Name: Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e espectrometria de massa MALDI-TOF. Este método específico e rápido analisa patches de reparo menores que 9 nucleotídeos.

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Agradecemos a facilidade do núcleo integrado NCFPB genômica funcional (Taipei, Taiwan) e o laboratório de farmacogenômica NRPB (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação da Fundação de saúde de Taiwan (L-Il) e o Ministério da ciência e tecnologia, Taipei, Taiwan, ROC [mais 105-2320-B-002-047] para Hu Wei-Yao, [mais 105-2628-B-002-051-MY3] para Su Kang-Yi e [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] por Liang-na Lin.

1. modelo de primer/preparação
<ol><li>Projetar primers/modelos com um conteúdo de G + C equilibrado entre 40% e 60% como em uma sequência ou projeto da primeira demão PCR. Use as primeiras demão de 18 a 21 nt para um recozimento apropriado e melhores sinais de MS.</li>
	<li>O modelo de design, definindo a 50 ° C como o mínimo de temperatura para a região de frente e verso pelo menos 7 de fusão nt de 5'-saliência para separar os sinais entre o primer e o modelo. Nota: por exemplo, para o substrato P21/T28 na tabela 1, o primer 21-nt é emparelhado com um modelo 28-nt. Opção: o uso de alternativos ácidos nucleicos tais como resistente a nuclease phosphorothioate títulos para substituir a última 4 ligações fosfodiéster na extremidade 3' do modelo pode impedir a interferência possível, uma degradação de extremidade 3' não-específica dos modelos ( por exemplo,, T28S4 na tabela 1), embora isto irá adicionar algum custo para a preparação de modelo.</li>
	<li>Usar o padrão oligonucleotides demolhados, sem qualquer outra purificação é satisfatória para este estudo. Uso do oligonucleotide cartilhas/modelos em uma concentração de 100 pmol / µ l em H2O como um estoque e armazená-lo a-20 ° C. Verificar a qualidade e a pureza das primeiras demão e modelos executando os oligonucleotides na MALDI-TOF MS (passos 4-7) para garantir o único pico sinais e um bom sinal à relação de ruído.</li>
	<li>Determine o relativo intensities de MALDI-TOF MS sinal (passo 7) dos primers molares iguais das sequências relevantes na reação para calibração e concentração normalização (Figura 2).</li>
</ol>2. revisão de reações
Nota: O protocolo e a mesma condição de reação correcção aplica-se a uma reparação do ADN da-eu, G-eu, C-I e T-eu.
<ol><li>Usando uma incompatibilidade de T-G de substrato P21/T28 para a revisão na tabela 1 , por exemplo, diluir a primeira demão P21 e modelo T28 para 12,5 pmol / µ l com H2O; Então transferi 12 µ l da primeira demão diluída e 12 µ l do modelo diluído para um tubo esterilizado microcentrifuga 1,5 mL. Nota: A quantidade de mistura modelo/primer é suficiente para 2 reações; proporcionalmente, aumentar o volume dos reagentes conformemente para várias reações.</li>
	<li>Feche o tubo firmemente. -Incubar durante 30 min num coberto-65 ° C banho de água, seguido por 30 min em um banho de água de 37 ° C e finalmente no gelo para garantir uma adequada recozimento.</li>
	<li>Para um tubo esterilizado microcentrifuga 1,5 mL, adicionar 8 µ l de primer e mistura de modelo (50 pmol), 2 µ l de 10 x revisão amortecedor da reação, 4 µ l de mistura de 4 ddNTPs (2 mM de cada 4 dNTPs) e H2O até 18 µ l. Agite o tubo para misturar. Nota: 1 x revisão reação buffer que contém o 50mm NaCl, 10 mM MgCl2, ditiotreitol 1 mM e 10 mM Tris-HCl (pH 7.9 a 25 ° C). Consulte a Tabela de materiais da fonte comercial de 10 x revisão amortecedor da reação. A concentração final de cada ddNTP na reação é de 0,1 mM.</li>
	<li>Diluir a DNA polimerase na gelada 1x tampão de reação para a concentração desejada de revisão [por exemplo, para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, adicionar 4 µ l de 1 x revisão amortecedor da reação e 1 µ l de polymerase de Klenow 5-U de uma fonte comercial (tabela de Materials)]. Armazene a enzima diluída no gelo em todos os momentos. Nota: A quantidade de diluídos DNA polimerase é suficiente para 2 reações; proporcionalmente, aumentar o volume das enzimas em conformidade para várias reações. Um volume de 2,0 µ l, contendo 2,0 unidades de Klenow polimerase, pode revisar mais de metade dos 50 pmol de T-G terminal incompatíveis P21/T28 em 5 min.</li>
	<li>Escaldar o tubo de microcentrifugadora com a mistura de substrato da etapa 2.3 para a temperatura de reação desejada (por exemplo, tipicamente 37 ° C para Klenow polimerase e 25 ° C para T4 DNA polimerase). Em seguida, transferir 2,0 µ l da DNA polimerase diluída de passo 2.4 para a mistura de substrato escaldadas e agite o tubo para misturar seu conteúdo.</li>
	<li>Centrifuga os tubos com enzima e substrato durante alguns segundos a 3.200 x g, à temperatura ambiente a girar para baixo os componentes das reações. Transferi imediatamente a reação a um bloco de aquecimento ou um banho de água à temperatura de incubação desejado como na etapa 2.5.</li>
	<li>
Terminar a reação
	<ol>
<li>Adicionar um volume igual de fenol tamponado, misture-o vortexing por alguns segundos e centrifugá-lo numa microcentrifuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 5 min.<ol>
<li>Transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrifugadora limpa e adicionar um volume igual de clorofórmio, misture-o pela utilização do Vortex durante alguns segundos e centrifugar em uma microcentrífuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 3 min. transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga limpos e em cubate que a 95 ° C por 5 min; Coloque-o no gelo. Cuidado: Fenol e clorofórmio são produtos químicos perigosos. Eliminação de resíduos e manuseio deve seguir regulamentos institucionais.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Como alternativa, use um ácido extinguendo o protocolo. Para isso, adicionar 2 µ l de 1 M HCl para parar a reação no gelo por 6 min, em seguida, adicione 0,64 µ l de 1m dietanolamina (DEA) para neutralizar o pH da mistura de reação e incube-a 95 ° C por 5 min; Coloque-o no gelo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. resina além de eliminar a contaminação de sal
<ol><li>Usando a colher de resina da dessalinização comercial kit (veja a Tabela de materiais), levar a resina suficiente para cobrir as ondulações da placa covinha 384-dimple, 6 mg de resina.</li>
	<li>Distribuir a resina entre todas as ondulações uniformemente (6 mg/covinha) por raspagem na parte superior da placa. Recuperar qualquer excesso de resina e substituí-lo na garrafa.</li>
	<li>Transferi os produtos da reacção final do passo 2.7 dos tubos de microcentrífuga para um placa de 384. Dispense a 16 µ l de H2O para diluir os produtos de reação final em cada poço e, em seguida, selar a placa e centrifugar para remover quaisquer bolhas.</li>
	<li>Remover o selo, vire a placa com os produtos de reação de cabeça para baixo para cobrir o prato cheio de resina covinha 384.</li>
	<li>Vire o sanduíche de placas bem-para-dimple e cuidadosamente, deixe a resina cair a placa de 384 (certifique-se de que a placa de 384 é rente o pino de metal no prato cheio de resina covinha).</li>
	<li>Retire a placa de covinha no topo, selar a placa 384 contendo as misturas dos produtos da reação e da resina, brevemente, centrifugue-a 3.200 x g para remover quaisquer bolhas e colocá-lo em rotacao pelo menos 15 min à temperatura ambiente para dessalinização de seu conteúdo.</li>
	<li>Após a limpeza da resina, centrifugar a placa de 384 a 3.200 x g por 5 min compactar a resina no fundo dos poços.</li>
</ol>4. transferir produtos de reacção a um Chip Matrix
<ol><li>Definir as placas de amostra no compartimento nanolitros (nanodispenser, consulte a Tabela de materiais).</li>
	<li>Colocar o chip matrix (consulte a Tabela de materiais) e a placa de 384 de seção 3.7 na bandeja do correspondente.</li>
	<li>Operar o nanodispenser para identificar os produtos de reação para o chip; Pressione o botão executar na tela de toque da nanodispenser para começar.</li>
	<li>Veja se a imagem capturada automatizada das manchas de amostra contendo informações de saturação na tela para garantir o volume global de manchado no chip está em torno de 5-10 nL. Repita a amostra manchar se o volume for insuficiente.</li>
</ol>5. configurar as informações de ensaio sobre a espectrometria de massa
<ol><li>Prepare um arquivo no formato. xls que contém as informações de sinal antecipado de importação. Por exemplo, use a configuração de "P21_T28.xls" (tabela 2) para a reação de correcção de P21/T28 nas etapas 2, 3 e 4.</li>
	<li>Criar e definir um novo ensaio no programa aplicativo (consulte a Tabela de materiais) pelo botão direito do mouse o Grupo de ensaio de importação no formato de Designer e selecione o arquivo. xls (por exemplo, "P21_T28.xls" da etapa 5.1).</li>
	<li>Estabelecer o alvo ensaio placa através da árvore de opção do Cliente: Projeto: placa no lado esquerdo da tela, clicando com o topo da árvore e dando-lhe um nome de arquivo (por exemplo, "CTT20171201" representa o código de ensaio e data).</li>
	<li>Selecione o tipo de placa 384 e prima Okey; uma placa em branco será exibida.</li>
	<li>Selecione o ensaio apropriado (por exemplo, P21_T28) no lado esquerdo da tela.</li>
	<li>Atribua o ensaio selecionado (por exemplo, P21_T28) para cada amostra, visto a posição da amostra no chip destacando o poço e botão direito do mouse para selecionar Adicionar Plex.</li>
	<li>Prepare uma lista de trabalho de todos os testes do chip no formato. xlsx com nenhum cabeçalho (por exemplo, 1201.xlsx do quadro 3). Importe o trabalho lista através da opção de Adicionar novo projeto de amostra .</li>
	<li>Atribuir o teste na lista de trabalho (por exemplo, de 1201.xlsx) para cada posição do ensaio do P21_T28 e escolha clicando.</li>
</ol>6. MALDI-TOF MS operação
<ol><li>Link o espectrômetro de massa para o chip usando o programa de aplicação (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Selecione a configuração padrão no lado direito da tela.</li>
	<li>Preencha o nome de ensaio da etapa 5.3 (por exemplo, CTT20171201), ID do chip no canto do chip e salvar as configurações.</li>
	<li>Iniciar o programa de controle de MS (ver a Tabela de materiais).</li>
	<li>Pressione o botão de In/Out e retire a placa de escoteiro. Coloque o chip manchado da etapa 4.4 na chapa de escoteiro e pressione o botão de In/Out para o chip manchado entrar o espectrômetro de massa.</li>
	<li>Clique no botão de aquisição do programa aplicativo (consulte a Tabela de materiais) para iniciar a espectrometria de massa e aquisição de dados.</li>
</ol>7. análise de dados
<ol><li>Abra o programa para a análise de dados (consulte a Tabela de materiais).</li>
	<li>Procurar na árvore do banco de dados no canto superior esquerdo e selecione o ID da microplaqueta da etapa 6.3. Abra o arquivo de dados no lado direito da tela.</li>
	<li>Clique no ícone de espectro para exibir o espectro de massa. Para cortar um intervalo específico de m/z, botão direito do mouse para selecionar a Caixa de diálogo personalização e na nova janela, clique no eixo x e definir o limite superior e inferior desejado e pressione Okey para mostrar o intervalo especificado do espectro.</li>
	<li>Exporte o espectro para registos clicando em Exportar. Nota: Usando uma escala de unidade de largura/1.200 1.600 é um tamanho razoável para inspeção de dados em uma tela de computador.<ol>
<li>Selecione o tipo de arquivo JPEG, clique no destino, selecione Browse disco (por exemplo, disco flash e:), digite o nome do arquivo (por exemplo, 1201-1. jpg) e, em seguida, clique em Exportar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para quantificação de dados, use o cursor e clique sobre o pico para mostrar a altura do pico no canto superior esquerdo.<ol>
<li>Alternativamente, imprima um arquivo JPEG exportado e medir a altura do pico com uma régua manualmente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Loeb, L. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fidelity of DNA synthesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).</li>
<li>Kornberg, A., Baker, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).</li>
<li>Carroll, S. S., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr00105a011">Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm.</a> Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).</li>
<li>Echols, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1883202">Fidelity Mechanisms in DNA Replication.</a> Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+and+chemical+mechanism+of+high-fidelity+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).</li>
<li>Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+Multiple+roles+maintain+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).</li>
<li>Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+active+site+switching+catalyzed+by+the+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).</li>
<li>Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+neighboring+bases+on+DNA+polymerase+insertion+and+proofreading+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).</li>
<li>Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+mispair+extension+kinetics.+Comparison+of+DNA+polymerase+%CE%B1+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).</li>
<li>Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10373598">An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases.</a> Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).</li>
<li>Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-aminopurine+fluorescence+to+measure+incorporation+of+incorrect+nucleotides+by+wild+type+and+mutant+bacteriophage+T4+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).</li>
<li>Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+analog+2-aminopurine+as+a+spectroscopic+probe+of+nucleotide+incorporation+by+the+Klenow+fragment+of+Escherichia+coli+polymerase+I+and+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).</li>
<li>Leung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+G-quadruplex-based+luminescent+switch-on+probe+for+the+detection+of+polymerase+3%27-5%27+proofreading+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity.</a> Methods. 64 (3), 224-228 (2013).</li>
<li>Song, C., Zhang, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+DNA+polymerase+fidelity+by+singly+labeled+smart+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genotyping+of+PCR+products+with+MassTag-labeled+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+MALDI-TOF+based+methodology+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Research. 31 (24), e155(2003).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V-mediated+deoxyinosine+excision+repair+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro.</a> DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excision+of+3%27+penultimate+errors+by+DNA+polymerase+I+and+its+role+in+endonuclease+V-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair.</a> DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).</li>
<li>Kucera, R. B., Nichols, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent DNA Polymerases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Weiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+deoxyinosine+from+the+Escherichia+coli+chromosome+as+studied+by+oligonucleotide+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation.</a> DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).</li>
<li>Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V%3A+an+unusual+enzyme+for+repair+of+DNA+deamination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+proofreading+and+DNA+repair+assay%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay.</a> DNA Repair. 61, 63-75 (2018).</li>
<li>Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+DNA%3A+recognition+of+aberrant+DNA+termini+by+the+Klenow+fragment+of+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).</li>
<li>Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+I+proofreading+exonuclease+activity+is+required+for+endonuclease+V+repair+pathway+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo.</a> DNA Repair. 64, 59-67 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este estudo descreveu um ensaio revisão passo a passo da atividade analisado pelo instrumento comercial escolhido (consulte a Tabela de materiais) usando MALDI-TOF MS. As principais vantagens incluem que o primer e o modelo são etiqueta grátis e fácil de executar, permitindo maior flexibilidade na criação de experiências. Uma fluxo-Cal completa de processamento de 30 testes de revisão levaria 4 h, incluindo 3 h para executar manualmente as correcção reações e sua limpeza, enquanto as análises MALDI-TOF M...

As funções de revisão de polimerases de DNA durante a replicação do DNA são essenciais para garantir a alta fidelidade da informação genética que precisa ser transferido para progênie1,2,3,4, 5,6,7. Ser capaz de avaliar as contribuições da polimerase revisão se exonucleases gostaria de esclarecer os mecanismos para salvaguardar a estabilidade genética.
Radioisótopo rotulagem e ensaios baseados em gel em combinação com análises densitométricos do autoradiograms ou do fósforo de imagem8,9,10 tem sido tradicionalmente usados para detectar a atividade de revisão de DNA polimerases. Embora funcional, estes ensaios são trabalhoso, caro e não passível de formatos de alta produtividade. Além disso, radioisótopos sofrem de problemas de segurança, incluindo a eliminação de resíduos. Alternativamente, as atividades de revisão foram analisadas por técnicas fluorométrica. Por exemplo, 2-aminopurina (2-AP) pode ser incorporado em produtos de extensão durante a polimerase em vitro revisão ensaios para produzir um sinal fluorescente11,12. Infelizmente, essas abordagens sofrem uma baixa especificidade, desde 2-AP pode emparelhar com timina e citosina. Abordagens mais recentes incluem uma sensível baseados em G-quadruplex luminescente ligar sonda para um polymerase 3' - 5' exonuclease ensaio13 , bem como uma sonda fluorescente-etiquetadas individualmente para um polymerase revisão ensaio que supera alguns do desvantagens acima de14. Entusiasmo para esses métodos fluorométrica é diminuído devido à necessidade da rotulagem específica de substratos de DNA.
Em contraste, uma MALDI-TOF MS para análise de DNA tem sido utilizada no ensaio de PinPoint, onde as reações de extensão da primeira demão com 4 ddNTPs sem rótulo podem ser usadas para identificar polimorfismos em um determinado locus15,16,17 e foi adotado extensamente em aplicações clínicas para a detecção de mutações e câncer diagnostica18. Usando estes princípios básicos, nós criamos um rótulo livre ensaio para a determinação em vitro da DNA polimerase revisão atividade explorando a alta resolução, alta especificidade e potencial de alto rendimento de MALDI-TOF MS. usando o E. Coli DNA polimerase eu Klenow fragmento como uma enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como substratos podem tomar um "instantâneo" de revisão de produtos depois de um único nucleotídeo extensão através de MALDI-TOF MS (Figura 1).
Da mesma forma, este método também foi desenvolvido para um ensaio de reparo de DNA onde cartilhas contendo 3' penúltimo dI lesões são submetidas a uma pol que reparar o ensaio que imita endo V roubada reparação intermediários. Enquanto não são totalmente conhecidas, o caminho de reparação endo V é o único sistema de reparação conhecido para empregar o pol eu revisão atividade do exonuclease para excisão de lesão19,20. Usando o MALDI-TOF MS, mostramos um remendo de reparação claramente definidos onde dI pode ser extirpado por pol eu quando ocorrem no último 2 nt do primer antes de adicionar o nucleotídeo complementado correto.
Para o estudo de revisão e reparação do ADN, este método é mais rápido e menos trabalhoso do que métodos anteriores e fornece informações adicionais para o mecanismo e função.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>Missão Biotech (Taiwan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oligonucleotídeos modificados com fosforotioato</td> Integrated <td>DNA Technologies (Taiwan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase I, Fragmento Grande (Klenow) New</td><td>England Biolabs, MA</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs, miliampère</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2,1 (10X)</td><td>New England Biolabs, miliampère</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddATP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4001</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddGTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4002</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddTTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4004</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddCTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4005</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dGTP, dCTP, conjunto dTTP</td><td>Clubio, Taiwan</td><td>CB-R0315</td><td></td></tr><tr><td>Matriz SpectroCHIP</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>Agena Bioscience, software CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typer 4.0</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ferramentas de resina limpa</td><td>Agena Bioscience, CA#</td><td>08040</td><td></td></tr></tbody></table>

revisão e ensaio de reparo de dna usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa maldi-tof

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

A manutenção do genoma e sua replicação fiel é de suma importância para a conservação de informação genética. Para avaliar a replicação de alta fidelidade, nós desenvolvemos um simples não-rotulados e análise de espectrometria (MS) para um estudo de revisão de massa não-rádio-isótopos método usando uma ionização de dessorção do laser assistida por matriz com tempo-de-voo (MALDI-TOF). Aqui, uma DNA polimerase [por exemplo, o fragmento de Klenow (KF) de Escherichia coli DNA polimerase eu (pol eu) neste estudo] na presença de todos os quatro dideoxyribonucleotide trifosfatos é usado para processar um duplex de primeira demão-modelo incompatíveis. O primer incompatível é então estendido/revisado e submetido a MALDI-TOF MS. Os produtos distinguem-se pela variação da massa do primer até variações de nucleotídeo único. Importante, uma revisão pode também ser determinado para incompatibilidades única internas, embora a diferentes eficiências. Localizado em 2-4-nucleotídeos (nt) da extremidade 3' de incompatibilidades foram eficientemente revisado por pol eu, e um descompasso em 5 nt o terminus da primeira demão de mostrou apenas uma correção parcial. Nenhuma revisão ocorreu para incompatibilidades internas localizadas em 6-9 nt da extremidade 3' da primeira demão. Esse método também pode ser aplicado a ensaios de reparo do DNA (por exemplo, avaliar uma reparação da base-lesão de substratos para o caminho de reparação endo V). Cartilhas contendo 3' lesões penúltima deoxyinosine (dI) podem ser corrigidas por pol eu. Com efeito, penúltimo T-eu, G-eu e A-eu substratos tinham sua última 2 dI-contendo nucleotídeos extirpado por pol eu antes de adicionar um ddN correta 5'-monofosfato (ddNMP) enquanto o penúltimo C-eu incompatibilidades foram toleradas por pol eu, permitindo que o primer ser estendido sem reparação, demonstrando que a sensibilidade e a resolução do MS do ensaio para medir a reparação do DNA.

Primers e modelos:
Usando o procedimento apresentado aqui, igual modelos molar do oligonucleotide sintéticas e primers de sequências relevantes obtidas de fontes comerciais foram verificadas por sua pureza e qualidade (Figura 3A; note que os sinais combinados a massa designada e o baixo fundo) bem como para a relação entre o pico de intensidade e a massa do analito (<strong class="x...

Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fidelidade dos polímeros de DNA e reparo do DNA, como métodos de revisão e análise e na definição do adesivo de reparo do DNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito específica, simples, rápida e fácil de executar. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades por causa de ainda estarem na replicação do DNA e o campo de reparo pode não estar familiarizado com a instrumentação de espectrometria de massa e a interpretação dos dados.Acho que o mais importante é que a demonstração visual é muito crítica, pois podemos mostrar como nossa espectrometria de massa desenvolvida comercialmente para aplicações clínicas, como mutação e deputação, pode ser convenientemente adaptada para revisão de DNA e estudo de reparo. Demonstrando o procedimento estarão os alunos de pós-graduação de Rong-Syuan e Kuei-Ching do meu laboratório. Comece este procedimento com a preparação do primer e do modelo, conforme descrito no protocolo de texto.Como exemplo, use uma incompatibilidade TG do substrato P21 com T28 para a revisão. Diluir o primer P21 e o molde T28 a 12,5 picomoles por microlitro com água. Em seguida,

proofreading-dna-repair-assay-using-single-nucleotide-extension-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados ​​nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados ​​tumorais ou com proteínas purificadas.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Aqui, o estudo de diferentes abordagens de reconhecimento de lesões de DNA por meio de imagens AFM de molécula única é demonstrado com o sistema de reparo por excisão de nucleotídeos como exemplo. Os procedimentos de preparações de amostras de DNA e proteína e detalhes experimentais, bem como analíticos para os experimentos de AFM são descritos.

Microscopia de Força Atômica Investigações do Reconhecimento de Lesão de DNA no Reparo de Excisão de Nucleótidos

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Um método não-rótulo, não-isotópico não-radio-isotópico para avaliar a atividade uracil-DNA glicosylase foi desenvolvido usando espectrometria de massa MALDI-TOF para análise direta do produto que contém local apurinic/apyrimidinic. O ensaio provou ser bastante simples, específico, rápido e fácil de usar para a medição de glicosilase de DNA.

Ensaio de Glicosylase Uracil-DNA por Desorção a Laser Assistida por Matriz/Análise de Espectrometria de Massa

Aqui descrevemos duas modificações do ensaio de fibra de DNA para investigar lacunas de DNA de uma única vez na replicação do DNA após indução da lesão. O ensaio de fibra S1 permite a detecção de lacunas pós-replicativas usando a endonuclease S1 específica do SSDNA, enquanto o ensaio de preenchimento de lacunas permite visualização e quantificação do reparo de lacunas.

Detecção de acumulação e reparo de lacunas pós-replicativas em células humanas usando o ensaio de fibra de DNA

MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.

Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF

Este protocolo descreve um ensaio extracromossômico de junção final não homóloga (NHEJ) e um ensaio de recombinação homóloga (HR) para quantificar a eficiência de NHEJ e HR em células HEK-293T.

Análise da Eficiência de Junção de Extremidade Não Homóloga e Recombinação Homóloga em Células HEK-293T Usando Sistemas Reporter Baseados em GFP

Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aprenda a realizar ensaios de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e espectrometria de massa MALDI-TOF. Este método específico e rápido analisa patches de reparo menores que 9 nucleotídeos.

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

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