Name: Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a injeção dérmica profunda de Candida albicans para análise histológica de infecções cutâneas. Este método preserva a arquitetura da pele e permite localizar células imunes e patógenos em modelos de infecção fúngica.

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FG é suportado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fundação Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). IZ é suportado pelo NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical escola Milton encontrou, CCFA Senior Research Awards (412708), a Eleanor e Miles Shore 50º aniversário Fellowship Program e a Fundação Cariplo ( 2014-0859).

Todos os procedimentos foram aprovados sob o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) e operados sob a supervisão do departamento de recursos animais às crianças do Hospital (ARCH) no Hospital infantil de Boston, ou foram aprovados pelo italiano Ministério da saúde e executada sob o Animal conta Comissão institucional da Universidade de Milano-Bicocca.
1. preparação de c. albicans
<ol><li>Cultura C. albicans, estirpe CAF3-113, em tubos contendo meio rico (dextrose de peptona de extrato de levedura (YEPD), extrato de levedura 1% (p/v), 2% (p/v) de Bacto peptona, 2% (p/v) glicose) suplementado com uridina (50 mg/L) a 25 ° C. Nestas condições, c. albicans cresce como um fermento. Nota: Outras cepas de c. albicans podem ser usadas, tais como o clínico isolar c. albicans estirpe SC531413. Desde que nós recentemente demonstramos que o processo ulcerosa é induzido pela ativação do sistema imune inato14, teoricamente cada cepa de c. albicans que mantém seus componentes da parede celular e a estrutura, bem como a capacidade de origem hifas projeções, poderia ser usado.</li>
	<li>Monitore a cultura contando a concentração celular usando um analisador de contador de célula.</li>
	<li>Colha a cultura quando atinge uma concentração de cerca de 8 x 106 células/mL. Como alternativa, use um espectrofotômetro para medir o OD600. Nota: Normalmente, um valor de OD600 = 1 corresponde a uma concentração de levedura de 3 x 107 células/mL, mas recomenda-se titulação.</li>
	<li>Resuspenda a cultura em meio YEPD-uridina, usando o como agente tampão HEPES (50 mM, pH 7,5) e incubar a cultura a 37 ° C, para induzir a formação de hifas. Verifica a formação de hifas sob um microscópio com ampliação de 100 X. Formação das hifas é visível 5h após cultivo a 37 ° C; no entanto, use as células 16 h após incubação a 37 ° C, quando a porcentagem das hifas atinge quase 95% da cultura total.</li>
	<li>Para enriquecer ainda mais a preparação na concentração das hifas, alíquotas de centrífuga da cultura a 3.300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante e resuspenda o pellet em PBS estéril na concentração de 1 x 108 hifas/mL.</li>
</ol>2. fundo dérmica injeção
<ol><li>24 h antes o processo de infecção, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) e em seguida raspar o flanco dos ratos usando uma tosquiadeira elétrica. Nota: Após qualquer procedimento envolvendo anestesia, coloque os ratos sob uma lâmpada de aquecimento até que eles recuperaram eficientemente.</li>
	<li>Descanse os ratos por 24 h evitar qualquer inflamação devido ao processo de barbear.</li>
	<li>24 h após o procedimento de corte, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg).</li>
	<li>Verifica o reflexo de pata para garantir que os ratos são anestesiados profundamente. Avalie o reflexo da pata por beliscar-se firmemente a pata. Se a anestesia é alcançada, o animal não sente dor e não se move.</li>
	<li>Injete hifas de c. albicans no derma profunda utilizando uma seringa de insulina de 0,3 mL com agulha 30 x 8 mm em um volume final de 50 µ l/injeção, correspondente a 5 x 106 hifas/injeção.<ol>
<li>Puxe a pele do flanco raspada esticada usando dois dedos para injetar o volume diretamente no derma profunda. Introduza a agulha com um ângulo de 10-15° com o bisel da agulha voltado para cima.</li>
		<li>Com este ângulo, o patógeno será injetado com uma profundidade de aproximadamente 300-500 µm. Para garantir que a injeção é bem executada, verifique que o volume injetado forma um galo que é absorvido alguns min após a injeção. Nota: O galo formada após a injeção será de aproximadamente 1 cm2. Esta é a área que será removida em ponto de tempo designado, para análise histológica ou molecular.</li>
		<li>Para pontos de tempo de menos de 24 h (recomendado) marca a área da infecção com uma caneta, uma vez que a colisão que formou com a injeção persiste por alguns minutos, após o qual é absorvido. Para pontos de tempo de 24 h ou mais, esta etapa não é necessária, porque uma úlcera ou um cisto será claramente visível.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. recolha e preparação para a coloração histológica da amostra
<ol><li>Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais.</li>
	<li>Usando pinças cirúrgicas, puxe a pele na fronteira do local injetado, previamente marcada com a caneta marcador. Usando uma tesoura cirúrgica, impostos especiais de consumo do site infectado pelo corte da pele seguindo a linha marcada. Nota: Tenha cuidado para separar a pele do peritônio usando uma tesoura de ponta redonda.</li>
	<li>Mergulhe a pele em um molde base descartável cheio de temperatura de corte ideal (OCT) composta, com o lado interno da pele virada para cima. Congele a amostra em nitrogênio líquido até que o composto torna-se branco. Não deixe que o nitrogênio líquido cobrir a amostra antes de que é completamente congelado como isso iria danificar a amostra. Nota: cuidado! Durante a etapa de 3.3, use um protetor facial para proteção de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Se as amostras não forem utilizadas imediatamente para a preparação de slide, armazená-los rapidamente a-80 ° C. Nota: As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.</li>
</ol>4. preparação de Slides
<ol><li>Corte a amostra ao meio para preparar as fatias para histologia a partir do centro da amostra.</li>
	<li>Corte fatias grossas de 5 µm com um criostato. Nota: Para amostras de pele, a temperatura do criostato não deve ser superior a-25 ° C. Uma temperatura mais alta poderia causar uma fusão parcial de H-OCT e, portanto, as amostras não serão mantidas na posição correcta durante o procedimento de corte.</li>
	<li>Use corrediças do microscópio carregados positivamente para coletar as fatias.</li>
	<li>Se as fatias coletadas não forem utilizadas logo após o preparo, armazene-os em-20 ° C. Neste ponto, as fatias podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.</li>
</ol>5. hematoxilina & eosina coloração
<ol><li>Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill para 4 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Mancha que os slides por imersão em solução de eosina Y para 1 min. lavagem as lâminas em água corrente por 5 min. enxágue os slides usando água destilada antes de continuar o protocolo.</li>
	<li>Desidrata-se por imersão em serialmente, aumentando as concentrações das soluções de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Mergulhe os slides por 15 s em cada solução de etanol.</li>
	<li>Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.</li>
	<li>Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.</li>
	<li>Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio com uma ampliação de 40 X.</li>
</ol>6. ácido periódico-Schiff (PAS) coloração
<ol><li>Fixe as lâminas com 99.5% de acetona em temperatura ambiente por 1 min. lavar as lâminas em água corrente por 1 min.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em solução de ácido periódico (1 g/dL) por 5 min. Lave os slides em 3 mudanças de água destilada.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em do reagente de Schiff durante 15 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill, por 5 min. Lave as lâminas em água corrente por 30 s.</li>
	<li>Desidrate os slides por imersão em 3 alterações de 100% de etanol. Mergulhe os slides por 15 s de cada vez.</li>
	<li>Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.</li>
	<li>Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.</li>
	<li>Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio.</li>
</ol>7. recolha e preparação para a extração do RNA da amostra
<ol><li>Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais. Remova as amostras de pele, como no passo 3.2.</li>
	<li>Mergulhe as amostras em um tubo de snap-cap 2 mL com 1 mL do reagente para a extração de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C.</li>
	<li>Corte a amostra em pedaços de aproximadamente 0,2 cm2 usando pinça cirúrgica. Nota: cuidado! A maioria dos reagentes para isolamento de RNA são tóxicos e mutagênicos. Passos, 7.3 e 7.4 deve ser feito sob uma coifa.</li>
	<li>Esmagar a amostra com uma fresa de grânulo a uma velocidade de 20 oscilações/s para 20 min. como alternativa, um oleiro mecânico pode ser usado.</li>
	<li>Verificar a homogeneização eficaz das amostras, procurando a presença de pedaços intactos da pele. Repita este passo se as amostras não são completamente homogeneizadas.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 16.000 x g por 1 min. Mantenha os sobrenadantes para extração do RNA e descartar a pelota. Esta etapa é realizada para eliminar o cabelo e detritos que possam obstruir as colunas de extração.</li>
	<li>Prosseguir com a extração do RNA usando o RNA purificação colunas14.</li>
	<li>Use um espectrofotômetro para avaliar a concentração e purificação de RNA. Se extratos de RNA não são usados imediatamente para a preparação do cDNA, armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
<li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178391">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li>
<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
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<li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li>
<li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li>
<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
<li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/infectdis/Abstract/2010/07000/Candida_albicans_Skin_Abscess_in_a_Heart.6.aspx">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li>
<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós descrevemos um método de infecção de c. albicans para estudar o processo inflamatório que é iniciado após a entrada de fungosa no derma profunda.
Mesmo que a formação de abscesso da pele é um evento relativamente raro em cima de infecção de c. albicans 15, injeção do fungo diretamente no derma profunda permite não só o estudo da formação de abscesso orientada por fungos, mas também a análise de imune específica células que participam para cont...

O corpo humano é coberto com um número extremamente elevado de microorganismos. A superfície da pele é o habitat de quase 1 milhão de bactérias por centímetro quadrado1. Este número, no entanto, não reflete a completa variedade de microorganismos que coloniza a pele. Além de bactérias, o corpo humano é colonizado por muitas espécies de fungos, incluindo c. albicans, que é capaz de sobreviver tanto as mucosas e a pele de nível2.
Nos últimos anos, a percentagem de pessoas diagnosticadas com infecções fúngicas aumentou enormemente. Isto é principalmente devido ao maior número de pessoas imunodeprimidas, ou seja, pacientes HIV-positivos e pacientes que passaram por quimioterapia ou drogas imunossupressoras após transplante3. Em um estudo de vigilância realizado nos Estados Unidos, Wisplinghoff et al mostrou que 9,5% das infecções nosocomiais corrente sanguínea foram causadas por espécies de Candida 4. Devido à maior ocorrência de infecções fúngicas e especialmente devido à elevada percentagem de Candida espécies encontradas durante infecções na corrente sanguínea, compreender como este patógeno escapa do controle do sistema imunológico é extremamente importante.
C. albicans é um fungo dimórfico que cresce em diferentes formas morfológicas tais como levedura, vermiforme, pseudo-hifas e hifas consoante as condições ambientais5. Na sua forma hifal, c. albicans mostra sua mais alta capacidade de invasividade e tem a capacidade de penetrar o epitélio6.
C. albicans infecções têm sido estudadas usando várias abordagens experimentais. O modelo mais comum de infecção é a injeção intravenosa de c. albicans levedura7. No entanto, este modelo não leva em consideração todos os processos que acontecer antes que o fungo consegue espalhar-se para a corrente sanguínea. Outro modelo aproveita a capacidade de c. albicans para invadir o epitélio. Este método, também conhecido como, o papel da areia modelo8, foi desenvolvido por Gaspari et al . em 1998,9e consiste no uso de papel da areia para friccionar a pele, eliminando assim o estrato córneo antes de aplicar a c. albicans. Este procedimento permite que o fungo penetrar o epitélio, possibilitando assim a análise das habilidades invasivas deste patógeno. Finalmente, outros modelos de infecções para o gastrointestinal10 e respiratórias11 têm sido utilizados em diferentes estudos.
A formação de uma ferida (como no modelo de papel da areia) provoca a ativação de várias vias, incluindo o recrutamento de células imunes e ativação, a fim de promover a cura do processo12. Isto pode alterar ou mascarar a resposta imune suscitou especificamente contra o patógeno, conduzindo assim a confundir os resultados.
Aqui nós descrevemos um método de infecção da pele que evita a formação de ferida inicial e a indução de um ambiente inflamatório basal. Para manter a estrutura epitelial intacta, injetamos diretamente c. albicans em sua forma hifas no derma profunda. Mesmo que uma única injeção pode provocar inflamação suave, a quantidade de inflamação é limitada e restrito em comparação com a formação de uma ferida aberta, como no modelo de papel da areia. A abordagem que descrevemos aqui permite o estudo da resposta imune à infecção fúngica e disseminação, evitando o ambiente inflamatório pré-existente e excessivo causado por danos mecânicos.

<table><tbody><tr><td><reagentes>fortes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>quentes em 37 > Banho C antes da utilização</td></tr><tr><td>Laboratórios de histolinha</td><td>composta H-OCT</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxilyn</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Solução de eosina Y,</td><td>laboratórios de histolinha</td> alcoólica <td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>absoluto scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, meio de montagem</td><td>bio-óptico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>sistema de coloração PAS</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura Bacto</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose anidra para biologia molecular</td><td>Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Tóxico, corrosivo e mutagênico. Use todas as precauções necessárias</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>nitrogênio</td><td></td><td></td> líquido <td>Use proteção para os olhos</td></tr><tr><td><forte>Instrumento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Contagem de Contrapartículas</td><td>Centrífuga Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml Seringa de Insulina com agulha de 30G x 8mm&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgica</tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgica</tr><tr><td>Molde de base descartável</td><td>histo-line laboratories</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de biomicroscópio carregadas positivamente</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 24 x 50 mm</td><td>thermo scientific</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

profunda dérmica injeção como um modelo de candida albicans de infecção da pele para análise histológica

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

A pele é um órgão extremamente estendido do corpo e, devido a esta grande superfície, é continuamente exposto a microorganismos. Danos de pele podem facilmente levar a infecções na derme, que por sua vez, pode, resultar na disseminação de patógenos para a corrente sanguínea. Compreender como o sistema imunológico combate infecções na fase inicial e como o host pode eliminar os patógenos, é um passo importante para definir a base para futuras intervenções terapêuticas. Aqui descrevemos um modelo de infecção por Candida albicans que pode visualizar os processos que ocorrem durante uma infecção, incluindo quando o patógeno já passou a barreira epitelial, bem como a resposta imune provocada pela de c. albicans invasão. Usamos este modelo de infecção para realizar análises histológicas que mostram as células imunitárias que se infiltrar a pele, bem como a presença e a localização do patógeno. As amostras coletadas após a infecção pode ser processada para extração de RNA.

Através da injecção de patógeno diretamente no derma profunda, a morfologia estrutural do tecido permanece intacta (figura 1A).
A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células do sistema imunológico e sua localização no local da infecção. A maior ampliação mostrada na figura 1B revela que o abscesso é composto principalmente de leucócitos po...

Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

O objetivo geral deste procedimento é observar a ativação do sistema imunológico durante infecções de pele injetando Candida albicans para preservar a arquitetura da pele e a localização de células imunes e não imunes específicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo imunológico, como a natureza e a localização das células imunes recrutadas durante infecções de pele e os principais mediadores envolvidos. A principal vantagem desta técnica é a manutenção da arquitetura estrutural da pele após a injeção fúngica que nos permite compreender a localização de cada tipo de célula imune.Demonstrando parte do procedimento estará Giulia Stamerra, aluna de doutorado do laboratório da professora Marina Vai. Para começar, inocular C. Albicans cepa CAF3-1 em tubos contendo meio rico suplementado com 50 miligramas por litro de uridina e cultura a 25 graus Celsius. Sob essas condições, C. albicans cresce como uma levedura.Monitore a cultura usando um analisador de contador de células ou um espectrofotômetro para medir a concentração celular. Quando a cultura atingir oito vezes 10 elevado a sextas células por mililitro, colha a amostra. Use o meio YEPD-uridina com Hepes como agente tampão para ressuspender as células e incubá-las a 37 graus Celsius para induzir a formação de hifas.Após cinco horas em cultura, quando as hifas devem ser visíveis, sob um microscópio com ampliação de 100X, verifique a formação de hifas. Cultive as células por um total de 16 horas, momento em que 95% da cultura terá formado hifas. Para enriquecer ainda mais a concentração de hifas, centrifugue alíquotas da cultura a 3.300 vezes g por cinco minutos.Rejeitar o sobrenadante e utilizar PBS estéril para ressuspender o sedimento a uma concentração de uma vez 10 elevado à oitava hifa por mililitro. Depois de anestesiar um rato raspado de acordo com o protocolo de texto, verifique o reflexo da pata para garantir que o animal esteja profundamente sedado. Para injetar hifas de C. albicans na derme profunda, use dois dedos para esticar a pele do flanco raspado, em seguida, insira uma agulha de calibre 30 de oito milímetros presa a uma seringa de insulina de 0,3 mililitro em um ângulo de 10 a 15 graus, com o bisel da agulha voltado para cima, e injete um volume final de 50 microlitros correspondente a cinco vezes 10 elevado à sexta hifa.Se o ângulo da injeção for superior a 15 graus, o patógeno será injetado muito profundamente na derme, arriscando danos ao peritônio e, acima de tudo, perdendo a possibilidade de estudar infecções especificamente no nível da pele. Nesse ângulo, o patógeno será injetado a uma profundidade de aproximadamente 300 a 500 mícrons. Para garantir que a injeção seja bem executada, verifique se o volume injetado forma uma saliência que é absorvida após alguns minutos.Para momentos inferiores a 24 horas, use uma caneta marcadora para marcar a área de infecção, pois a protuberância formada com a injeção persiste por alguns minutos. Para pontos de tempo de 24 horas ou mais, esta etapa não é necessária, porque uma úlcera ou um cisto serão claramente visíveis. Após a eutanásia dos camundongos usando diretrizes institucionais, com pinças cirúrgicas puxe a pele na borda do local injetado previamente marcado com a caneta marcadora e, em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, excise o local infectado cortando a pele seguindo a linha marcada.Mergulhe a pele com o lado interno voltado para cima em um molde de base descartável preenchido com composto OCT. Congele a amostra em nitrogênio líquido até que o composto fique branco. Não deixe o nitrogênio líquido cobrir a amostra antes que ela esteja completamente congelada, pois isso danificará a amostra.Para preparar as lâminas, começando do centro da amostra, corte a amostra ao meio para preparar as fatias para histologia e, em seguida, usando um criostato, corte fatias de cinco mícrons de espessura. Use lâminas de microscópio carregadas positivamente para coletar as fatias. Para realizar a coloração de H & E, mergulhe as lâminas na hematoxilina de Gill por quatro minutos e, em seguida, lave as lâminas em água corrente da torneira por cinco minutos.Mergulhe as lâminas em solução de eosina-Y por um minuto, lave as lâminas em água corrente da torneira por cinco minutos e, em seguida, use água destilada para enxaguar as lâminas. Em seguida, desidratar as amostras mergulhando-as em uma série de etanol por 15 segundos cada. Para limpar as lâminas, transfira-as para um agente de limpeza histológico por pelo menos dois minutos e, em seguida, use meio de montagem e lamínulas para montar as amostras.Use um scanner de lâminas de microscópio com ampliação de 40X para obter imagens das lâminas. Execute a coloração com solução de ácido menstrual ou PAS usando acetona em temperatura ambiente para fixar as lâminas por um minuto e, em seguida, use água corrente da torneira para lavar as lâminas por um minuto. Mergulhe as lâminas em PAS por cinco minutos e, em seguida, use três trocas de água destilada para lavar as amostras.Em seguida, mergulhe as lâminas no reagente de Schiff por 15 minutos e, em seguida, use água corrente da torneira para lavá-las por cinco minutos. Mergulhe a amostra na hematoxilina de Gill por cinco minutos para corá-las e, em seguida, lave as lâminas em água corrente da torneira por 30 segundos. Desidratar as amostras por imersão em três trocas de etanol a 100% por 15 segundos cada, depois mergulhar as lâminas em um agente de limpeza histológico.Com o meio de montagem e as lamínulas, monte as amostras limpas e, em seguida, use um scanner de lâminas de microscópio para obter imagens das amostras. Depois de sacrificar os camundongos e remover amostras de pele, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, mergulhe as amostras em um tubo de dois mililitros com um mililitro de reagente para extração ácida de tiocianato de guanidínio fenol clorofórmio. Use uma pinça cirúrgica para cortar o tecido em pedaços de 0,2 centímetro quadrado.Com um moinho de esferas, esmague as amostras a 20 oscilações por segundo por 20 minutos. Se ainda houver pedaços de pele intactos, repita o esmagamento até que a amostra esteja completamente homogeneizada. Centrifugar as amostras a 16 000 vezes g durante um minuto.Guarde os sobrenadantes para extração de RNA e descarte o pellet. Esta etapa é realizada para eliminar cabelos e detritos que possam interferir no processo de extração. Depois de extrair o RNA com uma coluna de purificação, use um espectrofotômetro para medir a concentração e a pureza do RNA.A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células imunes e sua localização no local da infecção. Essa alta ampliação revela que o abscesso é composto principalmente de PMCs que contêm a disseminação do patógeno por seu confinamento ao local da infecção. As áreas circundantes do abscesso também são enriquecidas em PMCs.Nesta figura, a coloração PAS, que dá ao fungo uma cor roxo-magenta, mostra claramente que o patógeno está confinado dentro do abscesso formado pelo recrutamento de granulócitos. C. albicans é claramente visível em maior ampliação e parece estar cercado por células necróticas e imunes. No início do processo de infecção, o recrutamento de células imunes leva à formação do abscesso.48 a 72 horas após a infecção, a ruptura das estruturas da pele e a formação de uma cicatriz foram visualizadas devido à fase de cicatrização após a expulsão do patógeno. Como mostrado aqui, os camundongos do tipo selvagem exibem um processo ulcerativo que aumenta com o tempo. Após tratamentos específicos ou deficiências genéticas, a formação da úlcera pode ser reduzida e/ou revogada.Em alguns casos, em vez de uma úlcera, um cisto se formará como visto aqui. Após este procedimento de infecção, outros métodos, como extrações de proteínas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a ativação de vias intracelulares específicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar a injeção de C.Albicans na pele para estudar o envolvimento do sistema imunológico durante a infecção microbiana sem interromper a arquitetura do epitélio.Não se esqueça de que trabalhar com reagentes para extrações de RNA pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de uma capela de exaustão devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo de camundongo in vivo para estudar a formação de biofilme de Candida albicans no tecido subcutâneo. O experimento envolve a implantação de dispositivos infectados com Candida na região posterior do animal para o desenvolvimento de biofilme.

Candida albicans Formação de biofilme em um modelo de camundongo in vivo

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

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Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

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