, adicionar as misturas diluídas particulas de Lentivirus shRNA com o reagente de transfeccao baseada em lipídios diluída na proporção de 1:1 e incubar durante 5 min11.</li>
	<li>Adicione todo o volume de cada complexo misto da etapa 4.5 nos respectivos poços das células sem antibióticos 293T da etapa 4.2.</li>
	<li>48 h depois, recolher mídia produção viral pipetando num tubo fresco e rotação para baixo a 300 x g por 5 min. Após a centrifugação, mova o sobrenadante para um tubo fresco para remover os resíduos de células residuais.</li>
	<li>Use mídia produção viral imediatamente para a transdução de células alvo ou congelar a-80 ° C para uso futuro.</li>
</ol>5. lentivirus transdução de células
<ol><li>Adicione 250 µ l de cada construção viral de interesse (composto de plasmídeos de CLOuD9 complementares) para um tubo cônico de 15 mL contendo 80.000 células para o aplicativo CLOuD9.</li>
	<li>Trazer o volume total dos meios de comunicação em cada cônica para 1 mL com mídia sem antibióticos e adicionar polybrene para uma concentração final de 1-8 µ g/ml (concentração máxima de polybrene tolerado pelo tipo de célula utilizado precisará ser determinada experimentalmente).</li>
	<li>Girar as células a 800 x g durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, resuspenda pipetando sem remover o sobrenadante viral. Mova a suspensão de toda a célula para uma placa de cultura de células.</li>
	<li>pós-transdução de 24 h, células de rotação para baixo a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar viral sobrenadante e ressuspender as células em meios de cultura de célula normal.</li>
	<li>No dia seguinte, adicione puromicina (1 µ g/mL para células 293T) e hptII (25 µ g/mL para células 293T) para o meio de cultura celular para selecionar células duplamente transduzidas. Experimentalmente, determine as concentrações adequadas de puromicina e hptII para um determinada célula tipo antes de começar os experimentos.</li>
	<li>Manter a células em meios de seleção pelo menos 3 d antes de quaisquer experiências a jusante e em meios de seleção para a duração de todas as experiências.</li>
</ol>6. celular dimerização e lavagem para fora
<ol><li>Adicionar 1 mM ácido abscísico (ABA) ou uma quantidade equivalente de Dimetilsulfóxido (DMSO) para controles para cultura de células para dimerizam o CLOuD9 selecionado e transfectadas células. Use a ABA dentro de 6 meses da data de recepção, manter-se frio e protegê-lo da luz ao longo do uso. 2 mM ABA pode ser utilizada se necessário.<ol>
<li>Mudam diariamente a mídia para fornecer ABA fresco (ou DMSO para controles) para a duração dos experimentos. Nota: Há limite para o comprimento de dimerização ainda tem sido observado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reverta a dimerização através da remoção de mídia contendo a ABA e células de lavagem com suficiente tamponado fosfato salino (PBS) para cobrir a superfície da placa, duas vezes. Daí em diante, cultura de células em meios de comunicação livre de ABA para manter um estado un-dimerized.</li>
</ol>7. imunoprecipitação e Co-moleculas
Nota: Verifique todos os buffers fresco e imediatamente antes da utilização.
<ol><li>Após conclusão dos experimentos de dimerização, coletar e spin para baixo de células e, em seguida, Aspire o sobrenadante.</li>
	<li>Crosslink e congelar para baixo de células<ol>
<li>Fazer um estoque fresco de formol 1% em PBS em temperatura ambiente usando materiais frescos. Para cada 2 milhões de células, resuspenda delicadamente com 1 mL de formaldeído 1% à temperatura ambiente por exatamente 10 min, enquanto roda. Nota: Utilize um volume mínimo de 10 mL de reticulação, menos de 10 milhões de células.</li>
		<li>Saciar a reticulação com a adição de glicina a uma concentração final de 0,125 M, seguido de incubação durante 5 min à temperatura ambiente, enquanto roda.</li>
		<li>Gire para baixo as células e lavar 1-2x com PBS gelado. Pelotas de célula podem então ser snap congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C ou usado imediatamente. Nota: O calor irá inverter ligações cruzadas de formaldeído. Se apressado, as células podem ser armazenadas diretamente no-80 ° C sem congelar o snap.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar o conjugado anticorpo/pérola Nota: Otimizando condições para anticorpo escolhido (por exemplo, testes buffers de Lise diferentes para lise celular e executar o IP) podem valer a pena. Dois buffers comuns, tampão de Lise Farnham e amortecedor de RIPA modificado, podem ter um efeito significativo sobre a eficiência IP e eficiência sonication. Todas as composições de buffer podem ser encontradas na Tabela de materiais. Além disso, tenha em mente que cromatina sonication pode levar várias horas para completar.<ol>
<li>Resuspenda grânulos vortexing brevemente, conforme apropriado para o anticorpo escolhido.</li>
		<li>Transferi uma quantidade adequada de grânulos para o experimento para um tubo de 1,5 mL. Como ponto de partida, use 20 µ l de grânulos para cada 1 µ g de anticorpo. Não adicione anticorpo ainda. Nota: Use 10 µ g anticorpo com 200 µ l de grânulos para 1mg de total lisado como ponto de partida, a menos que ele é conhecido que o anticorpo é mais ou menos eficiente do que isso implicaria. Para proteínas de baixa abundância, essa proporção pode precisar ser ajustada.</li>
		<li>Se usar tampão de lise de Farnham, lave 3 x em tampão de diluição de IP. Se usar tampão de Lise RIPA, lave 3 x em tampão de Lise RIPA.</li>
		<li>Resuspenda as contas em um volume final da mesma reserva da etapa 7.3.3 (diluição de IP ou o amortecedor de RIPA) que é > 1 x e < 5 x volume inicial. ou seja Para o volume inicial do grânulo de 100 µ l, use entre 100 e 500 µ l ressuspensão final volume.</li>
		<li>Adicione anticorpo para grânulos lavados agora em uma concentração adequada. Para um bom HA ou uma bandeira anticorpos IP CLOuD9 construções, usar anticorpos às 01:50 (µ g proteína: proteína µ g lisada) e incubar entre 8 + h e durante a noite a 4 ° C, enquanto roda. Alternativamente, incube durante 2-4 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire o sobrenadante de missanga e descarte.</li>
		<li>Lavagem de contas 3x com o tampão de lavagem.</li>
		<li>Resuspenda em um volume mínimo do buffer utilizado para incubação durante a noite com o anticorpo (diluição de IP ou o amortecedor de RIPA). Manter-se frio até combinado com lisado de proteína.</li>
	</ol></li>
	<li>Proceda à sonicação cromatina<ol>
<li>Primeiro lyse pilhas com a adição de inchaço buffer para pelotas de célula no gelo por 10 min, passando rapidamente células cada poucos min para evitar a sedimentação. Nota: Geralmente, 500 µ l de tampão de inchaço é adicionado a 25 milhões de células e dimensionado de lá, mas fazer não uso inferior a 500 µ l de buffer para < 25 milhões de células.</li>
		<li>Homogenizacao manualmente no sentido horário e anti-horário, 13 x cada um.</li>
		<li>Então núcleos de rotação para baixo a 4 ° C por 5 min em 1.500 x g. Aspire o sobrenadante completamente e repita o procedimento para remover o sobrenadante restante, então pesam o centrifugado em mg.</li>
		<li>Adicionar inibidor da protease de tampão de lise de núcleos (Farnham buffer ou RIPA de buffer, acima, escolha uma).</li>
		<li>Adicionar 10 x quantidade de tampão de lise de núcleos para núcleos peletizados para Ressuspender (por exemplo, adicionar 1 mL de tampão de lise de núcleos de uma pelota de 0,100 g). Brevemente o vórtice e lyse por 10 min no gelo. Nota: Tenha em mente o tamanho do tubo sonication. Volume ideal é frequentemente < 1 mL, então amostras podem precisar ser dividido se pelotas são muito grandes.<ol>
<li>Para Co-IP, proceda à sonicação núcleos brevemente para solubilizar material e saciar SDS para um nível que permita a imunoprecipitação com 2-3 volumes de tampão de diluição e, em seguida, prossiga para a etapa 7.4.6. Para anticorpos muito sensíveis, adicione mais tampão de diluição para reduzir ainda mais a concentração de SDS. Nota: Parar sonication quando lisado limpa; mudará de um opaco/translúcido branco para completamente transparente. Manter amostras tão frio quanto possível e não mais proceda à sonicação.</li>
			<li>Para ChIP, completamente proceda à sonicação DNA para obter fragmentos de DNA de bp 150-1000, em seguida, prossiga para a etapa 7.4.6.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ficar fora do material insolúvel na velocidade máxima durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Transferi material solúvel para um tubo de fresco.</li>
		<li>Para Co-IP, medir a concentração de proteína e prossiga para o pulldown na etapa 7.5.</li>
		<li>Para ChIP, retirar uma alíquota de 10 µ l de desmarcada lisado e adicionar 40 tampão de eluição de IP µ l e 6 µ l 5 M NaCl a isso para um total de 56ul. Ferver durante 15 minutos a 95 ° C, adicionar 5-10 µ l de 3M NaOAc pH 5 e limpar em uma coluna de purificação de PCR. Medir a concentração de DNA medindo a absorbância em 260 nm e padronize as amostras. Vá para o pulldown na etapa 7.5. Nota: Extra lisado pode ser snap congelado a-80 ° C e usado em um momento posterior, mas os melhores resultados são obtidos de lisado o fresco. Se congelar, não congelar/descongelar lisado mais de uma vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulldown<ol>
<li>Transferi uma quantidade adequada de proteína lisada para um tubo de fresco. Se usar tampão de lise de Farnham, dilua em 2,1 volumes de tampão de diluição de IP (acima).</li>
		<li>Reserve 100 µ l do sobrenadante para controle de entrada e armazenar a 4 ° C até o dia seguinte.</li>
		<li>Adicione do grânulo/anticorpo conjugado da etapa 7.3.8 para amostras agora.</li>
		<li>Gire as amostras a 4 ° C durante a noite e garantir que não há volume suficiente para o movimento de líquidos em tubos de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave e eluir<ol>
<li>Após a rotação durante a noite, salve o sobrenadante como a fração nonbinding. Então lave grânulos 3-5 x no tampão de diluição de IP.</li>
		<li>Prepare o tampão de eluição IP à temperatura ambiente, sem inibidores.</li>
		<li>Eluir complexos com tampão de eluição 50 µ l abalada em um vórtice a 67 ° C por 15 min. eluição de transferência para um novo tubo e repita com mais 50 µ l. Combine os dois para uma eluição total de 100 µ l. Nota: Se houver muito fundo deste procedimento de eluição, calor pode ser reduzido ou eliminado durante a incubação/tremendo. Isso geralmente reduz o rendimento de proteína do alvo, mas diminuir significativamente o plano de fundo.</li>
	</ol></li>
	<li>Inverter as referências cruzadas por aquecimento a 67 ° C para > 4h. Nota: Isto não é estritamente necessário para IPs co... mas pode ser útil.<ol>
<li>Para Co-IP, para garantir total dimerização entre os destinos turísticos, execute eluídos em um gel de SDS-page e sonda com anticorpos contra a HA marca ou marca de bandeira, conforme indicado, todos em 1: 1.000. Então vá para a etapa 8.</li>
		<li>Para ChIP-qPCR, para garantir a correta localização e segmentação de cada componente CRISPR-dCas9, limpe o produto de eluição em uma coluna e eluir em 10 µ l. executar em tempo real quantitativa cadeia da polimerase (qPCR) de DNA purificado. Primers utilizados nos dados apresentados estão disponíveis no quadro suplementar 1. Então vá para a etapa 8.</li>
	</ol></li>
</ol>8. RNA extração e PCR quantitativo
<ol><li>Para investigar as alterações induzidas pelo CLOuD9 na expressão gênica, primeiro, isolar e purificar o RNA total de pelotas de célula de controle e célula dimerized Pelotas.</li>
	<li>Fazer DNA complementar (cDNA) a partir do RNA purificado pela transcrição reversa17 e realizar análises de qPCR. Cartilhas estão disponíveis na tabela complementar 1.</li>
</ol>9. ensaio de captura de conformação de cromossomo
<ol><li>Para observar alterações na frequência dos contactos de loci genômicos induzidos pela CLOuD9, realizar captura de conformação de cromossomo (3c) ensaios de8.</li>
	<li>Quantificar os produtos de ligadura 3C em dois conjuntos de duplicatas para cada uma das três réplicas biológicas por PCR quantitativo em tempo real. Normalize as amostras aos sinais 3C do locus de tubulina. Cartilhas estão disponíveis na tabela complementar 1.</li>
</ol>

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<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

The Most passos críticos no loop de cromatina CLOuD9 são: 1) projetando ou usando o gRNAs correto, mídia 2) mudando diariamente em células transfectadas CLOuD9, incluindo a ABA ou DMSO, 3) manter o frescor da ABA e 4) executar avaliações de precisa e cuidadosos de conformação da cromatina.
Os limites de CLOuD9 principalmente residem na capacidade de criar guias para a região de destino de escolha. Guia de RNAs realizar a importante tarefa de localizar os componentes dCas9 para regiões de DNA alvo para ser dimerized e a eficácia dos guias baseiam-se em seu local de destino específico. Sem os componentes de gRNA adequada, o sistema não será capaz de formar reversivelmente CLOuD9 induzida por laços. Assim, projetando vários guias para cada região de interesse e espalhando os guias sobre uma região de 250-1000 bp, será assegurado pelo menos um guia bem sucedido. Guia local é também parte integrante resultados precisos. É importante evitar guias localizados em locais de ligação do fator da transcrição ou outras regiões críticas para evitar efeitos de fundo como acima ou para baixo de regulação da transcrição. Além disso, a localização precisa da construção de CLOuD9 ligeiramente pode afetar a transcrição do gene alvo. Isto enfatiza a importância de testar vários pares de guias para cada região de destino, para identificar o par mais robusto para fins experimentais. Além disso, em cada par de regiões-alvo, a construção da CSA deve ser alvejada com gRNAs por S. aureus, e construção de CSP deve ser alvejada com gRNAs por S. pyogenes para segmentação de especificidade.
Para garantir resultados precisos e dimerização correta, também é importante manter o frescor dos ambientes celulares seguindo a transdução das construções CLOuD9. Muda de mídia diária e a adição de dimerizer fresco (ou controle) garante que as construções complementares permanecerá na proximidade e preservar a conformação da cromatina alterado. Além disso, garantir a ABA é fresco e foi armazenado adequadamente de acordo com o protocolo do fabricante (aberto no prazo de 6 meses, ficou frio, protegidos da luz) é essencial para a obtenção de resultados autênticos.
Notavelmente, o dimerizer de ABA para CLOuD9 foi usado com as proteínas de dimerização ABI e PYL, ao invés do mais comumente utilizaram sistema FRB e FKBP. A necessidade de uma rapalog para o sistema FRB/FKBP teria limitado a aplicabilidade da CLOuD9, devido a toxicidade para as células cancerosas. O sistema alternativo de ABI/PYL contornado essa limitação, permitindo efetivamente CLOuD9 ser mais amplamente utilizáveis.
Coletivamente, nós desenvolvemos CLOuD9, uma tecnologia exclusiva e robusta que pode forçosamente mas reversível criar contatos entre loci genômicos de longo alcance do alvo. Através da indução de loops de cromatina, demonstramos também que CLOuD9 pode ser utilizada para modificar a expressão do gene no contexto celular adequado. A adaptabilidade da tecnologia permite o estudo irrestrito das interações entre qualquer dois loci genômicos, sem a necessidade de conhecimento prévio do loop regiões ou mecanismos de loop. Além disso, reversibilidade de demonstrada exclusiva do CLOuD9 mais permite análise dos mecanismos de loop em doença e desenvolvimento. Enquanto os efeitos no alvo de cromatina loop demonstraram claramente, ainda há a ser dados, oferecendo uma visão sobre os efeitos de loop fora do alvo e o subsequente impacto sobre os loops no alvo.
Nossos dados ilustra apenas alguns aplicativos desta ferramenta, mas implica a principal ideia subjacente que arranjo de cromatina é indicativo da expressão do gene. Nossa tecnologia pode ser usada para estudar e revelar as nuances da estrutura da cromatina na regulação gênica, melhorando assim a compreensão global do papel da cromatina dobradura na transcrição de genes. Uma melhor compreensão das sutilezas da dinâmica transcriptional pode liderar o caminho na investigação e tratamento de câncer, doenças hereditárias e doenças congénitas, na qual cromatina distinta assembleia, sem dúvida, altera gene expressão20, 21,22,23. Trabalhos posteriores, utilizando a tecnologia CLOuD9 acenderá ainda mais detalhes sobre a organização e a dinâmica dos domínios da cromatina e como eles conduzem a dobradura para sustentar a expressão do gene estável no desenvolvimento e na doença.

A relação entre cromatina dobrar no núcleo e a organização específica do genoma tem atraído interesse significativo nos últimos anos, como tem sido mostrado ser intimamente associada com a expressão de gene1,2. Enquanto a relação exacta entre a atividade do gene e modulação da estrutura da cromatina permanece obscura, tem sido a hipótese de que as interações entre contatos cromossômicos como resultado da organização da cromatina tridimensional dinâmica servem um Gene regulador de função3. Com efeito, tal efeito foi bem demonstrado no locus do gene da globina humana, onde a região de locus de controle (LCR) regula a atividade dos genes da globina de maneira específica desenvolvente, criando um loop de cromatina entre as duas regiões4. No entanto, nesta e outras regiões, não está claro se cromatina loop é uma causa ou a consequência de alterações na expressão gênica.
Até agora, os desafios em estudar este fenômeno permaneceram sem solução. Por exemplo, outras tentativas de indução de loops de cromatina envolveram modificando a sequência de DNA linear ou procedimentos complicados, que exigem uma abundância de conhecimento sobre elementos específicos que facilitam a loop5,6, 7,8. Além disso, enquanto trabalho anterior sugeriu que cromatina loops de expressão gênica de unidade em um contexto específico e restrito de7,8, o nível no qual cromatina loop afeta transcrição globalmente é incerto. Embora o interesse no impacto de loop de longo alcance na expressão gênica tem crescido continuamente nos últimos anos, perguntas sem resposta sobre como estabelecer e manter contatos de cromatina para alterar a atividade do gene persistirem.
A tecnologia que temos engenharia emprega a nuclease deficiente em cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) - CRISPR - associadas proteína 9 (dCas9), para permitir o direcionamento amplamente aplicável de qualquer loci genômicos9. Esta tecnologia elimina as questões complexas relacionadas com modificações da sequência de DNA linear e é acessível sem significativo conhecimento prévio dos componentes de loop particulares. Mais notavelmente, a ferramenta é universal e amplamente aplicável às alças de cromatina reconhecidas no desenvolvimento, bem como uma variedade de doenças, como câncer. O poder do CLOuD9 é demonstrado, reversível, alterando a estrutura de loops para efetivamente modular a expressão gênica.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; mídia</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Para cultura de células K562</td></tr><tr><td>Mídia DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, para cultura de células 293T</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene plasmid</td><td>#52961</td><td>Para desenvolvimento de plasmídeo CLOuD9</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12253</td><td>Para produção de lentivírus</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Plasmídeo Addgene</td> <td># 12259</td><td>Para produção de lentivírus</td></tr><tr><td>pMDLg / pRRE</td><td>Plasmídeo Addgene</td> <td># 12251</td><td>Para produção de lentivírus</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>Para produção de lentivírus</td></tr><tr><td>anticorpo anti-HA</td><td>Sinalização celular</td><td>3724</td><td>Para imunoprecipitação</td></tr><tr><td>anticorpo anti-bandeira</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Para imunoprecipitação</td></tr><tr><td>DNeasy Kit de Sangue e Tecidos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Para extração de DNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>Para extração de</td></tr><tr><td>RNA RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Para extração</td>de</tr><tr><td>RNA Sobrescrito VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>Para cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche 4707516001</td><td></td><td>para análise de qPCR</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>Para análise de qPCR</td></tr><tr><td>anticorpo anti-H3K4me3</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>Para ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>anti-RNA Pol-II</td><td>anticorpo Motivo ativo</td><td>61083</td><td>Para ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>Inibidor de protease livre de EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Para proteína extração</td></tr><tr><td>4-12% Tris Glycine gel</td><td>Biorad</td><td></td><td>Qualquer tamanho, para anticorpo anti-coelho HRP de western blot</td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td> Para anticorpo <td>HRP anti-rato western blot</td></tr><tr><td></td><td>Sinalização celular</td><td>7076S</td><td>Para dados de western blot</td></tr><tr><td>K562 e H3K293 ChIP-Seq</td><td>Codificar</td><td>ENCSR000AKU</td><td>Para análise ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 e H3K293 Dados ChIP-Seq</td><td>Codificar</td><td>ENCSR000APE</td><td>Para análise ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dados K562 e H3K293 ChIP-Seq</td><td>Codificar</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>Para análise ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dados K562 e H3K293 ChIP-Seq</td><td></td><td>GEO GSM1479215</td><td>Para análise ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A para imunoprecipitação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>Para imunoprecipitação</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G para Imunoprecipitação</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>10004D</td><td>para RNA da imunoprecipitação</td></tr><tr><td>limpo & Pesquisa R1015 de Concentrator-5</td><td>Zymo</td><td></td><td>para a purificação do RNA</td></tr><tr><td>Perfure o formaldeído de 16%</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>28908</td><td>para o</td></tr><tr><td>plasmídeo Addgene 48138 de PX458</td><td></td><td></td><td>Sugerido plasmídeo Cas9 ativo para a clonagem do gRNA, mas todo o plasmídeo Cas9 ativo fará</td></tr> o <tr>jogo <td>Qiagen</td><td>28104</td> da<td>purificação do PCR de QIAquick</td> para <td>a purificação do PCR</td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr><td>10X T4 Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr><td>2X Tampão de ligase rápida</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr>Quick<td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>Para RNAs guia de clonagem</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> <td>de lise de Farnham1% Tris-Cl pH 8,0, 1% SDS, 1% de solução aquosa inibidora de protease (não EDTA) e 1 mM de EDTA em água</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> RIPA modificado <td>1% NP40/Igepal, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 1 mM de EDTA e 1% de solução aquosa inibidora de protease (não EDTA) em PBS pH 7,8 ou 7,4</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de diluição IP <td>0,01% SDS, 1,1% Triton-X 100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, 0,1x inibidor de protease</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de lavagem <td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40 e 1% desoxicolato de sódio</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de inchaço <td>0,1 M Tris pH 7,5, 10 mM acetato de potássio, 15 mM acetato de magnésio, 1% NP-40</td></tr><tr><td>Tampão de diluição</td><td></td><td></td><td>0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris pH 8 e 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>Tampão de eluição IP</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

mediada por crispr reorganização da estrutura de loop de cromatina

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Estudos recentes demonstraram claramente que cromatina de longo alcance, tridimensional loop jogo de interações, um papel importante na regulação da expressão gênica, mas se o loop é responsável ou um resultado de alterações na expressão gênica é ainda desconhecido. Até recentemente, como cromatina loop afeta a regulação da atividade do gene e a função celular tem sido relativamente ambígua, e limitações de métodos existentes para manipular essas estruturas impediram a exploração profunda dessas interações. Para resolver esta incerteza, nós produzimos um método para a reorganização do laço cromatina seletivo e reversível usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9). O dinamismo do sistema CLOuD9 foi demonstrado pelo sucesso localização das construções CLOuD9 para loci genômicos para modular a conformação da cromatina local de destino. Importante, a capacidade de reverter o contato induzido e restaurar a conformação da cromatina endógena também foi confirmada. Modulação da expressão genética com este método estabelece a capacidade de regular a expressão gênica celular e ressalta o grande potencial para aplicações desta tecnologia na criação de loops de cromatina que afetam marcadamente gene estável de novo expressão nos contextos de desenvolvimento e de câncer.

Loop de cromatina desempenha um papel significativo na regulação gênica; no entanto, tem havido sem avanços tecnológicos que permitem a modificação seletiva e reversível de loops de cromatina. Aqui descrevemos um sistema poderoso para reorganização do laço da cromatina usar CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrado para seletivamente e reversivelmente modular a expressão gênica no alvo loci.

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas à expressão genética nos mostrando exatamente como a estrutura da cromatina impacta a expressão genética e como a organização da cromatina regula a dinâmica transcricional. Desenvolvemos essa tecnologia porque queríamos ser capazes de alterar controlavelmente a arquitetura cromossômica para permitir a criação de looping de cromatina de longo alcance. Ao mesmo tempo, ter a capacidade de reverter o contexto da cromatina para restaurar a estrutura cromossômica endógena.Este método foi projetado para facilitar o uso e ampla aplicabilidade. Aproveitamos um dimerizador não tóxico, bem como espécies ortogonais de dcas9, a fim de permitir que o sistema fosse usado de forma mais ampla. Desenvolvemos esse método porque queríamos ser capazes de responder à questão de longa data de frango e ovo sobre se a expressão genética gera arquitetura cromossômica ou se a estrutura do cromossomo leva a mudanças na expressão genética.O design das sequências de RNA do guia CRISPR e a manutenção das culturas celulares estão descritos no protocolo de texto. Mapas plasmídeos e os primers utilizados estão listados lá dentro. Comece a preparação plasmida misturando cinco microgramas do plasmídeo lentiviral CRISPR com três microlitres de BsmB1 três microliters de fosfatase alcalina seis microlitres de tampão de digestão de 10x e 0,6 microliters de 100 mililitros recém-preparados de DTT.Leve o volume total para 60 microlitadores de água dupla destilada e incubar a mistura a 37 graus celsius por 30 minutos para digerir e desfosforilar o plasmídeo. Em seguida, o gel purifica o plasmídeo digerido no plasmídeo de loop e água dupla destilada. Em seguida, prepare reações de renas para os pares de RNA guia.Combine um microliter de cada guia RNA em 100 micromolar com um microliter de 10x T4 tampão de ligadura 6,5 microliters de água dupla destilada e 0,5 microliters de T4 PNK para um volume total de reação de 10 microliters. Para ressar os pares de RNA guia às suas seqüências-alvo incubam as misturas a 37 graus celsius a 30 minutos seguidos de uma incubação a 95 graus celsius por 5 minutos e, em seguida, gradualmente reduzir a temperatura para 25 graus celsius, diminuindo-a em cinco graus celsius por minuto. Em seguida, diluir o guia enlatado RNAs em um a duzentos em água dupla destilada.Agora, prepare as duas reações de ligadura. Misture um microliter do plasmídeo digerido com 0,5 microlitres de um guia perivaneal diluído RNAse 2,5 microliters de tampão de ligadura 2x um microliter de água dupla destilada e 0,5 microliters de ligase. Incubar as reações à temperatura ambiente por 10 minutos para ligar as guias BsmB1 digerida plasmid.Em seguida, transforme o plasmídeo recém-ligado em três bactérias estáveis e amplie as bactérias usando qualquer método de preparação plasmídeo. Em uma placa de seis poços, por poço, semente 750, 000 2n3 Tcells em DMEM com 10%FBS e estreptococos de 1%caneta. Use um poço para cada construção e incubar as células por 24 horas.No dia seguinte, mude o DMEM médio para fresco com 10% de FBS. Logo após a troca do meio para cada poço de células banhadas prepare um tubo de mistura de produção de Lentivírus. Por cada reação, diluir 11 microliters de reagente de transfecção de base lipídica com 150 microliters do meio Opti-MEM para cada reação.Em seguida, em tubos separados preparar o DNA. Combine dois microgramas do plasmídeo vetorial lentiviral CLOud9 com dois microgramas dos outros componentes de embalagem lentiviral. Diluir esta mistura em 150 microliters do meio Opti-MEM.Em seguida, misture volumes iguais da mistura plasmida lentiviral diluída no reagente diluído de transfecção à base de lipídios e incubar as misturas por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, a cada poço de células adicione um tubo das misturas preparadas e continue a incubação. 48 horas depois, transfira a mídia de produção viral dos poços de placa para cônicos e gire-os a 300 g por cinco minutos.Em seguida, transfira o supernatante para tubos frescos para descartar os detritos pelleted. Agora, use imediatamente a mídia de produção viral para transduzi-la das células-alvo ou congelá-la a 80 graus celsius para uso futuro. Comece com a adição de 250 microliters de cada construção viral de interesse, que neste caso, é composta de plasmídeos CLOud9 complementares a um tubo cônico de 50 mililitros contendo 80.000 células.Em seguida, adicione polibreno suficiente para que esteja entre um e oito microgramas por mililitro em solução. Em seguida, ajuste o volume total em cada tubo para um mililitro usando mídia livre de antibióticos. Agora, para aumentar o contato entre as partículas do vírus e as células giram as células a 800 g por 30 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, suspenda novamente as células no supernante por pipetação. Em seguida, carregue a suspensão das células em placas de cultura e incuba-as por 24 horas. No dia seguinte, pegue as células.Centrifuá-los a 300 g por cinco minutos em temperatura ambiente e suspendê-los em meio normal. No dia seguinte, adicione puromicina e higromicina ao meio para selecionar células duplamente transduzidas. A concentração adequada de antibiótico deve ser determinada com antecedência para cada tipo de célula.Em seguida, incubar as células nos meios de seleção por pelo menos três dias antes de prosseguir com aplicações a jusante e continuar a manter as células e a mídia de seleção. Para escurecer as células selecionadas e transduzidas cloud9 adicionar um milimôe ABA ao prato de cultura. Para controles, adicione DMSO e mantenha as células com ABA ou DMSO durante a duração do experimento.Para reverter a dimerização, lave as células com PBS suficiente para cobrir a superfície da placa duas vezes. Depois disso, células culturais na mídia livre de ABA para mantê-las em um estado não hipnotizado. O uso adequado do sistema CLOud9 induz o contato reversível das construções complementares CSA e CSP CLOud9 através da adição ou remoção de ABA aos meios de cultura celular.As construções CSA e CSP são localizadas para regiões genômicas apropriadas usando o guia padrão CRISPR RNAse. A imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR quantitativo foi utilizada para garantir a localização precisa na segmentação de cada componente CLOud9. Além disso, a co-aglomeração com e sem ABA verificou a dimerização de CSA e CSP na presença do ligante, bem como a reversibilidade na ausência do ligante.Após a dimerização da ABA, maior contato entre a beta-globina e o LCR foi medido pela captura de confirmação do cromossomo. No entanto, isso não foi observado nos controles que continham apenas o CSA ou apenas a construção do CSP. A criação da interação LCR beta-globin não eliminou completamente o contato de globina LCR endógena.Só foi adicionado ao contato original. O aumento nos contatos LCR beta-globin foram observados através de 72 horas de dimerização, independentemente da região exata dentro do LCR alvo ou da região promotora de beta-globin. Por fim, a reversibilidade do sistema foi confirmada com a captura de confirmação do cromossomo após a remoção da ABA.Isso resultou na renovação completa da confirmação endógena. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de mudar a mídia e adicionar células transduzidas cloud9 recém-ensacidas todos os dias. Não se esqueça de trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso e todas as precauções usadas no BSL 2 devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Genetics

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