Name: Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a injeção dérmica profunda de Candida albicans para análise histológica de infecções cutâneas. Este método preserva a arquitetura da pele e permite localizar células imunes e patógenos em modelos de infecção fúngica.

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FG é suportado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fundação Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). IZ é suportado pelo NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical escola Milton encontrou, CCFA Senior Research Awards (412708), a Eleanor e Miles Shore 50º aniversário Fellowship Program e a Fundação Cariplo ( 2014-0859).

Todos os procedimentos foram aprovados sob o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) e operados sob a supervisão do departamento de recursos animais às crianças do Hospital (ARCH) no Hospital infantil de Boston, ou foram aprovados pelo italiano Ministério da saúde e executada sob o Animal conta Comissão institucional da Universidade de Milano-Bicocca.
1. preparação de c. albicans
<ol><li>Cultura C. albicans, estirpe CAF3-113, em tubos contendo meio rico (dextrose de peptona de extrato de levedura (YEPD), extrato de levedura 1% (p/v), 2% (p/v) de Bacto peptona, 2% (p/v) glicose) suplementado com uridina (50 mg/L) a 25 ° C. Nestas condições, c. albicans cresce como um fermento. Nota: Outras cepas de c. albicans podem ser usadas, tais como o clínico isolar c. albicans estirpe SC531413. Desde que nós recentemente demonstramos que o processo ulcerosa é induzido pela ativação do sistema imune inato14, teoricamente cada cepa de c. albicans que mantém seus componentes da parede celular e a estrutura, bem como a capacidade de origem hifas projeções, poderia ser usado.</li>
	<li>Monitore a cultura contando a concentração celular usando um analisador de contador de célula.</li>
	<li>Colha a cultura quando atinge uma concentração de cerca de 8 x 106 células/mL. Como alternativa, use um espectrofotômetro para medir o OD600. Nota: Normalmente, um valor de OD600 = 1 corresponde a uma concentração de levedura de 3 x 107 células/mL, mas recomenda-se titulação.</li>
	<li>Resuspenda a cultura em meio YEPD-uridina, usando o como agente tampão HEPES (50 mM, pH 7,5) e incubar a cultura a 37 ° C, para induzir a formação de hifas. Verifica a formação de hifas sob um microscópio com ampliação de 100 X. Formação das hifas é visível 5h após cultivo a 37 ° C; no entanto, use as células 16 h após incubação a 37 ° C, quando a porcentagem das hifas atinge quase 95% da cultura total.</li>
	<li>Para enriquecer ainda mais a preparação na concentração das hifas, alíquotas de centrífuga da cultura a 3.300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante e resuspenda o pellet em PBS estéril na concentração de 1 x 108 hifas/mL.</li>
</ol>2. fundo dérmica injeção
<ol><li>24 h antes o processo de infecção, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) e em seguida raspar o flanco dos ratos usando uma tosquiadeira elétrica. Nota: Após qualquer procedimento envolvendo anestesia, coloque os ratos sob uma lâmpada de aquecimento até que eles recuperaram eficientemente.</li>
	<li>Descanse os ratos por 24 h evitar qualquer inflamação devido ao processo de barbear.</li>
	<li>24 h após o procedimento de corte, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg).</li>
	<li>Verifica o reflexo de pata para garantir que os ratos são anestesiados profundamente. Avalie o reflexo da pata por beliscar-se firmemente a pata. Se a anestesia é alcançada, o animal não sente dor e não se move.</li>
	<li>Injete hifas de c. albicans no derma profunda utilizando uma seringa de insulina de 0,3 mL com agulha 30 x 8 mm em um volume final de 50 µ l/injeção, correspondente a 5 x 106 hifas/injeção.<ol>
<li>Puxe a pele do flanco raspada esticada usando dois dedos para injetar o volume diretamente no derma profunda. Introduza a agulha com um ângulo de 10-15° com o bisel da agulha voltado para cima.</li>
		<li>Com este ângulo, o patógeno será injetado com uma profundidade de aproximadamente 300-500 µm. Para garantir que a injeção é bem executada, verifique que o volume injetado forma um galo que é absorvido alguns min após a injeção. Nota: O galo formada após a injeção será de aproximadamente 1 cm2. Esta é a área que será removida em ponto de tempo designado, para análise histológica ou molecular.</li>
		<li>Para pontos de tempo de menos de 24 h (recomendado) marca a área da infecção com uma caneta, uma vez que a colisão que formou com a injeção persiste por alguns minutos, após o qual é absorvido. Para pontos de tempo de 24 h ou mais, esta etapa não é necessária, porque uma úlcera ou um cisto será claramente visível.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. recolha e preparação para a coloração histológica da amostra
<ol><li>Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais.</li>
	<li>Usando pinças cirúrgicas, puxe a pele na fronteira do local injetado, previamente marcada com a caneta marcador. Usando uma tesoura cirúrgica, impostos especiais de consumo do site infectado pelo corte da pele seguindo a linha marcada. Nota: Tenha cuidado para separar a pele do peritônio usando uma tesoura de ponta redonda.</li>
	<li>Mergulhe a pele em um molde base descartável cheio de temperatura de corte ideal (OCT) composta, com o lado interno da pele virada para cima. Congele a amostra em nitrogênio líquido até que o composto torna-se branco. Não deixe que o nitrogênio líquido cobrir a amostra antes de que é completamente congelado como isso iria danificar a amostra. Nota: cuidado! Durante a etapa de 3.3, use um protetor facial para proteção de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Se as amostras não forem utilizadas imediatamente para a preparação de slide, armazená-los rapidamente a-80 ° C. Nota: As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.</li>
</ol>4. preparação de Slides
<ol><li>Corte a amostra ao meio para preparar as fatias para histologia a partir do centro da amostra.</li>
	<li>Corte fatias grossas de 5 µm com um criostato. Nota: Para amostras de pele, a temperatura do criostato não deve ser superior a-25 ° C. Uma temperatura mais alta poderia causar uma fusão parcial de H-OCT e, portanto, as amostras não serão mantidas na posição correcta durante o procedimento de corte.</li>
	<li>Use corrediças do microscópio carregados positivamente para coletar as fatias.</li>
	<li>Se as fatias coletadas não forem utilizadas logo após o preparo, armazene-os em-20 ° C. Neste ponto, as fatias podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.</li>
</ol>5. hematoxilina & eosina coloração
<ol><li>Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill para 4 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Mancha que os slides por imersão em solução de eosina Y para 1 min. lavagem as lâminas em água corrente por 5 min. enxágue os slides usando água destilada antes de continuar o protocolo.</li>
	<li>Desidrata-se por imersão em serialmente, aumentando as concentrações das soluções de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Mergulhe os slides por 15 s em cada solução de etanol.</li>
	<li>Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.</li>
	<li>Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.</li>
	<li>Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio com uma ampliação de 40 X.</li>
</ol>6. ácido periódico-Schiff (PAS) coloração
<ol><li>Fixe as lâminas com 99.5% de acetona em temperatura ambiente por 1 min. lavar as lâminas em água corrente por 1 min.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em solução de ácido periódico (1 g/dL) por 5 min. Lave os slides em 3 mudanças de água destilada.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em do reagente de Schiff durante 15 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill, por 5 min. Lave as lâminas em água corrente por 30 s.</li>
	<li>Desidrate os slides por imersão em 3 alterações de 100% de etanol. Mergulhe os slides por 15 s de cada vez.</li>
	<li>Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.</li>
	<li>Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.</li>
	<li>Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio.</li>
</ol>7. recolha e preparação para a extração do RNA da amostra
<ol><li>Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais. Remova as amostras de pele, como no passo 3.2.</li>
	<li>Mergulhe as amostras em um tubo de snap-cap 2 mL com 1 mL do reagente para a extração de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C.</li>
	<li>Corte a amostra em pedaços de aproximadamente 0,2 cm2 usando pinça cirúrgica. Nota: cuidado! A maioria dos reagentes para isolamento de RNA são tóxicos e mutagênicos. Passos, 7.3 e 7.4 deve ser feito sob uma coifa.</li>
	<li>Esmagar a amostra com uma fresa de grânulo a uma velocidade de 20 oscilações/s para 20 min. como alternativa, um oleiro mecânico pode ser usado.</li>
	<li>Verificar a homogeneização eficaz das amostras, procurando a presença de pedaços intactos da pele. Repita este passo se as amostras não são completamente homogeneizadas.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 16.000 x g por 1 min. Mantenha os sobrenadantes para extração do RNA e descartar a pelota. Esta etapa é realizada para eliminar o cabelo e detritos que possam obstruir as colunas de extração.</li>
	<li>Prosseguir com a extração do RNA usando o RNA purificação colunas14.</li>
	<li>Use um espectrofotômetro para avaliar a concentração e purificação de RNA. Se extratos de RNA não são usados imediatamente para a preparação do cDNA, armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
<li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178391">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li>
<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
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<li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li>
<li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li>
<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
<li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/infectdis/Abstract/2010/07000/Candida_albicans_Skin_Abscess_in_a_Heart.6.aspx">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li>
<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós descrevemos um método de infecção de c. albicans para estudar o processo inflamatório que é iniciado após a entrada de fungosa no derma profunda.
Mesmo que a formação de abscesso da pele é um evento relativamente raro em cima de infecção de c. albicans 15, injeção do fungo diretamente no derma profunda permite não só o estudo da formação de abscesso orientada por fungos, mas também a análise de imune específica células que participam para cont...

O corpo humano é coberto com um número extremamente elevado de microorganismos. A superfície da pele é o habitat de quase 1 milhão de bactérias por centímetro quadrado1. Este número, no entanto, não reflete a completa variedade de microorganismos que coloniza a pele. Além de bactérias, o corpo humano é colonizado por muitas espécies de fungos, incluindo c. albicans, que é capaz de sobreviver tanto as mucosas e a pele de nível2.
Nos últimos anos, a percentagem de pessoas diagnosticadas com infecções fúngicas aumentou enormemente. Isto é principalmente devido ao maior número de pessoas imunodeprimidas, ou seja, pacientes HIV-positivos e pacientes que passaram por quimioterapia ou drogas imunossupressoras após transplante3. Em um estudo de vigilância realizado nos Estados Unidos, Wisplinghoff et al mostrou que 9,5% das infecções nosocomiais corrente sanguínea foram causadas por espécies de Candida 4. Devido à maior ocorrência de infecções fúngicas e especialmente devido à elevada percentagem de Candida espécies encontradas durante infecções na corrente sanguínea, compreender como este patógeno escapa do controle do sistema imunológico é extremamente importante.
C. albicans é um fungo dimórfico que cresce em diferentes formas morfológicas tais como levedura, vermiforme, pseudo-hifas e hifas consoante as condições ambientais5. Na sua forma hifal, c. albicans mostra sua mais alta capacidade de invasividade e tem a capacidade de penetrar o epitélio6.
C. albicans infecções têm sido estudadas usando várias abordagens experimentais. O modelo mais comum de infecção é a injeção intravenosa de c. albicans levedura7. No entanto, este modelo não leva em consideração todos os processos que acontecer antes que o fungo consegue espalhar-se para a corrente sanguínea. Outro modelo aproveita a capacidade de c. albicans para invadir o epitélio. Este método, também conhecido como, o papel da areia modelo8, foi desenvolvido por Gaspari et al . em 1998,9e consiste no uso de papel da areia para friccionar a pele, eliminando assim o estrato córneo antes de aplicar a c. albicans. Este procedimento permite que o fungo penetrar o epitélio, possibilitando assim a análise das habilidades invasivas deste patógeno. Finalmente, outros modelos de infecções para o gastrointestinal10 e respiratórias11 têm sido utilizados em diferentes estudos.
A formação de uma ferida (como no modelo de papel da areia) provoca a ativação de várias vias, incluindo o recrutamento de células imunes e ativação, a fim de promover a cura do processo12. Isto pode alterar ou mascarar a resposta imune suscitou especificamente contra o patógeno, conduzindo assim a confundir os resultados.
Aqui nós descrevemos um método de infecção da pele que evita a formação de ferida inicial e a indução de um ambiente inflamatório basal. Para manter a estrutura epitelial intacta, injetamos diretamente c. albicans em sua forma hifas no derma profunda. Mesmo que uma única injeção pode provocar inflamação suave, a quantidade de inflamação é limitada e restrito em comparação com a formação de uma ferida aberta, como no modelo de papel da areia. A abordagem que descrevemos aqui permite o estudo da resposta imune à infecção fúngica e disseminação, evitando o ambiente inflamatório pré-existente e excessivo causado por danos mecânicos.

<table><tbody><tr><td><reagentes>fortes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>quentes em 37 > Banho C antes da utilização</td></tr><tr><td>Laboratórios de histolinha</td><td>composta H-OCT</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxilyn</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Solução de eosina Y,</td><td>laboratórios de histolinha</td> alcoólica <td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>absoluto scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, meio de montagem</td><td>bio-óptico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>sistema de coloração PAS</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura Bacto</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose anidra para biologia molecular</td><td>Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Tóxico, corrosivo e mutagênico. Use todas as precauções necessárias</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>nitrogênio</td><td></td><td></td> líquido <td>Use proteção para os olhos</td></tr><tr><td><forte>Instrumento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Contagem de Contrapartículas</td><td>Centrífuga Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml Seringa de Insulina com agulha de 30G x 8mm&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgica</tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgica</tr><tr><td>Molde de base descartável</td><td>histo-line laboratories</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de biomicroscópio carregadas positivamente</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 24 x 50 mm</td><td>thermo scientific</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

profunda dérmica injeção como um modelo de candida albicans de infecção da pele para análise histológica

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

A pele é um órgão extremamente estendido do corpo e, devido a esta grande superfície, é continuamente exposto a microorganismos. Danos de pele podem facilmente levar a infecções na derme, que por sua vez, pode, resultar na disseminação de patógenos para a corrente sanguínea. Compreender como o sistema imunológico combate infecções na fase inicial e como o host pode eliminar os patógenos, é um passo importante para definir a base para futuras intervenções terapêuticas. Aqui descrevemos um modelo de infecção por Candida albicans que pode visualizar os processos que ocorrem durante uma infecção, incluindo quando o patógeno já passou a barreira epitelial, bem como a resposta imune provocada pela de c. albicans invasão. Usamos este modelo de infecção para realizar análises histológicas que mostram as células imunitárias que se infiltrar a pele, bem como a presença e a localização do patógeno. As amostras coletadas após a infecção pode ser processada para extração de RNA.

Através da injecção de patógeno diretamente no derma profunda, a morfologia estrutural do tecido permanece intacta (figura 1A).
A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células do sistema imunológico e sua localização no local da infecção. A maior ampliação mostrada na figura 1B revela que o abscesso é composto principalmente de leucócitos po...

Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

O objetivo geral deste procedimento é observar a ativação do sistema imunológico durante infecções de pele injetando Candida albicans para preservar a arquitetura da pele e a localização de células imunes e não imunes específicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo imunológico, como a natureza e a localização das células imunes recrutadas durante infecções de pele e os principais mediadores envolvidos. A principal vantagem desta técnica é a manutenção da arquitetura estrutural da pele após a injeção fúngica que nos permite compreender a localização de cada tipo de célula imune.Demonstrando parte do procedimento estará Giulia Stamerra, aluna de doutorado do laboratório da professora Marina Vai. Para começar, inocular C. Albicans cepa CAF3-1 em tubos contendo meio rico suplementado com 50 miligramas por litro de uridina e cultura a 25 graus Celsius. Sob essas condições, C. albicans cresce como uma levedura.Monitore a cultura usando um analisador de contador de células ou um espectrofotômetro para medir a concentração celular. Quando a cultura atingir oito vezes 10 elevado a sextas células por mililitro, colha a amostra. Use o meio YEPD-uridina com Hepes com

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo de camundongo in vivo para estudar a formação de biofilme de Candida albicans no tecido subcutâneo. O experimento envolve a implantação de dispositivos infectados com Candida na região posterior do animal para o desenvolvimento de biofilme.

Candida albicans Formação de biofilme em um modelo de camundongo in vivo

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Apresentamos um procedimento experimental de desenvolvimento de biofilme de Candida albicans em um modelo subcutâneo de camundongo. Os biofilmes fúngicos foram quantificados pela determinação do número de unidades formadoras de colônias e por uma imagem de bioluminescência não invasiva, onde a quantidade de luz produzida corresponde ao número de células viáveis.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Galleria mellonella serve como um modelo de invertebrados para candidíase disseminada. Aqui, detalhamos a infecção do protocolo e fornecer dados de apoio para a eficácia do modelo.

O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

O objetivo deste protocolo é visualizar candida albicans forma celular e localização no trato gastrointestinal de mamíferos.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Este manuscrito descreve um método para triagem de bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamanho moderado para fenótipos de morfogênese durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero usando microscopia confocal não invasiva.

Uso de imagens in vivo para rastrear fenótipos de morfogênese em cepas mutantes de Candida albicans durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero

A infecção articular periprotética (PJI) causada por patógenos perigosos é comum na ortopedia clínica. Os modelos animais existentes não conseguem simular com precisão a situação real da PJI. Aqui, estabelecemos um modelo de camundongo PJI associado ao biofilme de Candida albicans para pesquisar e desenvolver novas terapêuticas para PJI.

Modelo de Infecção por Candida albicans em Articulação Periprotética em Camundongos

Estabelecemos um modelo murino de infecção relacionada ao cateter (IRC) associada a C.albicans, no qual o biofilme se forma no cateter, e a interação entre C.albicans e hospedeiro correlaciona-se bem com a IRC clínica. Esse modelo ajuda a selecionar terapias para IRC associada ao biofilme de C.albicans , estabelecendo uma base para a transformação clínica.

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Este protocolo descreve a aplicação da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) em um modelo murino de candidíase oral. A aPDT foi realizada usando uma mistura solúvel em água de curcuminóides e luz LED azul.

Terapia fotodinâmica antimicrobiana mediada por curcuminóides em um modelo murino de candidíase oral

O presente protocolo descreve um modelo de camundongo que emprega implante dorsal subcutâneo para investigar infecções associadas ao implante, permitindo uma investigação abrangente dos mecanismos fisiopatológicos e apoiando o desenvolvimento de critérios diagnósticos com estratégias terapêuticas direcionadas.

Modelo animal de infecções associadas a implantes em camundongos

Aprenda a injeção dérmica profunda de Candida albicans para análise histológica de infecções cutâneas. Este método preserva a arquitetura da pele e permite localizar células imunes e patógenos em modelos de infecção fúngica.

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

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