Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fidelidade dos polímeros de DNA e reparo do DNA, como métodos de revisão e análise e na definição do adesivo de reparo do DNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito específica, simples, rápida e fácil de executar. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades por causa de ainda estarem na replicação do DNA e o campo de reparo pode não estar familiarizado com a instrumentação de espectrometria de massa e a interpretação dos dados.

Acho que o mais importante é que a demonstração visual é muito crítica, pois podemos mostrar como nossa espectrometria de massa desenvolvida comercialmente para aplicações clínicas, como mutação e deputação, pode ser convenientemente adaptada para revisão de DNA e estudo de reparo. Demonstrando o procedimento estarão os alunos de pós-graduação de Rong-Syuan e Kuei-Ching do meu laboratório. Comece este procedimento com a preparação do primer e do modelo, conforme descrito no protocolo de texto.

Como exemplo, use uma incompatibilidade TG do substrato P21 com T28 para a revisão. Diluir o primer P21 e o molde T28 a 12,5 picomoles por microlitro com água. Em seguida, transfira 12 microlitros do primer diluído e 12 microlitros do molde diluído para um tubo de microcentrífuga esterilizado de 1,5 mililitro.

Depois de fechar bem o tubo, incube o tubo por 30 minutos em banho-maria coberto a 65 graus Celsius. Em seguida, incube por 30 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. E, finalmente, coloque o tubo no gelo para garantir um recozimento adequado.

Para um tubo de microcentrífuga esterilizado de 1,5 mililitro, adicione oito microlitros de primer e mistura de molde, dois microlitros de tampão de reação de revisão 10x, quatro microlitros de mistura 4ddNTPs e água até 18 microlitros. Agite o tubo para misturar. Dilua a DNA polimerase em tampão de reação de revisão 1x gelado até a concentração desejada.

Armazene a enzima diluída no gelo o tempo todo. Pré-aqueça o tubo de microcentrífuga com a mistura de substrato até a temperatura de reação desejada. Em seguida, transfira dois microlitros da DNA polimerase diluída para a mistura de substrato pré-aquecida e sacuda o tubo para misturar seu conteúdo.

Centrifugue os tubos com enzima e substrato por alguns segundos a 3200 vezes a gravidade à temperatura ambiente para girar os componentes das reações. Transfira imediatamente a reação para um bloco de aquecimento ou banho-maria na temperatura de incubação desejada. Para encerrar a reação, adicione um volume igual de fenol tamponado e misture a reação por vórtice por alguns segundos.

Em seguida, centrifugue a reação em uma microcentrífuga a 3200 vezes a gravidade à temperatura ambiente por cinco minutos. Transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga limpo e adicionar um volume igual de clorofórmio. Depois de misturá-lo por vórtice por alguns segundos, centrifugue a amostra em uma microcentrífuga a 3200 vezes a gravidade à temperatura ambiente por três minutos.

Transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga limpo. Depois de incubar a reação a 95 graus Celsius por cinco minutos, coloque o tubo no gelo. Em seguida, execute a adição de resina para eliminar a contaminação por sal em uma placa de 384 poços, conforme detalhado no protocolo de texto.

Coloque as placas de amostra no dispensador de nanolitros. Coloque o chip de matriz e a placa de 384 poços preparada na bandeja correspondente. Opere o nano-dispensador para identificar os produtos de reação ao chip.

Pressione o botão de execução na tela sensível ao toque do nano-dispensador para iniciar. Verifique a imagem capturada automaticamente dos pontos de amostra contendo informações de saturação na tela para garantir que o volume geral manchado no chip seja de cerca de cinco a 10 nanolitros. Repita a amostragem da amostra se o volume for insuficiente.

Prepare um arquivo em formato Excel contendo as informações de sinal previstas para importação. Crie e defina um novo ensaio no programa aplicativo clicando com o botão direito do mouse em importar grupo de ensaios no formato designer e selecione o arquivo Excel. Estabeleça a placa de ensaio alvo por meio da árvore de opções da placa de projeto do cliente no lado esquerdo da tela, clicando com o botão direito do mouse na parte superior da árvore e dando a ela um nome de arquivo.

Selecione o tipo de placa de 384 poços e pressione OK. Uma placa em branco aparecerá. Selecione o ensaio apropriado no lado esquerdo da tela. Atribua o ensaio selecionado para cada posição de amostra manchada no chip, destacando o poço e clicando com o botão direito do mouse para selecionar adicionar plex.

Em seguida, prepare uma lista de trabalho de todos os testes no chip em formato Excel sem cabeçalho. Importe a lista de trabalho por meio da opção adicionar novo projeto de amostra. Atribua o teste e a lista de trabalho a cada posição do ensaio P21T28 e escolha clicando com o botão direito do mouse.

Conecte o espectrômetro de massa ao chip usando o programa aplicativo. Selecione a configuração padrão no lado direito da tela. Preencha o nome do ensaio e o ID do chip no canto do chip.

Salve as configurações e inicie o programa de controle MS. Pressione o botão de entrada/saída e retire a placa de reconhecimento. Coloque o chip manchado na placa de reconhecimento e pressione o botão de entrada/saída para que o chip manchado entre no espectrômetro de massa.

Clique no botão adquirir do programa aplicativo para iniciar a espectrometria de massa e adquirir os dados. Abra o programa para a análise de dados. Navegue pela árvore do banco de dados no canto superior esquerdo e selecione o ID do chip.Abra o arquivo de dados no lado direito da tela.

Clique no ícone de espectro para exibir o espectro de massa. Para cortar uma faixa específica de massa sobre carga, clique com o botão direito do mouse para selecionar a caixa de diálogo de personalização. Na nova janela, clique no eixo x e defina o limite superior e inferior desejado e pressione OK para mostrar a faixa especificada do espectro.

Exporte o espectro para manutenção de registros clicando com o botão direito do mouse em exportar. Selecione o tipo de arquivo JPEG, clique em destino, selecione procurar disco, digite o nome do arquivo e clique em exportar. Para quantificação de dados, use o cursor e clique no pico para mostrar a altura do pico no canto superior esquerdo.

No MALDI-TOF MS existe uma relação inversa entre a intensidade de pico na massa de oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos de 17 a 24 nucleotídeos foram submetidos a uma análise de MS. As intensidades relativas do sinal foram calculadas e podem ser usadas para quantificação do ensaio de revisão ou reparo.

Tanto os sinais de modelo quanto os de primer podem ser encontrados no espectro de massas. Devido às diferenças de tamanho, os sinais dos modelos e seus produtos de degradação parcial não específicos foram bem separados dos primers e produtos revisados incompatíveis. Aqui é mostrada uma revisão de um terminal de três primos TG.At cinco minutos, o produto corrigido foi de 23% versus 17% para o produto de excisão.

Essa diferença continuou a aumentar para 69% versus 14% em 20 minutos. Observe a alta resolução do MS separando claramente os sinais sub-reta e do produto com uma diferença de sobrecarga de massa de apenas 32. Também facilmente resolvíveis foram duas formas de produtos de excisão para uma revisão de TG final de caneta.

O intermediário de excisão de um nucleotídeo e dois produtos de excisão de nucleotídeos. A revisão de incompatibilidades internas mostrou uma tendência clara na eficiência da revisão. Como evidenciado por uma grande fala de produto revisada, o aumento da eficiência foi observado quando as subretas tinham incompatibilidades no último, penúltimo, terceiro e quarto nucleotídeos das três extremidades primárias, em comparação com incompatibilidades em outras posições.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outras aplicações, como triagem de heapiter de revisão polimérica, podem ser realizadas para descobrir e inventar novos medicamentos para pesquisa farmacêutica. Essa técnica também abre caminho para pesquisadores no campo da replicação e reparo do DNA obterem mais informações sobre a medicina do gnomo e sua replicação fiel para todos os organismos vivos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a revisão de DNA e o ensaio de reparo usando a análise de espectrometria de massa MADI-TOF. Não se esqueça de que trabalhar com esfenoclorofórmio pode ser perigoso e as precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser tomadas durante a realização do procedimento. O protocolo alternativo no texto pode ser considerado um substituto mais seguro.